INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

“PRODUCCIÓN DE BIOSURFACTANTES POR

MICROORGANISMOS AISLADOS DE SITIOS
EXTREMOS Y CONTAMINADOS CON
HIDROCARBUROS”

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

INGENIERO AMBIENTAL

PRESENTA:
XOCHITL MARTÍNEZ GARCÍA

DIRECTOR EXTERNO (IMP): DRA. TERESA ROLDÁN CARRILLO

DIRECTOR INTERNO (UPIBI): M. en C.GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ

México, D. F. 2011
El presente trabajo se realizó en el Instituto Mexicano del Petróleo, en el Laboratorio
de Biotecnología, dentro del Proyecto D.00417-IMP, bajo la dirección de la Dra. Teresa
Guadalupe Roldán Carrillo.
AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Mexicano del Petróleo (IMP) por permitirme el uso de sus instalaciones,
equipos y materiales para el desarrollo del presente trabajo.

Al grupo de trabajo del Área de Biotecnología del IMP, liderado por la Dra. Patricia
Olguín Lora y donde colaboran la Dra. Gladis Castorena Cortes y M. en C. Icoquih
Zapata Peñasco; por su apoyo durante mi estancia en el instituto.

Y especialmente a la Dra. Teresa Roldán Carrillo por su dirección, apoyo, confianza,

enseñanza y por motivarme hasta el final.

A la M. en C Gloria López Jiménez por todas las aportaciones hechas al trabajo.

DEDICATORIA

A mis padres Alicia y Abel, mi inspiración, por enseñarme a caminar por la vida con
cada uno de sus consejos.

Por los sacrificios y desvelos………..por su apoyo incondicional…………..por creer en

mí……..por entregar su vida para hacer de la mía algo mejor.

Gracias….Siempre los llevare en mi corazón.

Con profundo amor.

Xoch.
 I. INDICE

Página

Resumen 1

1. Introducción 4

1.1 Procesos microbianos utilizados en la industria de petróleo 5

1.2 Surfactantes 6

1.2.1 Fenómenos de superficie 7

1.2.2 Tensión superficial 8

1.2.3 Tensión interfacial 9

1.3 Biosurfactantes 9

1.3.1 Microorganismos productores de biosurfactantes 9

1.3.2 Clasificación de los biosurfactantes. 10

1.3.2.1 Biosurfactantes de bajo peso molecular 10

A) Glicolípidos 10

 Lípidos de trehalosa 10

 Soforolípidos 11

 Ramnolípidos 11

B) Ácidos grasos 13

C) Fosfolípidos 13

D) Antibióticos tensoactivos 13

 Polimixinas 13

 Surfactina 14

1.3.2.2 Biosurfactantes de alto peso molecular 14

A) Emulsan 14

B) Alasan 15

C) Biodispersan 15

D) Complejo Polisacáridos-lípidos 15

i
1.3.3 Ventajas de los biosurfactantes sobre los surfactantes químicos 15

1.3.4 Síntesis de los biosurfactantes 17

1.3.5 Producción de biosurfactantes por fermentación 17

1.3.5.1 Producción asociada al crecimiento 18

1.3.5.2 Producción bajo condiciones limitadas del crecimiento 18

1.3.5.3 Producción en reposo o por inmovilización de células 18

1.3.5.4 Producción con precursores 19

1.3.6 Mecanismos y factores que regulan la producción de 19

biosurfactantes

1.3.6.1 Fuente de carbono 19

1.3.6.2 Fuente de nitrógeno 20

1.3.6.3 Limitación o presencia de cationes polivalentes 20

1.3.6.4 Factores ambientales y condiciones de crecimiento 20

1.3.7 Producción de biosurfactantes en condiciones extremas 21

1.3.8 Aplicaciones de los biosurfactantes 23

1.3.8.1 Recuperación mejorada de hidrocarburos vía microbiana (MEOR) 23

1.3.8.2 Degradación de hidrocarburos en suelo y agua 25

1.3.8.3 Biodegradación de pesticidas, compuestos clorados y metales 27

pesados

1.3.8.4 Otras aplicaciones 28

2. Antecedentes 29

3. Justificación 31

4. Hipótesis 32

5. Objetivos 32

5.1 General 32

5.2 Particulares 32

6. Diagrama experimental 33

7. Metodología 34

ii
7.1 Selección de microorganismos 34

7.2 Reactivación de las cepas 34

7.2.1 Caracterización macroscópica y microscópica de los 35

microorganismos seleccionados

7.3 Evaluación de la producción de biosurfactantes en diferentes 35

medios de cultivo

7.4 Preparación del sobrenadante para la evaluación de la producción 36

de biosurfactantes

7.5 Métodos analíticos para evaluar la producción de biosurfactantes 36

7.5.1 Prueba de dispersión 36

7.5.2 Índice de emulsificación (E24) 37

7.5.3 Tensión superficial 38

7.6 Preparación del inoculo 39

7.7 Evaluación del efecto de la temperatura sobre las cinéticas de 39

crecimiento y producción de biosurfactantes en caldo nutritivo

7.8 Cinéticas en caldo nutritivo a la temperatura de mejor respuesta en 39

la producción del biosurfactante

7.8.1 Análisis de los resultados de producción de CO2 40

7.9 Diseño experimental para la evaluación de la producción de 40

biosurfactantes

7.9.1 Análisis estadístico del diseño experimental 42

7.10 Producción de biosurfactante a nivel reactor 42

7.10.1 Preparación del cultivo en lote 42

7.11 Evaluación del efecto del biosurfactante sobre un aceite pesado 44

7.12 Extracción parcial del biosurfactante 45

7.13 Identificación de los microorganismos productores de 45

biosurfactantes

7.14 Conservación de las cepas 45

7.14.1 Conservación en medio sólido 45

iii
7.14.2 Conservación en medio liquido 45

8. Resultados y discusión 46

8.1 Caracterización macroscópica y microscópica de los 46

microorganismos seleccionados

8.2 Evaluación de la producción de biosurfactantes en diferentes 48

medios de cultivo

8.3 Evaluación del efecto de la temperatura sobre el crecimiento y 51

producción de biosurfactantes en caldo nutritivo

8.3.1 Cinéticas en caldo nutritivo a la temperatura de mejor respuesta en 58

la producción del biosurfactante

8.4 Optimización de la producción de biosurfactantes 67

8.5.1 Análisis estadístico del diseño experimental 70

8.5.2 Efecto del nitrógeno sobre la producción de biosurfactante 78

8.5.3 Efecto del hierro y magnesio en la producción de biosurfactante 79

8.6 Producción de biosurfactante a nivel reactor 80

8.7 Efecto del biosurfactante sobre un aceite pesado 85

8.8 Identificación de los microorganismos productores de 87

biosurfactantes

9. Conclusiones 89

10. Perspectivas 91

11. Referencias 92

12. Anexos 103

iv
 II. INDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1.1 Aplicaciones de los biosurfactantes en la industria del petróleo. 6

Tabla 1.2 Aplicaciones de los biosurfactantes en diferentes industrias. 28

Tabla 2.1 Biosurfactantes estudiados en la literatura. 30

Tabla 7.1 Microorganismos utilizados en este proyecto. 34

Tabla 7.2 Medios de cultivo, con diferente fuente de carbono. 35

Tabla 7.3 Estructura del diseño experimental tipo Box-Behnken de factorial 41

33.

Tabla 7.4 Niveles de las relaciones de carbono con diferentes nutrientes. 41

Tabla 8.1 Caracterización macroscópica de las cepas IMP-X, IMP-R e IMP- 46

T.

Tabla 8.2 Evaluación de la producción de biosurfactantes en diferentes 49

medios de cultivo con las tres cepas seleccionadas.

Tabla 8.3 Velocidades de crecimiento a diferentes temperaturas. 52

Tabla 8.4 Evaluación de la dispersión de aceite con la cepa IMP-R. 53

Tabla 8.5 Evaluación de la dispersión de aceite con la cepa IMP-T. 54

Tabla 8.6 Evaluación de la dispersión de aceite con la cepa IMP-X. 55

Tabla 8.7 Evaluación de la dispersión de aceite con B. subtilis. 57

Tabla 8.8 Parámetros cinéticos de la producción de CO2 obtenidos con el 67

modelo de Gompertz de las cepas IMP-R, IMP-T e IMP-X.

Tabla 8.9 Resultados del diseño experimental Box-Behnken para la cepa 68

IMP-X (30°C).

Tabla 8.10 Resultados del diseño experimental Box-Behnken para la cepa 69

IMP-R (60°C).

Tabla 8.11 Evaluación de la cinética de crecimiento y producción de 84

biosurfactantes.

Tabla 8.12 Producto crudo obtenido después del proceso de extracción por 84
liofilización.

v
Tabla 8.13 Desplazamiento de hidrocarburo. 86

Tabla A3.1 Análisis de Varianza (ANOVA) del modelo de superficie de la 107

cepa IMP-X.

Tabla A3.2 Regresión múltiple y el grado de significancia de los 108

componentes para el modelo cuadrático de la cepa IMP-X.

Tabla A3.3 Análisis de Varianza (ANOVA) del modelo de superficie de la 109

cepa IMP-R.

Tabla A3.4. Regresión múltiple y el grado de significancia de los 110

componentes para el modelo cuadrático de la cepa IMP-R.

Tabla A4.1 Resultados de las pruebas bioquímicas con el sistema API 20E 111
para la cepa IMP-X.

vi
 III. INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1.1 Molécula de dodecil éster sulfato de sódio. 7

Figura 1.2 Fuerzas moleculares de la tensión superficial e interfacial. 8

Figura1.1 Estructura de la trehalosa producida por Rhodococcus erythropolis 11

y Arthrobacter.

Figura 1.2 Estructura de la soforosa producida por Torulopsis bombicola. 11

Figura 1.3 Ejemplos de ramnolípidos, a) disacárido con un solo ácido β- 12

hidroxidecanoico producido por P. aeruginosa SB1, b) monosacárido
producido por P.aeruginosa KY4025, c) disacárido producido por
P.aeruginosa DSM2874.

Figura 1.4 Estructura de la Poliximina B. 13

Figura 1.5Estructura de la surfactina producida por B. subtilis. 14

Figura 7.1 Prueba de dispersión. 37

Figura 7.2 Índice de emulsificación E24. 37

Figura 7.3Tensiómetro DuNouy modelo 70545. 38

Figura 7.4 Cultivo en lote de los tratamientos del diseño experimental. 43

Figura 7.5 Prueba para la evaluación del efecto del biosurfactante sobre un 44
crudo.

Figura 8.1 Observación microscópica de las cepas seleccionadas (tinción 47

Gram 100x). a) IMP-X, coco-bacilos Gram negativo; b) IMP-R, bacilos largos
Gram negativo; c) IMP-T, bacilos Gram negativo; d) B. subtillis, bacilos Gram
positivo.

Figura 8.2 Cinéticas de crecimiento de la cepa IMP-R a 40, 50, 60 y 70°C; 52

en caldo nutritivo con agitación de 115 rpm.

Figura 8.3 Cinéticas de crecimiento de la cepa IMP-T a 40, 50, 60 70°C; en 54

caldo nutritivo con agitación de 115 rpm.

Figura 8.4 Cinéticas de crecimiento de la cepa IMP-X a 30, 40 y 50°C; en 55

caldo nutritivo con agitación de 115 rpm.

vii
Figura 8.5 Cinética de crecimiento de B.subtilis a 30, 40 y 50°C; en caldo 56
nutritivo con agitación de 115 rpm.

Figura 8.6 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-R a 60°C, con caldo 60

nutritivo. a) Cuantificación de proteína; b) producción de CO2.

Figura 8.7 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-R a 60°C con caldo 61

nutritivo, y evaluación de: a) Tensión superficial; b) diámetro de dispersión.

Figura 8.8 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-T a 60°C con caldo 62

nutritivo. a) Cuantificación de la proteína; b) producción de CO2.

Figura 8.9 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-T a 60°C con caldo 63

nutritivo, y evaluación de: a) Tensión superficial; b) diámetro de dispersión.

Figura 8.10 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-X a 30°C, con caldo 64

nutritivo. a) Cuantificación de la proteína; b) producción de CO2.

Figura 8.11 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-X a 30°C con caldo 65

nutritivo, y evaluación de: a) Tensión superficial; b) diámetro de dispersión.

Figura 8.12 Reducción de la tensión superficial observada vs. reducción de 71

la tensión superficial predicha del diseño experimental de la cepa IMP-X.

Figura 8.13 Grafica de Pareto muestra los efectos de las variables C/N, C/Fe 72
y C/Mg sobre la tensión superficial del modelo correspondiente a la cepa
IMP-X.

Figura 8.14 Superficie de respuesta de la cepa IMP-X (30º C) durante el 73

diseño experimental, cuando la relación C/Mg es de 30 (media).

Figura 8.15 Superficie de respuesta de la cepa IMP-X (30º C) durante el 74

diseño experimental, cuando la relación C/N es de 5 (baja).

Figura 8.16 Reducción de la tensión superficial observada vs. reducción de 75

la tensión superficial predicha del diseño experimental de la cepa IMP-R.

Figura 8.17 Distribución de Pareto muestra los efectos de las variables C/N, 76
C/Fe y C/Mg sobre la tensión superficial del modelo correspondiente a la
cepa IMP-R.

Figura 8.18 Superficie de respuesta de la cepa IMP-R (60º C) durante el 77

diseño experimental, cuando la relación C/Mg es de 50 (alta).

Figura 8.19 Superficie de respuesta de la cepa IMP-R (60º C) durante el 78

diseño experimental, cuando la relación C/Fe es de 42000 (alta).

viii
Figura 8.20 Crecimiento de la cepa IMP-X durante su cultivo en reactor y 81
evaluación de la producción de biosurfactante mediante la medición tensión
superficial.

Figura 8.21 Crecimiento de la cepa IMP-R durante su cultivo en reactor y 82

evaluación de la producción de biosurfactante mediante la medición tensión
superficial.

Figura 8.22 Crecimiento de B. subtilis durante su cultivo en reactor y 83

evaluación de la producción de biosurfactante mediante la medición tensión
superficial.

Figura 8.21 Evaluación del efecto del biosurfactante producido por los 86
microorganismos IMP-R, IMP-X y Bacillus subtilis, sobre un aceite pesado de
15 ºAPI.

ix
 IV. ABREVIATURAS

°API Gravedad API

°C Grados centígrados

µ Velocidad de crecimiento

µL Microlitros

ANOVA Análisis de varianza

AT Agua termal

BS Biosurfactante

C/Fe Relación carbono-fierro

C/Mg Relación carbono-magnesio

C/N Relación carbono-nitrógeno

cm Centímetros

E24 Índice de emulsificación

g/L Gramos por litro

h Horas

MM Medio mineral

MEOR Recuperación mejorada de hidrocarburos vía microbiana

mg/L Miligramos por litro

mL/min Mililitros por minuto

x
mM Milimoles

mmoles CO2/L Milimoles de dióxido de carbono por litro

mmoles CO2/L d Milimoles de dióxido de carbono por litro por día

mN/m Milinewton por metro

nm Nanómetros

PC Porcentaje de contribución

P.D. Prueba de dispersión

Pmax Producción máxima

R2 Coeficiente de correlación

rmax Velocidad de producción

rpm Revoluciones por minuto

SC Suelo contaminado

td Tiempo de duplicación

T.I. Tensión interfacial

T.S. Tensión superficial

λ Fase de adaptación

xi
RESUMEN

Los biosurfactantes son un grupo diverso de moléculas de superficie activa,

producidos por una gran variedad de microorganismos. Debido a su naturaleza
anfifilica son capaces de modificar la interfase agua-aceite, agua-aire o suelo-agua y
por lo tanto reducen la tensión superficial e interfacial. Comparados con los
surfactantes químicos tienen la ventaja de ser biodegradables, menos tóxicos y
efectivos a temperatura, pH y salinidad extremas; además de poder ser sintetizados a
partir de fuentes residuales o baratas. En la industria petrolera pueden ser utilizados
como mejoradores del flujo del crudo, en la recuperación mejorada de hidrocarburos
vía microbiana, mejoramiento de la biodegradación de hidrocarburos y limpieza de
tanques y tuberías Su producción se ve afectada por los factores de crecimiento a los
que los microorganismos se exponen, como la presencia de sustratos específicos,
cationes y condiciones extremas.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de cepas aisladas de sitios

extremos para producir biosurfactantes y determinar si modificando las relaciones de
nutrientes se incrementa dicha producción. Para ello se seleccionaron las cepas: IMP-
X (coco-bacilo, Gram-negativo aislado de un suelo contaminado con hidrocarburos de
Veracruz, México), IMP-R (bacilo largo, Gram-negativo, aislado de aguas termales de
Jalisco, México) e IMP-T (bacilo Gram-negativo, aislado de aguas termales de
Michoacán, México). Además de utilizar a Bacillus subtilis como cepa control.

Este trabajo consistió de tres fases. En la primera se evaluó la capacidad de los

microorganismos seleccionados para producir biosurfactantes con 3 medios de cultivo:
medio mineral (MM) con glicerol, MM con una mezcla de hidrocarburos
hexadecano/eicosano y caldo nutritivo. El caldo nutritivo fue el medio en donde se
obtuvo una mejor respuesta de la producción de biosurfactantes, evaluada mediante la
prueba de dispersión de aceite y actividad emulsificante; observando zonas de
dispersión de aceite de 0.8 cm e índices de emulsificación por arriba del 50%;
indicativos de la producción de dicho metabolito.

En las cinéticas de crecimiento se observó que la producción del biosurfactante se

favoreció a la temperatura de aislamiento de los microorganismos seleccionados y
ocurre durante la fase exponencial, lo que indicó un crecimiento asociado a la
producción del biosurfactante. Logrando disminuir la tensión superficial de 65 a 31
mN/m con la cepa IMP-X y de 63 a 46 mN/m con la cepa IMP-R; mientras que con las

1
cepas IMP-T y control no se observaron cambios significativos en la tensión
superficial. Con base en estos resultados se seleccionaron las cepas IMP-R e IMP-X
para la siguiente fase del trabajo.

Durante la segunda fase se utilizó un diseño experimental Box-Behnken de factorial 33

que permitió evaluar 3 variables, a 3 niveles. La variables evaluadas fueron las
relaciones C/N, C/Fe y C/Mg; utilizando un medio mineral modificado (Tahzibi et al.,
2004) y glucosa como fuente de carbono. Los resultados del diseño experimental se
analizaron estadísticamente, lo que permitió construir un modelo adecuado para
ajustar y estimar la producción de biosurfactante; considerando los términos lineales,
cuadráticos y sus interacciones, con base en la variable respuesta: tensión superficial.

Para el caso de la cepa IMP-X el modelo cuadrático fue adecuado para describir los
valores de tensión superficial observados, con un coeficiente de correlación (R2) de
0.98676. El componente más significativo del modelo fue la interacción entre las
variables C/N y C/Mg, la relación C/N y la relación C/Fe. En general, el mayor efecto
fue dado por los factores de primer orden con un porcentaje de contribución de 45.8%.
Los valores óptimos para la producción de biosurfactantes por la cepa IMP-X fueron
C/N de 5, C/Fe de 26,000 y C/Mg de 30, disminuyendo la tensión superficial hasta 33
mN/m.

El modelo cuadrático de la cepa IMP-R describió los valores observados con un

coeficiente de correlación (R2) de 0.98972. Los componentes más significativos del
modelo fueron el termino cuadrático de la relación C/N y la interacción entre la relación
C/Fe y C/Mg. El mayor efecto fue dado por las interacciones de los términos lineales
de las variables con un porcentaje de contribución de 46.23%. Los valores óptimos
para la producción de biosurfactantes por la cepa IMP-R fueron C/N de 10, C/Fe de
42,000 y C/Mg de 50, que disminuyó la tensión superficial a 30 mN/m.

En la tercera etapa se llevo a cabo la producción de biosurfactante a nivel reactor de

las cepas IMP-X e IMP-R, utilizando las condiciones óptimas obtenidas a partir del
diseño experimental. Con la cepa IMP-X se obtuvo un rendimiento de biosurfactante
de 21.6 g/L y con la cepa IMP-R 20 g/ L, logrando reducir la tensión superficial en 38.7
y 27.9 unidades, respectivamente. También se observaron valores de 1.4 a 1.8 mN/m
de tensión interfacial con hexadecano para los microorganismos cultivados en reactor.
Además se evaluó el efecto del biosurfactante sobre un crudo, observando el cambio
en la movilidad del aceite que fluyó con mayor rapidez comparado con el control

2
(medio de cultivo y aceite). Esto debido a las características tensoactivas del
bioproducto.

Las cepas IMP-X e IMP-R fueron como Serratia marcescens y Geobacillus

thermolevorans, respectivamente y demostraron capacidad para producir
biosurfactantes.

3
1. INTRODUCCIÓN

La demanda de energía en el mundo ha determinado el uso intensivo del petróleo y

sus derivados como fuente de energía. Además, muchos de sus componentes son
empleados como materias primas básicas en diversas industrias, entre ellas las
químicas y petroquímicas, lo que ha originado la disminución o agotamiento de las
reservas petroleras.

Por lo que para México y muchos países del mundo es importante el desarrollo de
tecnologías que permitan mejorar la extracción de petroleo, con el objetivo de
incrementar su producción y extender la vida útil de los yacimientos. Estas tecnologías
consisten de procesos fisicoquímicos, en su mayoría, sin embargo la aplicación de
procesos biológicos es una alternativa técnica y económicamente factible (Bryant y
Lockhart, 2002). Algunos de estos procesos biológicos incluyen la Recuperación
Mejorada de Hidrocarburos Vía Microbiana (MEOR, por sus siglas en inglés), mediante
la aplicación y/o estimulación de microorganismos nativos o exógenos al yacimiento,
los cuales tienen la capacidad de producir diferentes metabolitos útiles en la
recuperación de hidrocarburos, como los biosurfactantes. Estos compuestos pueden
mejorar algunas de las propiedades reológicas de los aceites, entre ellas la
disminución de su viscosidad (Ilias et al., 1999), permitiendo que puedan ser
desplazados con mayor facilidad dentro del yacimiento y en tubería; por lo que pueden
ser utilizados como mejoradores de flujo (Bognolo, 1999). Además, al disminuir la
tensión superficial e interfacial entre los fluidos del yacimiento permiten la liberación
del aceite y por lo tanto incrementan la recuperación del mismo (Kitamoto et al., 2002).
Los biosurfactantes también pueden ser utilizados en el transporte de petróleo, la
limpieza de tanques y tuberías, además de la refinación y formulación de productos
(Lee et al., 2008; Banat et al., 2000).

Por otra parte la explotación del petróleo ha determinado la aparición de crecientes

fuentes de contaminación. Por ejemplo: derrames accidentales desde buques
petroleros, generación de residuos en la extracción y el procesamiento del petróleo y
sus derivados, etc. La importancia de la contaminación producida por estos
compuestos está determinada por sus características mutagénicas, carcinogénicas y
tóxicas. Además, su escasa solubilidad dificulta su biodegradación natural (Bach y
Gutnick, 2004). Por lo que la adición de biosurfactantes en los sistemas de
remediación de aguas, suelos y materiales contaminados con hidrocarburos es una

4
alternativa para mejorar la eficiencia de los sistemas de biodegradación (Whang et al.,
2009).

1.1 Procesos microbianos utilizados en la industria de petróleo

En los procesos de exploración, explotación, refinación y distribución de la industria

petrolera, se utilizan diferentes tecnologías para incrementar su eficiencia y disminuir
y/o eliminar los residuos peligrosos y contaminación en agua, suelo, aire; que se
generan en esta industria.

Estas tecnologías incluyen en su mayoría procesos físico-químicos, sin embargo los

procesos microbiológicos han tenido un auge en décadas recientes, por sus ventajas
de ser técnicamente económicos y amigables con el medio ambiente. Por ejemplo los
procesos microbianos no consumen grandes cantidades de energía como los
procesos térmicos, tampoco dependen del precio del petróleo como muchos procesos
químicos. Debido a que los procesos microbianos tienen lugar a velocidades
exponenciales, esto podría ser benéfico para producir grandes cantidades de
productos útiles a partir de fuentes baratas y renovables. Los procesos microbianos
tienen el potencial de ser más económicos que los procesos físico-químicos
(Burchfield y Carroll, 1988).

Algunas de las tecnologías microbiológicas con aplicación en la industria del petróleo

(Tabla 1.1) incluyen la aplicación de bioproductos (entre ellos biosurfactantes) para la
extracción y transporte de aceite, limpieza de tanques y tuberías, tratamiento de
suelos y efluentes contaminados con hidrocarburos. Su aplicación de estos
compuestos se deriva de su naturaleza como agentes tensoactivos.

5
 Tabla 1.1. Aplicaciones de los biosurfactantes en la industria del petróleo.
Proceso Aplicaciones Actividades
Extracción de Modificación de la mojabilidad Agentes humectantes y de
aceite de la roca de yacimiento recubrimiento
Reducción de la viscosidad de Emulsificantes
aceite
Dispersión de lodos de Agentes dispersantes
perforación
Control de depositación de Agentes solubilizantes
parafinas/asfaltenos
Incremento del Agentes reductores de la
desplazamiento de aceite tensión interfacial
Transporte Reducción de la viscosidad Emulsificantes
de aceite Estabilización de la emulsión Agentes de recubrimiento
aceite
Control de la depositación Agentes solubilizantes
parafina/asfaltenos
De-emulsificación de De-emulsificante
emulsiones de aceite
Limpieza de Emulsificación de lodos Emulsificantes
tanques y aceitosos
contenedores Dispersión de hidrocarburos Dispersantes
de aceite
Fuente: Banat et al. (2008)

1.2 Surfactantes

Los tensoactivos llamados también surfactantes o agentes de superficie activa, son

especies químicas de naturaleza o estructura anfifílica (Fig. 1.1), con tendencia a
localizarse en la interfase formando una capa monomolecular. Lo cual provoca que la
solución de tensoactivos esté activa entre las fases hidrofílica e hidrofóbica. Esta
ubicación impide el tráfico de moléculas que van de la superficie al interior de líquido
en busca de un estado de menor energía, disminuyendo así el fenómeno de tensión
superficial (Castellan, 1998).

6
Según el tipo de disociación del grupo hidrofílico en fase acuosa, se denominan a los
surfactantes como: catiónicos (amonio cuaternario), aniónicos (carboxilatos y
sulfonatos), noaniónicos (polímero de óxido de etileno) y anfotéricos (betaínas y
taurinas) (Salager, 1993).

O
H 2 H2 H2 H 2 H2 H2 H 2 H2
C C C C C C C C C
H2 C C C C C C C C C O- Na+
H2 H2 H2 H2 H2 H2 H 2 H2
Cola hidrofóbica Cabeza
hidrofílica

Figura 1.1. Molécula de dodecil éster sulfato de sódio

Además de los surfactantes químicos se encuentran los biosurfactantes, ambos

compuestos comparten características tensoactivas, sin embargo difieren en su
estructura y en la forma de ser producidos. Los biosurfactantes son sintetizados por
microorganismos de diversas especies y están formados por azúcares, péptidos y
lípidos.

1.2.1 Fenómenos de superficie

Una superficie se define como la región de separación de dos fases, presentando

propiedades físicas, químicas y eléctricas que son diferentes a las propiedades del
resto de las fases (Fig. 1.2). La interacción de las fases determinan los fenómenos de
superficie como la tensión superficial e interfacial.

Los fenómenos de tensión superficial y tensión interfacial pueden ser explicados

estableciendo que la fuerza que actúa en una molécula de la superficie de un líquido
es diferente de las fuerzas que actúan en una molécula similar en el resto del líquido
(Orduño, 2006).

7
 Figura 1.2. Fuerzas moleculares de la tensión superficial e interfacial.

Los cambios en la tensión interfacial y superficial influyen en la estabilización o

desestabilización de emulsiones, el balance hidrofílico- lipofílico (HLB, por sus siglas
en inglés) y la concentración crítica micelar (CMC).

1.2.2 Tensión superficial

La superficie de cualquier líquido se comporta como si sobre ésta existiera una

membrana a tensión, a este fenómeno se le conoce como tensión superficial. La
tensión superficial de un líquido está asociada a la cantidad de energía necesaria para
aumentar su superficie por unidad de área.

La tensión superficial es causada por los efectos de las fuerzas intermoleculares que
existen en la interfase y depende de la naturaleza del líquido, del medio que le rodea y
de la temperatura. Líquidos cuyas moléculas tienen fuerzas de atracción
intermoleculares fuertes tienen tensión superficial elevada (Hiemenz, 1986).

En general, la tensión superficial disminuye con la temperatura, ya que las fuerzas de

cohesión disminuyen al aumentar la agitación térmica. La influencia del medio exterior
se debe a que las moléculas del medio ejercen acciones atractivas sobre las
moléculas situadas en la superficie del líquido, contrarrestando las acciones de las
moléculas del líquido (Castellan, 1998).

8
1.2.3 Tensión interfacial

Cuando se ponen en contacto dos líquidos inmiscibles el sistema estará formado por
las dos fases líquidas y la interfase de contacto entre ellas. Las moléculas de la
interfase entre dos líquidos estarán sometidas a fuerzas de magnitudes diferentes a
las que están sometidas las moléculas del seno de cada uno de los líquidos. Estas
fuerzas dan origen a la tensión interfacial. Además se tendrán también interacciones
de tipo Van der Waals con las moléculas del otro líquido en la interfase, lo que
conducirá a que la tensión en la interfase (tensión interfacial) tenga un valor intermedio
entre las tensiones superficiales de los dos líquidos condensados (Anton, 2005).

1.3 Biosurfactantes

Los biosurfactantes son compuestos anfifílicos producidos en la superficie celular de

diferentes microorganismos o excretados extracelularmente, tienen una parte
hidrofóbica y una hidrofílica que reducen la tensión superficial y las tensiones entre las
moléculas individuales de la superficie y la interfase (Youssef et al., 2004; Desai y
Banat, 1997).

1.3.1 Microorganismos productores de biosurfactantes

Dentro de los microorganismos que producen biosurfactantes se encuentran bacterias,

hongos y levaduras. En general el tipo de biosurfactante producido por ellos son
lípidos o unidades compuestas por azúcares, péptidos y lípidos, antibióticos, etc.

Algunos de los microorganismos que han sido estudiados y se encuentran reportados

en la literatura son: Candida antartica (Morita, et al., 2007), Pseudomonas sp (Cho et
al., 2006; Arino et al, 1996), Pseudomonas aeruginosa (Raza et al., 2006; Rahman et
al., 2002; Patel y Desai, 1997; Mulligan y Gibbs, 1989), Candida bombicola (Solaiman
et al., 2004; Daniel et al., 1998), Bacillus subtilis (Youssef et al., 2007; Dehghan et al.,
2005), Bacillus licheniformis (Thaniyavarn et al., 2003), Azotobacter vinelandii
(Levišauskas et al., 2004), Flavobacterium sp (Bodour et al., 2004), y Kurtzmanomyces
sp (Kakugawa et al., 2002).

9
1.3.2 Clasificación de los biosurfactantes

Los surfactantes microbianos son moléculas complejas que cubren una amplia gama
de compuestos químicos incluyendo péptidos, ácidos grasos, fosfolípidos, antibióticos,
lipopéptidos, etc. La mayoría de estos compuestos son aniónicos, solo algunos son
catiónicos como los que contienen grupos amino (Mulligan, 2005).

Los biosurfactantes se pueden clasificar de acuerdo a su peso molecular en dos tipos:

de bajo peso molecular que disminuyen la tensión superficial e interfacial, y de alto
peso molecular que se unen fuertemente a las superficies provocando una emulsión
(Ron y Rosenberg, 2001).

1.3.2.1 Biosurfactantes de bajo peso molecular

Los biosurfactantes de bajo peso molecular son generalmente glicolípidos o

lipopéptidos. Entre ellos se encuentran ramnolípidos, trehalolípidos y soforolípidos, los
cuales son disacáridos acetilados con una cadena larga de ácidos grasos o
hidroxiácidos (Rosenberg y Ron, 1999).

A) Glicolípidos

Los glicolípidos son los biosurfactantes más comunes. Pueden ser mono, di, tri, o tetra
sacáridos; como la lactosa, manosa, galactosa, ácido glutámico, ramnosa y sulfato de
galactosa. El componente del ácido graso tiene generalmente una composición similar
a los fosfolípidos. Los glicolípidos pueden clasificarse de la siguiente forma:

 Lípidos de trehalosa (Fig. 1.1). Producidos por muchos miembros del género
Mycobacterium. La cadena de lípidos difiere en tamaño y estructura de los
ésteres del ácido micólico en diferentes especies de Mycobacteria,
Corynebacteria, Nocardìa y Brevibacteria (Desai y Banat, 1997).

10
Figura 1.1 Estructura de la trehalosa producida por Rhodococcus erythropolis y
Arthrobacter. (Burchfield y Carroll, 1988).

 Soforolípidos (Fig. 1.2) Estos son producidos por diversas levaduras como
Torulopsis bombicola. El azúcar es el disacárido soforosa que consiste en dos
unidades de glucosa con uniones β 1-2. Los grupos hidroxilo 6 y 6’ están
generalmente acetilados. (Daniel et al., 1998).

.
Figura 1.2. Estructura de la soforosa producida por Torulopsis bombicola (Rosenberg
y Ron, 1999).

 Ramnolípidos (Fig. 1.3): Algunas especies de Pseudomonas producen

grandes cantidades de un glicolípido compuesto de una o dos moléculas de
ramnosa y dos moléculas de acido β- hidroxidecanoico (Fig. 1.3a). P.
aeruginosa KY4025 producen ramnolipídos con una sola molécula de ramnosa
(Fig., 1.3b) o bien, con dos moléculas de ramnosa pero con una sola molécula
de ácido β-hidroxidecanoico producido por P. aeruginosa DSM2874(Fig. 1.3c)
(Arino et al., 1996).

11
 (a)

(b)

(c)

Figura 1.3. Ejemplos de ramnolípidos, a) disacárido con un solo ácido β-

hidroxidecanoico producido por P. aeruginosa SB1, b) monosacárido producido por
P.aeruginosa KY4025, c) disacárido producido por P.aeruginosa DSM2874. (Cameotra
y Makkar, 1998).

12
B) Ácidos grasos

Los ácidos grasos producidos a partir de alcanos por oxidaciones microbianas han
sido estudiados como surfactantes. Los microorganismos también producen ácidos
grasos complejos conteniendo grupos OH y ramificaciones alquilo, por ejemplo, los
ácidos corimucólicos son surfactantes (Karanth et al., 1999).

C) Fosfolípidos

Son componentes importantes de las membranas microbianas. Acinetobacter sp. ha

sido reportado como productor de fosfolípidos con propiedades surfactantes en
presencia de hexadecano (Karanth et al., 1999) y Thiobacillus thiooxidans con sulfuros
(Brown, 1990).

D) Antibióticos tensoactivos

Algunos antibióticos como polimixinas, surfactinas, entre otros; tienen propiedades

tensoactivas y están formados principalmente de unidades peptídicas y ácidos grasos.

 Polimixinas: Son un grupo de antibióticos producidos por Brevibacterium

polymyxa y bacilos relacionados. La polymixina B (Fig. 1.4) es un decapéptido,
donde el amino ácido 3 y 10 se unen para formar un octapéptido cíclico, donde
un ácido graso de cadena ramificada está unido con el ácido 2,4-
diaminobutírico (Rosenberg y Ron, 1999).

Figura 1.4. Estructura de la Poliximina B (Rosenberg y Ron, 1999).

13
  Surfactina (subtilisina): es uno de los biosurfactantes más activo, producido
por B.subtilis. Está compuesta por un lipopéptido cíclico, un ácido carboxílico y
siete grupos amino (Fig. 1.5) (Dehghan et al., 2005). Bach y Gutnick (2004) han
mejorado el proceso de producción de este biosurfactante agitando
continuamente y quitando el surfactante mediante el fraccionamiento de la
espuma y la adición de sales de hierro o magnesio en el medio de cultivo;
alcanzado una producción de 0.8 g/L.

Figura 1.5. Estructura de la surfactina producida por B. subtilis. (Rosenberg y Ron,

1999).

1.3.2.2 Biosurfactantes de alto peso molecular

Los biosurfactantes de alto peso molecular también son conocidos como

biosurfactantes poliméricos (heterosacáridos poliméricos), están compuestos por
polisacáridos, proteínas, lipopolisacáridos, lipoproteínas o mezclas de estos
biopolímeros (Ron y Rosenberg, 2001). Dentro de estos biosurfactantes se
encuentran:

A) Emulsan: producido por Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 (ATCC 31012),

bacteria aislada durante un estudio sobre la degradación de petróleo crudo en el mar.
Su actividad superficial se debe a la presencia de ácidos grasos, que comprenden el
15% del peso seco del biopolímero, que se adjuntan a la columna de polisacáridos a
través de vínculos o-ester y N-acil (Amiriyan et al., 2004).

14
B) Alasan: Producido por Acinetobacter radioresistens, es un polisacárido
aniónico y una proteína de bajo peso molecular. El componente polisacárido contiene
enlaces de covalencia con alanina (Rosenberg y Ron, 2002).

C) Biodispersan: A. calcaoceticus produce extracelularmente un surfactante

polisacárido aniónico, el cual dispersa eficientemente la piedra caliza y el dióxido de
titanio. Este surfactante se une al carbonato de calcio, cambiando sus propiedades en
la superficie de modo que permite una mejor dispersión en el agua. Además de ser un
tensoactivo, actúa como surfactante y ayuda en la fractura de la piedra caliza durante
el proceso de molienda (Ron y Rosenberg, 2001).

D) Complejo Polisacáridos-lípidos: también llamado ―liposan‖, consta de 95%

de carbohidratos y 5% de proteína. ha sido reportado como biosurfactante (Bach y
Gutnick, 2004).

1.3.3 Ventajas de los biosurfactantes sobre los surfactantes químicos

Los biosurfactantes tienen muchas ventajas sobre los surfactantes químicos. Algunas
de estas ventajas son:

 Biodegradabilidad. Los surfactantes sintetizados químicamente son utilizados

ampliamente, en diferentes industrias, por ejemplo en la industria del petróleo, en
la limpieza de derrames, así como para mejorar la recuperación de hidrocarburos
en los yacimientos. Estos compuestos no son biodegradables y pueden ser
tóxicos para el ambiente. En cambio, los biosurfactantes, son biodegradables y
han demostrado tener propiedades emulsificantes y tensoactivas equivalentes a
los surfactantes químicos (Banat, 1995).

 Baja toxicidad. Los tensoactivos sintéticos utilizados para aumentar la solubilidad

del contaminante son a menudo tóxicos, lo que representa una fuente adicional
de contaminación. Por el contrario, los surfactantes producidos por
microorganismos son menos tóxicos y tienen propiedades similares a los
químicos (Batista et al., 2006; Rodrigues et al., 2006). Por ejemplo, los
glicolípidos producidos por Rodococcus sp 413A fueron 50% menos tóxicos que
Twen 80 en pruebas de solubilidad de naftaleno (Mulligan, 2005).

15
 Biocompatibilidad y digestibilidad. Lo que permite su aplicación en cosméticos,
fármacos y como aditivos de alimentos (Kosaric, 2001).

 Disponibilidad de materias primas: se pueden producir a partir de materias

primas baratas y disponibles. La fuente de carbono puede provenir de
hidrocarburos, carbohidratos y/o lípidos, que pueden ser usados por separado o
en combinación (Kosaric, 2001).

 Producción rentable: dependiendo de su aplicación, los biosurfactantes también

pueden ser generados a partir de residuos industriales y subproductos, de gran
interés para su producción en grandes cantidades, por ejemplo para el uso en
tecnologías relacionadas al petróleo (Kosaric, 2001). La selección de materias
primas baratas es importante para disminuir el costo total del proceso de
producción de biosurfactantes (Makkar y Cameotra, 1999).

 Uso en problemas ambientales: los biosurfactantes pueden ser usados

eficientemente en el manejo de emulsiones industriales, control de derrames de
petróleo, biodegradación y detoxificación de efluentes industriales y en
biorremediación de suelos contaminados (Toledo et al., 2008; Mulligan, 2005).

 Especificidad: Los biosurfactantes, siendo moléculas orgánicas complejas con

grupos funcionales específicos, son frecuentemente específicos en su actividad
(de particular interés en la eliminación o detoxificación de contaminantes
específicos). De-emulsificación de emulsiones industriales, aplicaciones en
cosméticos, productos farmacéuticos y alimentos (Kosaric, 2001; Desai y Banat,
1997).

 Eficacia. Los biosurfactantes pueden actuar a temperaturas, pH y

concentraciones de sal extremas, en las cuales fueron generados por
microorganismos extremófilos o bien soportar y tolerar estas condiciones
(Ghojavand et al., 2008; Joshi et al., 2008; Cameotra y Makkar, 1998).

16
1.3.4 Síntesis de los biosurfactantes

Los biosurfactantes son producidos por una variedad de microorganismos, secretados

extracelularmente o unidos a la célula, predominantemente durante su crecimiento en
una fase acuosa y sustratos inmiscibles.

La función de los biosurfactantes en células microbianas no está completamente

entendida. Sin embargo se ha especulado sobre su participación en la emulsión de
sustratos inmiscibles en agua. El contacto directo de las células con gotas de
hidrocarburo y su interacción con gotas emulsificadas ha sido descrito (Mulligan,
2005). Además, los biosurfactantes han demostrado estar involucrados en la adhesión
celular, que imparte gran estabilidad bajo condiciones ambientales hostiles, en la
desorción de la célula para encontrar nuevos hábitats de supervivencia (Afrapoli et al.,
2009).

En su estructura anfifílica, la parte hidrofóbica puede ser una cadena larga de ácido
graso, un hidroxiácido o α-álcali- β-hidroxiácido y la parte hidrofílica puede ser un
carbohidrato, ácido carboxílico, fosfato, amino ácido, ciclopéptido o un alcohol. Dos
rutas metabólicas están involucradas en la síntesis de las partes hidrofóbicas
(hidrocarburos) e hidrofílicas (carbohidratos), que utilizan un grupo especifico de
enzimas. En muchos casos, la primera enzima para la síntesis de estos precursores,
son enzimas reguladoras. Existen las siguientes posibilidades para síntesis de las
diferentes fracciones de biosurfactantes y su unión: i) las partes hidrofóbicas e
hidrofílicas son sintetizadas de novo por dos rutas independientes; ii) la parte
hidrofílica es sintetizada de novo mientras que la síntesis de la parte hidrofóbica es
inducida por el sustrato; ii) la parte hidrofóbica es sintetizada de novo, mientras la
síntesis de la parte hidrofílica es dependiente del sustrato; y iv) la síntesis de ambas
partes son dependientes del sustrato (Desai y Banat, 1997; Lin et al., 1996; Desai y
Desai, 1993, Syldatk y Wagner, 1987).

1.3.5 Producción de biosurfactantes por fermentación

Dependiendo de la naturaleza del biosurfactante y el microorganismo productor, los

siguientes patrones de producción por fermentación son posibles: a) producción
asociada al crecimiento, b) producción bajo condiciones limitadas del crecimiento, c)

17
producción con células en reposo/no crecimiento o inmovilizadas, y d) producción
asociada a la adición de precursores (Rodrigues et al., 2006).

1.3.5.1 Producción asociada al crecimiento

En el caso de crecimiento asociado a la producción de biosurfactantes, existe una

relación paralela entre el sustrato, el crecimiento y la producción del biosurfactante.
Algunos ejemplos del crecimiento asociado a la síntesis de biosurfactantes son la
producción de ramnolípidos por Pseudomona sp., glicoproteína AP-6 por P.
flourescens 378 (Desai y Banat, 1997) y biodispersan por Bacillus sp (Cooper y
Goldenberg, 1987).

1.3.5.2 Producción bajo condiciones limitadas del crecimiento

La producción bajo condiciones limitadas del crecimiento está caracterizada por un

aumento de la cantidad del biosurfactante como resultado de la limitación de uno o
más componentes del medio de cultivo. Algunos investigadores han demostrado una
sobreproducción de biosurfactante por Pseudomonas sp., cuando el cultivo llega a la
fase estacionaria de crecimiento debido a la limitación de nitrógeno y fierro (Jiménez et
al., 2010; Mulligan y Gibbs, 1989).

1.3.5.3 Producción en reposo o por inmovilización de células

En la producción de biosurfactantes en reposo o por inmovilización no hay

multiplicación de células; sin embargo, éstas siguen utilizando la fuente de carbono
para la síntesis de biosurfactantes. Algunos ejemplos de este tipo incluyen la
producción de ramnolípidos por Pseudomonas sp (Reiling et al., 1986) y P aeruginosa
CFTR-6 (Ramana y Karanth, 1989), la producción de soforolípidos por Candida
apícola (Hommel y Huse, 1993) y tetraéster de trehalosa por Rhodococcus erythropolis
(Syldatk y Wagner, 1987). Este tipo de mecanismo permite la reducción de costos de
recuperación del producto, ya que el crecimiento y las fases de formación del producto
pueden ser separadas (Desai y Banat, 1997).

18
1.3.5.4 Producción con precursores

Se ha reportado que la adicción de precursores de biosurfactantes en el medio de

cultivo causa cambios en la cantidad y la calidad del producto. Por ejemplo, la adicción
de compuestos lipofílicos al medio de cultivo de T. magnoliae, T bombicola y T. apícola
incrementa la producción del biosurfactante con rendimientos de 120 a 150 g/L (Desai
y Banat., 1997; Tulloch et al., 1962).

1.3.6 Mecanismos y factores que regulan la producción de biosurfactantes

En la regulación de la producción de los biosurfactantes, operan principalmente tres

mecanismos: inducción y/o represión por la fuente de carbono, cantidad de nitrógeno y
la presencia iones polivalentes en los cultivos. Además de parámetros químicos y
físicos tales como la temperatura, pH, salinidad, agitación y oxigeno disponible. Todos
estos parámetros interfieren en la cantidad y tipo de biosurfactante producido (Toledo
et al., 2008; Rodrígues et al., 2006; Amezcua et al., 2004; Desai y Banat, 1997).

1.3.6.1 Fuente de carbono

La fuente de carbono es uno de los parámetros que influye en la síntesis del

biosurfactante por inducción o represión. En algunos casos la adición de sustratos
inmiscibles en agua promueve la producción de biosurfactante. Tulloch et al. (1962)
describieron la inducción de la síntesis de soforolípidos por adición de ácidos grasos
de cadena larga, hidrocarburos o glicéridos en el medio de cultivo de Torulopsis
magnolia. La síntesis de trehalolípidos por Rhodococcus erytropolis (Rapp et al.,
1979); y la producción de glicolípidos en el cultivo de Pseudomonas aeruginosa SB-30
(Chakrabarty, 1985) también han sido inducidos por la presencia de hidrocarburos.

Por otro lado se ha observado la represión de la síntesis de biosurfactantes en

Arthrobacter calcoaceticus y Arthrobacter paraffineus con sustratos hidrocarbonados,
al adicionar ácidos orgánicos y D-glucosa respectivamente (Cameotra y Makkar,
1998). También se ha reportado la reducción drástica en la síntesis de ramnolípidos
por P aeruginosa y de liposan por Candida lipolytica cuando se adiciona de D-glucosa,
acetato y ácidos tricarboxílicos al medio de cultivo (Guerra-Santos, 1984).

19
1.3.6.2 Fuente de nitrógeno

El tipo de fuente de nitrógeno es importante en la regulación de la síntesis de

biosurfactantes. Mulligan y Gibbs (1989) encontraron una relación directa entre el
incremento de la actividad de glutamina sintetasa y el aumento de la producción de
biosurfactantes por P aeruginosa cultivada en un medio con nitrato y proteasa
peptona.

Entre las sales inorgánicas probadas, el amonio y la urea son fuentes de nitrógeno
para la producción de biosurfactantes por Arthrobacter paraffineus, mientras que para
P. aeruginosa y Rhodococcus spp. es utilizado el nitrato (Desai y Banat, 1997).
Guerra-Santos et al. (1984) mostraron máxima producción de ramnolípidos bajo
condiciones limitadas de nitrógeno con una relación C/N de 16:1 a 18:1, y baja
producción del biosurfactante por debajo de relaciones C/N de 11:1. Hommel et al.
(1987) concluyeron que es la cantidad absoluta de nitrógeno y no su concentración
relativa, lo que influye en el rendimiento óptimo de la biomasa, mientras que la
concentración de la fuente de carbono determina la conversión del carbono disponible
a biosurfactante.

1.3.6.3 Limitación o presencia de cationes polivalentes

La limitación de cationes polivalentes también causa exceso de producción de

biosurfactantes (Guerra-Santos et al., 1984). En algunos trabajos se ha demostrado
que con la limitación en la concentración de sales de magnesio, calcio, potasio, sodio y
elementos traza se lograba un aumento en la producción de ramnolípidos con P.
aeruginosa DSM 2659 (Guerra-Santos et al., 1986). Por otro lado, la producción de
surfactina por B subtilis y Rhodococcus puede ser estimulada por la adición de sales
de hierro o manganeso al medio de cultivo (Mutalik et al., 2008; Copper et al., 1981).

1.3.6.4 Factores ambientales y condiciones de crecimiento

Factores ambientales y condiciones de crecimiento como temperatura, pH, agitación y

oxígeno disponible, también influyen en el crecimiento, actividad celular y producción
de biosurfactantes.

20
El pH juega un papel importante en la producción de biosurfactantes. En la producción
de soforolípidos por T. bombicola usando melaza de soja y acido oleico como co-
sustrato, a pH de 6 y de 9 se observaron las mejores producciones evaluadas como
diminución en la tensión superficial alcanzando valores de 37 y 36 mN/m
respectivamente (Solaiman et al., 2004). En el cultivo de C. bombicola para producir
soforolípidos, el pH se mantuvo en 4.7 durante la fase de crecimiento y en 3.3 durante
la fase de producción (Daniel et al., 1998). En la producción de ramnolipidos por
Pseudomonas sp el intervalo de pH es de 6.0 a 6.5 y en valores de pH por arriba de 7
decrece su actividad y producción (Guerra-Santos et al., 1984).

La temperatura también es otro factor importante en la producción de biosurfactantes,

así lo demostraron Kiran et al., (2009) al optimizar la producción de tensoactivo por
Aspergillus ustus MSF3, a una temperatura de incubación de 20°C, en un rango de 10
a 50°C. Cambios en la composición del biosurfactante debido a la temperatura han
sido reportados en el caso de A. paraffineus (Duvjak et al., 1982) y Pseudomonas sp
(Shanmugapriya et al., 2008).

La aireación y agitación también son condiciones que afectan la producción de

biotensoactivos. Su influencia en la síntesis de los biosurfactantes producidos por
Candida antartica fue evaluada por Adamczak y Bednarski (2000), probaron 3 flujos de
aire (1, 2 y 4 vvm) y agitación de 100 a 500 rpm; observaron que manteniendo la
saturación de oxigeno (ρO2) al 50% y un flujo de aire de 1 vvm (volumen de aire, por
volumen de líquido, por minuto) obtenían la mayor producción de lípidos de
manosileritirol (46 g/L), con un rendimiento de 28 g/L, logrando disminuir hasta 35
mN/m la tensión superficial del agua.

Moussa et al. (2006) evaluaron la producción de biosurfactantes por Nocardia amarae

en cultivo estático y con agitación de 100, 150, 200 y 250 rpm y encontraron que la
mayor cantidad del tensoactivo producido (4 g/L) se obtenía con una agitación de 150
rpm.

1.3.7 Producción de biosurfactantes en condiciones extremas

Muchas investigaciones describen la producción de biosurfactantes por

microorganismos en ambientes moderados, sin embargo pocos son los que estudian
la producción de éstos en condiciones extremas, especialmente ambientes

21
termofílicos, psicrofílicos y halofílicos (Cameotra y Makkar, 1998.). Los
microorganismos extremófilos y sus metabolitos son de interés porque tienen
numerosas aplicaciones industriales, médicas y ambientales, sus procesos
frecuentemente involucran exposición a condiciones extremas de temperatura,
presión, fuerza iónica, pH y/o solventes orgánicos, de aquí que surja la necesidad de
aislar microorganismos que sean capaces de funcionar en condiciones extremas.
Tales como microorganismos encontrados en diversos ambientes, los cuales son
considerados extremos para el hombre y óptimos para su crecimiento y desarrollo. Los
microorganismos extremófilos incluyen: termófilos, psicrófilos, alcalófilos, halófilos,
osmófilos, etc.

Joshi et al. (2008), estudiaron la producción de biosurfactantes por Bacillus

licheniformis K51, B. subtilis 20 B, B. subtilis R1 y una cepa de Bacillus HS3 utilizando
melaza y suero de queso como únicas fuentes de carbono a 45 ºC. Los
microorganismos se obtuvieron de muestras de aguas termales (45 a 67 ºC), de un
yacimiento petrolero, del desierto y de alimentos fermentados, y su aplicación fue
probada en la recuperación mejorada de petróleo vía microbiana (MEOR por sus
siglas en inglés) usando una columna empacada de arena.

Banat (1993) aisló de ambientes termotolerantes a Bacillus sp, productor de

biosurfactante, y reportó su crecimiento a temperaturas de 50º C en medio de cultivo
con hidrocarburos. Este microorganismo ha sido usado para la recuperación mejorada
de hidrocarburos vía microbiana (MEOR por sus siglas en inglés) y en la limpieza de
lodos de perforación.

Varias cepas facultativas tolerantes a altas temperaturas y salinidad fueron aisladas de

un depósito de aceite en los campos petroleros iraníes, Algunos de estos
microorganismos fueron capaces de crecer a 60 ºC a altas concentraciones de Na Cl
(15% w/v). La secuencia parcial del gen ribosomal 16S mostró que pertenecían al
grupo de B. subtills (Ghojavand, et al., 2008). Otro ejemplo de microorganismos
productores de biosurfactantes en condiciones termófilas fueron los aislados por Illias
et al. (1999) a partir de muestras de aceite y agua procedentes de pozos de Malasia.
Estos microorganismos lograron disminuir la tensión interfacial hasta 20 mN/m cuando
se cultivaban en medios con glucosa y sacarosa como fuente de carbono; e
incrementaron la viscosidad del medio de cultivo de 1 cp a 4 cp.

22
Los microorganismos psicrófilos pueden ser definidos como aquellos microorganismos
que tienen una temperatura óptima de crecimiento de 15°C o menor, una máxima
temperatura de crecimiento de aproximadamente 20°C y una mínima temperatura de
crecimiento de 0°C o menos. Las especies Gram negativas son las bacterias
psicrófilas más predominantes, rara vez se encuentran bacterias Gram positivas. La
mayoría de las bacterias psicrófilas aisladas e identificadas pertenecen a los géneros
Pseudomonas, Vibrio, Achromobacter, Flavobacterium y Cytophaga (Cameotra y
Makkar, 1998). No existen muchos reportes en la literatura sobre los microorganismos
psicrofílicos que crezcan sobre hidrocarburos y que produzcan biosurfactantes, sin
embargo, Pruthi y Cameotra (1997) reportaron la producción de biosurfactante por
Achrobacter protophormiae en la Antártica.

Muchos son los ejemplos de biosurfactantes producidos en condiciones aerobias, sin

embargo son pocos los casos de producción bajo anaerobiosis. Bacillus licheniformis
JF-2 es un ejemplo, que sería muy adecuado para trabajos in situ sobre la
recuperación mejorada de hidrocarburos o en la descontaminación de suelos
(Mulligan, 2005).

1.3.8 Aplicaciones de los biosurfactantes

Los biosurfactantes han sido identificados y caracterizados con el objetivo de darles

alguna aplicación industrial. Algunas de las aplicaciones de los biosurfactantes como
emulsificantes, dispersantes, agentes humectantes y de recubrimiento han sido
aprovechadas en diferentes industrias entre ellas la farmacéutica, biomédica, de
alimentos, metalúrgica, papelera, textil, agrícola, de construcción y petrolera (Batista et
al, 2006; Rodrigues et al., 2006; Kosaric, 2001). En esta última, los biosurfactantes se
utilizan en diferentes procesos entre ellos el de recuperación mejorada de
hidrocarburos vía microbiana (MEOR, por sus siglas en ingles), como mejoradores de
flujo y reductores de la viscosidad, en biorremediación y limpieza de tanques, entre
otros.

1.3.8.1 Recuperación mejorada de hidrocarburos vía microbiana (MEOR)

Un área potencial considerada para la aplicación de biosurfactantes es la recuperación

mejorada de hidrocarburos vía microbiana (MEOR). En MEOR, los microorganismos

23
son estimulados para producir polímeros y agentes tensioactivos que ayudan a la
recuperación y extracción del crudo disminuyendo la tensión interfacial entre el crudo y
la fase liquida y minimizando las fuerzas capilares que mantienen el petróleo en la
roca del yacimiento (Ghojavand et al., 2008; Banat, 1995).

En la producción de biosurfactantes in situ, los microorganismos son estimulados con

sustratos baratos, como melaza y nutrientes inorgánicos inyectados al pozo, para
promover el crecimiento microbiano y la producción del agente tensoactivo. Para lograr
resultados con MEOR, las bacterias deben crecer bajo condiciones extremas;
generalmente condiciones del yacimiento petrolero con temperatura (de 50 a 100º C),
presión, salinidad, y nivel de oxígeno bajo. (Kosaric, 2001; Patel y Desai, 1997; Banat,
1994).

La recuperación de petróleo mediada por biosurfactantes puede ser aprovechada

desde un enfoque económico para la recuperación de cantidades significativas de
petróleo atrapadas en yacimientos (Jinfeng et al., 2005). Youssef et al. (2007),
probaron dos cepas de Bacillus productoras de lipopéptidos, capaces de
metabolizarlos y producirlos en un depósito de aceite. La concentración media del
biosurfactante producido fue de alrededor de 90 mg/L, esta concentración es
aproximadamente nueve veces la concentración mínima necesaria para movilizar el
petróleo atrapado en medios porosos de arenisca.

La eficiencia de la recuperación mejorada de hidrocarburos por microorganismos ha

sido evaluada en diferentes campos de prueba en Estados Unidos, República Checa,
Rumania, Hungría, Polonia y Holanda; con incrementos significativos en la
recuperación (Batista et al., 2006).

Jinfeng et al. (2005) evaluaron la factibilidad técnica y las eficiencias de recuperación

en un pozo cerrado a 73 ºC y una salinidad de 16,790 mg/L en el campo petrolero
Dagang, China. Los resultados mostraron que los microorganismos identificados como
Arthrobacter sp (A02), Pseudomonas sp (P15) y Bacillus sp (B24), redujeron la tensión
interfacial debido a la producción de biosurfactantes a partir de la fermentación del
crudo; los microorganismos fueron capaces de desarrollarse, proliferar y avanzar en la
matriz porosa a altas temperaturas, un efecto positivo del primer tratamiento biológico
se dio principalmente por la buena conectividad entre los pozos de producción, los
pozos de inyección y los microorganismos autóctonos del petróleo, los cuales se
estimularon mediante la adicción de nutrientes.

24
1.3.8.2 Degradación de hidrocarburos en suelo y agua

Algunos microorganismos que utilizan como fuente de carbono a los hidrocarburos

excretan biosurfactantes. Los cuales son biodegradables y por consiguiente más
seguros para el medio ambiente.

La degradación de hidrocarburos en suelos contaminados depende de la presencia de

microorganismos degradadores de los mismos, composición del hidrocarburo
contaminante, disponibilidad de oxígeno, agua, temperatura, pH y nutrientes
inorgánicos. El estado físico del hidrocarburo también puede afectar la biodegradación.
La adición de agentes tensoactivos sintéticos o de origen biológico incrementa la
movilidad y solubilidad de los hidrocarburos (Kosaric, 2001).

Cuando los hidrocarburos son derramados en agua, los componentes más ligeros
volatilizan; sin embargo, debido a su baja solubilidad, la mayoría del hidrocarburo
queda sobre la superficie del agua. Los agentes tensoactivos mejoran la
biodegradación al aumentar la solubilidad del sustrato para las células microbianas y la
interacción con la superficie de la misma, lo que incrementa la hidrofobicidad de la
superficie, que permite a sustratos hidrofóbicos asociarse fácilmente (Mulligan, 2005;
Zhang y Miller, 1992)

Whang et al. (2008) evaluaron la aplicación potencial de dos tipos de biosurfactantes

para mejorar la degradación de diesel presente en suelo y agua. El ramnolípido
producido por P. aeruginosa J4 y la surfactina producida por B. subtilis ATCC 21332
fueron capaces de reducir la tensión superficial a valores menores de 30 mN/m de 72
mN/m. Los resultados experimentales demostraron su habilidad para aumentar la
solubilidad del diesel con la adición de los biosurfactantes; en el caso de la surfactina
la eficiencia de biodegradación del diesel fue de 94% en sistemas diesel/agua, similar
a las obtenidas con ramnolípidos. Además, los biosurfactantes fueron probados en
sistemas diesel y suelo donde se confirmó su capacidad para mejorar la
biodegradación del contaminante.

Otros microorganismos capaces de contribuir a la biodegradación de hidrocarburos

son Halomonas eurihalina, Alcaligenes faecalis y Enterobacter sp, productores de
bioemulsificantes capaces de emulsificar n-tratradecano, n-hexadecano, n-octano,
tolueno, xileno, aceites minerales y crudo (Toledo et al., 2008; Martìnez- Checa et al.,
2007).

25
Rahman et al. (2003) estudiaron la biorremediación de n- alcanos en lodos de
perforación. Los cuales contenían un 87.4% de aceites y grasas. El 10% de los lodos
fueron alcanos de C8-C11, éstos se degradaron al 100%, mientras que alcanos de C12-
C21 se degradaron en un 83-98%, C22-C31 hasta 80-85% y C32-C40 en 57-73%;
después de 57 días con adición de un consorcio, nutrientes y ramnolípidos. Las
menores tasas de biodegradación se lograron en las cadenas más largas. Sin
embargo, las tasas siguen siendo importantes, incluso para compuestos C32-C40,
indicando el beneficio del ramnolípido.

Por otro lado cuatro cepas bacterianas, aisladas de lodos de perforación, lograron
disminuir la tensión superficial por efecto de diferentes surfactantes: lipopéptidos,
ramnolípidos, soforolípidos y glicéridos. En el tratamiento de los lodos estos
biosurfactantes mostraron efectos sobre la remoción de hidrocarburos
incrementándola en un 70% después de 72 h in vitro. Esto prueba que los
biosurfactantes son una opción factible para la remediación de suelos contaminados
(Qin et al., 2005).

Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAHs, por sus siglas en inglés), son
componentes del creosato y son producidos durante la refinación del petróleo, la
producción del coke y la preservación de la madera. Muchos de ellos son
cancerígenos. Una forma general para los PAHs es C4n+2H2n+4, donde n es el numero
de anillos. Un PAH de cuatro anillos podría ser C18H12. Conforme el número de anillos
se incrementa, el compuesto comienza a ser más difícil de degradar debido a la
disminución de la volatibilidad y la solubilidad y el aumento de sorción (Santos, 2008).

Vipulanandan y Ren (2000) compararon la solubilidad de los PAHs y naftaleno con un

ramnolípido, dodecil sulfato de sodio (SDS) que es un surfactante aniónico y Triton X-
100 surfactante no-iónico. El biosurfactante incremento la solubilidad del naftaleno 30
veces y permitió su degradación (30 mg/L) en 40 días, a una concentración del
biosurfactante de 10 g/L. Sin embargo, con el surfactante Triton X-100 (10 g/L) se
obtuvo la misma degradación en un periodo menor (100 h). Al parecer el
biosurfactante fue utilizado como fuente de carbono en lugar del naftaleno lo cual no
ocurrió en el caso del Tritón X-100, indicando que el biosurfactante es además
biodegradable. Con el SDS no se obtuvo ninguna degradación

26
1.3.8.3 Biodegradación de pesticidas, compuestos clorados y metales pesados

Los pesticidas DDT, 2,4-D y 2,4,5T pentacloro fenol, bifenilos policlorados (BPC), entre
otros, son ejemplos de compuestos aromáticos halogenados. Su estabilidad y
toxicidad son causas de gran preocupación para el medio ambiente y la salud publica.
Los compuestos alifáticos halogenados, posición y número de halógenos son
importantes en la determinación del grado y mecanismo de degradación.

Algunas investigaciones se han centrado en la biodegradación de BPCs con la adición

de biosurfactantes para solubilizarlos. La mineralización de estos compuestos por
Alcaligenes eutrophus fue evaluada después de la adición del ramnolípido R1 (con una
masa molecular de 650 Da, concentración micelar critica de 54 mg/L y una tensión
superficial de 36 mN/m) producido por P. aeruginosa. Utilizando 4 g/L de
biosurfactante, 4,4’ clorobifenilo fue mineralizado 213 veces más que el control
(Robinson et al., 1996).

Los pesticidas son otro grupo de contaminantes que han sido estudiados. Mata-
Sandoval et al. (2000) compararon la habilidad de una mezcla de ramnolípidos para
solubilizar pesticidas, trifluralina y atrazina, contra un surfactante sintético Tritón X-100.
El surfactante sintético fue capaz de solubilizar aproximadamente dos veces más
todos los pesticidas que los ramnolípidos. El biosurfactante parece unirse a la
trifuralina en una micela y libera a los plaguicidas lentamente en la fase acuosa, lo que
permitiría su consumo microbiano de manera dosificada sin tener un efecto tóxico.

Debido a la naturaleza aniónica de los ramnolípidos, son capaces de remover metales

del suelo como el cadmio, cobre, lantano, plomo y zinc, debido a su capacidad de
formar complejos (Mulligan, 2005). Las constantes de estabilidad fueron establecidas
por una técnica de resina de intercambio catiónico (Ochoa y Loza, 1998). Los cationes
de menor a mayor afinidad para el ramnolípido fueron K+, Mg2+, Mn2+, Ni2+,Co2+, Ca2+,
Hg2+, Fe3+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Cu2+, Al3+. Las afinidades fueron aproximadamente las
mismas o superiores a las que los ácidos orgánicos tienen con los metales, esto indica
el potencial de los ramnolípidos para la remediación de suelos contaminados con
metales. Xie et al. (2006) emplearon un ramnolípido para estabilizar nanoparticulas de
plata en una fase liquida.

27
 1.3.8.4 Otras aplicaciones

En virtud de las propiedades de biodegradabilidad, la especificidad del sustrato, la

diversidad química y funcional, los biosurfactantes están ganando importancia en
agricultura, industria alimenticia, textil, productos petroquímicos, etc (Banat, 1997). Las
aplicaciones potenciales de biosurfactantes se muestran en la tabla 1.2.

Lípidos de manosil eritritol (MEL por sus siglas en ingles) no solo han exhibido
excelentes propiedades tensoactivas, sino también actividades versátiles en la
identificación de células respecto a la leucemia humana, feocromocitoma de ratas y
células de melanoma de ratón. Además, MEL-A, el principal componente de MEL,
aumenta dramáticamente la eficiencia del gen de transferencia mediado por
lipomosomas catiónicos (Morita et al., 2007).

Tabla 1.2. Aplicaciones de los biosurfactantes en diferentes industrias

Función Agricultura Plásticos Alimentos Limpieza Metales Pinturas Industria
industria petrolera
l

Emulsificación X X X X X X

Desemulsificación X

Penetrar X X X X X X X

Solubilizacion y X X X X
dispersión en
sólidos

Espumado X X X X

Detergente X X X

Inhibición de la X X
corrosión

Fuente: Kosaric, 2001.

28
2. ANTECEDENTES

Numerosos estudios y análisis se han desarrollado para conocer más de las

características de los biosurfactantes producidos por microorganismos (Tabla 2.1) y
sus aplicaciones (Rodrígues et al., 2008). Los cuales han sido desarrollados
principalmente en ambientes moderados.

Los biotensoactivos y microorganismos que los producen tienen numerosas

aplicaciones industriales, médicas y ambientales; las cuales frecuentemente suponen
la exposición a temperatura, presión, pH y salinidad extremos. Por lo que es necesario
estudiar la habilidad de microorganismos provenientes de ambientes hostiles para
producir biosurfactantes que puedan funcionar adecuadamente bajo las condiciones
prevalecientes en su aplicación (Cameotra y Makkar, 1998).

Ghojavand et al. (2008) aislaron bacterias pertenecientes al género Bacillus, de un

yacimiento petrolero iraní, que fueron capaces de producir biosurfactantes a 60°C y
15% w/v de NaCl. Por otro lado, microorganismos aislados de sitios contaminados con
hidrocarburos también han demostrado tener capacidad para producir tensoactivos a
partir de compuestos como el fluoreno y fenentreno (Bordoloi y Konwar, 2008).

En un trabajo previo realizado en el área de Biotecnología del IMP, se evaluó el

potencial productor de biosurfactantes a partir de 77 microorganismos aislados de
ambientes contaminados con hidrocarburos y de sitios extremos, con el objetivo de
seleccionar aquellos microorganismos que tuvieran potencial aplicación en la industria
del petróleo, mediante cambios en la tensión superficial (Roldán y Rojas, 2005)
evaluada de manera indirecta por la técnica de dispersión de aceite. Ortuño (2006),
como parte de este proyecto, seleccionó y estudió microorganismos termófilos con
aplicación potencial en la industria del petróleo. Con base en los resultados obtenidos
en estos trabajos se seleccionaron las cepas IMP-X, IMP-R e IMP-T, evaluadas
mediante la prueba de dispersión de aceite.

29
 Tabla 2.1. Biosurfactantes estudiados en la literatura
Tensión Tensión
Microorganismo
Surfactante Superficial Interfacial Referencias
productor
(mN/m) (mN/m)
Bajo peso molecular
N. erythropolis
Ácidos grasos 32 3a MacDonald et al., 1981

Lípidos de
Mycobacterium sp 38 1.5a Cooper et al., 1989
trehalosa
R. erythropolis Ristau y Wagner 1983;
30 3.5a
Kim et al., 1990
P. aeruginosa
Ramnolípidos
29 - Mulligan y Gibbs, 1993

Inoue e Itoh,1982;
T. bombicola
Soforolípidos 33 1.8a Davila et al., 1997

C. bombicola y
Solaiman et al., 2004
Cryptococcus 37 -
Zhang, 2004
uruatus
Arima et al., 1968;
Surfactina B. subtilis 27-32 1a Wei y Chu 1998

Thaniyavarn et al.,
B. licheniformis 28 -
2003
Lichenisina B. licheniformis 33 - Joshi, 2008
Flavolipidos Flavobacterium sp. 26 - Bodour et al., 2004
Azotobacter Levišauskaset et al.,
Glicolipidos - -
vinelandi 2004
Pruthi y Cameotra,
Serratia marcencens 27 - 1997
Tanikawa et al., 2006
Parra et al., 1989
Pseudomonas sp. 25-30 1b

Bacillus sp y B. Dehghan, 2005

Lipopeptidos 27-30 -
subtilis Ghojavand et al., 2008
Alto peso molecular
Cirigliano y Carman,
C. lipolytica
Liposan - - 1984

Emulsan 378 P. Fluorescens 27 - Persson et al., 1988

Biodispersan
A. calcoaceticus A2 - - Rosenberg, 1993
(-) No reportado, a: tensión interfacial medida con hexadecano, b: no especificado.

30
3. JUSTIFICACIÓN

El petróleo es la fuente de energía primordial en el mundo, por lo que es necesario el

desarrollo de tecnologías que permitan mejorar los procesos de extracción y
recuperación del mismo, con costos y rendimientos eficientes. Para resolver esta
problemática, los procesos biotecnológicos representan una buena alternativa por sus
costos significativamente menores, su bajo consumo de energía y la posibilidad de
utilizar materias primas baratas y renovables para obtener bioproductos. Como los
biosurfactantes cuyas características tensoactivas han sido comparadas con sus
homólogos químicos.

De aquí que los biosurfactantes pueden ser aplicados en la industria petrolera por sus
ventajas (biocompatibilidad, biodegradabilidad, selectividad, especificidad,
económicos, entre otras) en procesos de mejoramiento de extracción del crudo en
yacimientos, facilitando su transportación, disminuyendo su viscosidad; además de
incidir en los procesos de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos
incrementando su eficiencia.

Los microorganismos productores de biosurfactantes pueden provenir de sitios

extremos y contaminados con hidrocarburos, por lo tanto estar adaptados a las
condiciones de campo y tener potencial aplicación en diferentes áreas de la industria
petrolera, entre ellas la recuperación de hidrocarburos. Para ello es necesario conocer
a los microorganismos (cinéticas de crecimiento y producción de metabolitos), así
como evaluar diferentes sustratos, relaciones C/N, adición de cationes como Fe y Mg,
entre otras, que permitan optimizar su producción.

La producción de biosurfactantes es un campo en el que se debe trabajar para

mejorarla, además de evaluar y explotar la capacidad de los microorganismos aislados
de sitios extremos para producir dichos compuestos que pueden ser aplicados en
condiciones similares.

31
4. HIPÓTESIS

Los microorganismos aislados de sitios extremos y de suelos contaminados con

hidrocarburos son capaces de producir biosurfactantes y al modificar la relación
carbono/nitrógeno y cationes polivalentes (como Fe y Mg) del medio de cultivo su
producción puede incrementarse.

5. OBJETIVOS

5.1 General

o Evaluar la producción de biosurfactantes por microorganismos aislados de

sitios extremos y suelos contaminados con hidrocarburos.

5.2 Particulares

o Evaluar la producción de biosurfactantes por microorganismos aislados de

sitios extremos y suelos contaminados con hidrocarburos en diferentes medios
de cultivo.

o Evaluar la producción de biosurfactantes por microorganismos aislados de

sitios extremos y suelos contaminados con hidrocarburos a diferentes
temperaturas.

o Evaluar el efecto de las relaciones C/N, C/Fe y C/Mg sobre la producción de

biosurfactantes mediante un diseño experimental.

o Evaluar la producción del biosurfactante en un reactor de 3 L.

o Evaluar la actividad del biosurfactante sobre un hidrocarburo.

32
 6. DIAGRAMA EXPERIMENTAL

Selección de microorganismos productores de

biosurfactantes (BS), aislados de sitios extremos
y contaminados con hidrocarburos

Verificación de
Reactivación de las cepas pureza de las
cepas aisladas

Caracterización
Primera fase macro y
1) Pruebas de evaluación de la producción de BS microscópica
con 3 medios de cultivo (medio mineral con
glicerol o una mezcla de eicosano-hexadecano y
caldo nutritivo
Evaluación de la Identificación de
producción de BS: 2) Cinéticas de crecimiento y producción de BS los
 Actividad con el mejor medio: microorganismos
 a diferentes temperaturas. productores de BS
emulsificante
 a la temperatura óptima en la producción mediante pruebas
 Prueba de dispersión
del BS bioquímicas
(medición indirecta
de la tensión
superficial)
 Tensión superficial
Segunda fase Conservación de los
Diseño experimental: evaluación de las microorganismos
relaciones C/N, C/Fe y C/Mg, a tres niveles

Tercera fase
Cultivo en reactor de 3 L, con el mejor
tratamiento del diseño experimental para la
producción de BS

Evaluación del efecto del BS sobre un

crudo

33
7. METODOLOGÍA

7.1 Selección de microorganismos

A partir de 77 cepas aisladas de ambientes contaminados y extremos de trabajos

previos (Roldán y Rojas, 2005; Orduño, 2006), donde se evaluó su capacidad de
producir biosurfactantes en medio líquido, se seleccionaron tres microorganismos
(Tabla 7.1) que presentaron una respuesta favorable en cuanto a producción de
biosurfactantes (prueba de dispersión). Además, se consideró a la cepa Bacillus.
subtilis de colección microbiana del Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados
del IPN (CINVESTAV), la cual se encuentra reportada como productora de
biosurfactantes.

Tabla 7.1. Microorganismos utilizados en este proyecto.

Temperatura
Prueba de
de
Cepa Procedencia dispersión
aislamiento
Halo (cm.)
(°C)

IMP- X 30 SC, Veracruz. 1.5

IMP- R 60 AT, Jalisco. 0.7

IMP- T 60 AT, Michoacán. 0.8

Colección
B. subtilis
30 microbiana Nd
ATCC 6633
(CINVESTAV)
Roldán y Rojas, 2005. SC: suelo contaminado, AT: agua termal,
Nd: no determinado.

7.2 Reactivación de las cepas

La reactivación de las cepas se realizó en cultivo sólido en caja Petri, sembrándolas en

agar nutritivo, por la técnica de estría cruzada e incubadas durante un periodo de 24 h,
a la temperatura de aislamiento correspondiente (Tabla 7.1). Posteriormente se
observó la morfología colonial y microscópica de los microorganismos.

34
7.2.1 Caracterización macroscópica y microscópica de los microorganismos
seleccionados

Para describir la morfología colonial de los microorganismos cultivados en agar

nutritivo se observó su tamaño, forma, coloración, elevación, borde, superficie,
aspecto, consistencia, luz reflejada y luz transmitida. Con una colonia de cada
microorganismo se realizó la tinción de Gram. Estas tinciones fueron observadas con
el microscopio óptico y de contraste de fases Nikon E-800, utilizando el objetivo de
100x.

7.3 Evaluación de la producción de biosurfactantes en diferentes medios

de cultivo

Para verificar la producción de biosurfactantes, estos microorganismos se inocularon,

en diferentes medios líquidos con una variación en la fuente de carbono (Tabla 7.2),
en matraces de 250 mL, incubados por siete días a su temperatura de aislamiento
(Tabla 7.1) y con agitación de 115 rpm.

Tabla 7.2. Medios de cultivo, con diferente fuente de carbono.

Medio Fuente de carbono

Mineral * Glicerol

Mineral * Mezcla de hexadecano- eicosano (C16-C20)

Caldo nutritivo Peptona, extracto de levadura

*Anexo 1

Posteriormente se llevaron a cabo las pruebas de dispersión e índice de emulsificación

con los sobrenadantes obtenidos de los cultivos como se indica en la sección 7.5.

35
7.4 Preparación del sobrenadante para la evaluación de la producción de
biosurfactantes

Después del periodo de incubación, los cultivos se centrifugaron a 10,000 rpm durante
10 min, con el sobrenadante se realizaron las pruebas para evaluar la producción de
los biosurfactantes, mediante diferentes técnicas.

7.5 Métodos analíticos para evaluar la producción de biosurfactantes

Para evaluar la producción de biosurfactantes se utilizaron los siguientes métodos:

prueba de dispersión, índice de emulsificacion (E24) y tensión superficial.

7.5.1 Prueba de dispersión

La prueba de dispersión (Fig. 7.1) es un método para determinar de manera rápida y

sencilla si un microorganismo es potencialmente productor de biosurfactantes. Esta
técnica consiste en la evaluación de la dispersión de un aceite por efecto del
biosurfactante contenido en el sobrenadante de un cultivo microbiano libre de células,
sobre una superficie agua-aceite (Cardozo et al., 2010; Plaza et al., 2006; Youssef et
al., 2004; Morikowa et al., 2000). La prueba consiste en colocar 50 mL de agua
destilada en una caja Petri, seguida de la adición de 20 µL de hidrocarburo sobre la
superficie del agua. Después 10 µL del sobrenadante libre de células, se colocan
sobre la superficie del aceite y se mide el diámetro de la zona clara que se produce.

Para esta prueba se utilizó petróleo crudo tipo Maya, el cual está clasificado, como un
hidrocarburo pesado y también se realizó con los medios de cultivo utilizados como
control. Cada medición se llevó a cabo por triplicado.

36
 Figura 7.1. Prueba de dispersión.

6.5.2 Índice de emulsificación E24

El índice de emulsificación del biosurfactante fue medido mediante la técnica descrita

por Pruthi y Cameotra (1997) en donde se mezclan 6 mL de queroseno y 4 mL del
sobrenadante (biosurfactante) en un tubo de ensayo y posteriormente se agita en
vórtex a la máxima velocidad por dos minutos (Fig. 7.2). La estabilidad de la emulsión
se reportó en términos del porcentaje, como se muestra en la siguiente ecuación:
%E24 = Ef ∕ Ht x 100 (Ec. 7.1)

Donde:
%E24 = Índice de Emulsificación
Ef = altura de la emulsión formada
Ht = altura total

La prueba también se realizó con cada uno de los medios de cultivo utilizados, los
cuales corresponden a los blancos respectivos.

Figura 7.2. Índice de Emulsificación E24.

37
7.5.3 Tensión superficial

Los microorganismos que producen agentes tensoactivos se pueden evidenciar

mediante la disminución de tensión superficial que provocan en el medio de cultivo
donde están contenidos. Los análisis de tensión superficial se realizaron mediante el
método del anillo en un Tensiómetro DuNouy modelo 70545 (Fig. 7.3).

Figura 7.3. Tensiómetro DuNouy modelo 70545.

Este método ha sido usado para medir la tensión superficial e interfacial (Bordoloi y
Konwar, 2009; Ghojavand et al., 2008; Toledo et al., 2008; Youssef et al., 2007;
Kowalewski et al., 2006; Mousa et al., 2006; Rismani et al., 2006; Dehghan et al.,
2005; Qin et al., 2005; Bodour et al., 2004; Ilias et al., 1999; Pruthi y Cameotra; 1997;
Sen, 1997), utiliza un anillo de platino con geometría muy precisa, cuando se sumerge
en el líquido a medir se ejerce una fuerza máxima vertical que es directamente
proporcional a la tensión superficial.

Para verificar el buen funcionamiento del tensiómetro se midió la tensión superficial del
agua, reportada en 72.2 mN/m2 a 20 °C (Shaw, 1992). Los controles abióticos de los
cultivos fueron los medios respectivos sin inocular. Cada medición se realizó por
triplicado y temperatura controlada.

38
7.6 Preparación del inóculo

Para obtener el inóculo de los cultivos se preparó un matraz semilla que contenía 75
mL de caldo nutritivo, adicionando 1 mL de concentrado de células, con una densidad
óptica de 0.8, e incubado con agitación de 115 rpm, durante 24 h a la temperatura
correspondiente para cada microorganismo (Tabla 7.1).

7.7 Evaluación del efecto de la temperatura sobre las cinéticas de

crecimiento y producción de biosurfactantes en caldo nutritivo.

A partir del matraz semilla (sección 7.5), con 1 mL se inocularon matraces Erlenmeyer
de 250 mL que contenían 75 mL de caldo nutritivo y se incubaron a temperaturas de
40, 50, 60 y 70°C en el caso de las cepas IMP-R e IMP T; y 30, 40 y 50°C en al caso
de la cepa IMP X, incubados con agitación de 115 rpm durante 72 h.

Se midió la biomasa formada por medio de la densidad óptica a 620 nm, además se
evaluó la capacidad de producción de surfactante mediante la prueba de dispersión.

7.8 Cinéticas en caldo nutritivo a la temperatura de mejor respuesta en la

producción del biosurfactante

Las cinéticas de crecimiento y producción de biosurfactante se llevaron a cabo de la

misma forma como se indicó en la sección anterior a una temperatura de 60°C para
las cepas IMP-R e IMP-T y 30°C para la cepa IMP-X, en caldo nutritivo por 48 h. En
este caso se evaluaron además de la biomasa y de las pruebas de producción de
biosurfactantes, la producción de CO2 y proteína.

La producción de CO2 se evaluó con un cromatógrafo de gases con detector de

conductividad térmica a las siguientes condiciones: temperatura del inyector 30°C,
horno 45°C, detector 100°C. Se utilizó helio como gas acarreador (65 mL/min). Los
resultados fueron ajustados con el modelo modificado de Gompertz. La proteína se
determinó mediante la técnica de Bradford (1976) que utiliza azul de Coomassie.

39
7.8.1 Análisis de los resultados de producción de CO2.

Los datos experimentales en la producción de CO2 fueron ajustados con el modelo

modificado de Gompertz (ecuación 7.2), donde se obtienen los parámetros P, rm y λ
(Shi y Yu, 2004; Van Ginkel et al., 2001). Estos parámetros fueron estimados
utilizando la suma de cuadrados mínima del error (SCE) entre los datos
experimentales y los valores estimados del modelo y con ayuda de la función ―Solver‖
del Excell 2007.

 r  e 
G  P  exp  exp  m   t   1  (Ec. 7.2)
  P 
Donde:
G: Producción de CO2 (mmol L-1)
P: Producción máxima de CO2 (mmol L-1)
λ: Tiempo que dura la fase lag (h)
rm: velocidad inicial de producción de CO2 (mmol L-1 h-1).
e : 2.718

7.9 Diseño experimental para la evaluación de la producción de

biosurfactantes

Una vez confirmado que los microorganismos seleccionados son buenos candidatos
para producir biosurfactantes, se utilizó un diseño experimental del tipo Box-Behnken
de factorial 33 que permitió evaluar 3 condiciones a 3 niveles diferentes, modificando
las relaciones C/N, C/Fe y C/Mg. En la tabla 7.3 se muestra la estructura del diseño
utilizado.

Las relaciones se establecieron de acuerdo con lo reportado en la literatura

(Tabatabaee et al., 2005; Amezcua et al., 2004; Arino et al., 1996; Guerra-Santos et
al., 1984) ya que se consideran favorecedoras de la producción del biosurfactante y en
su efecto sobre la reducción de la tensión superficial y la prueba de dispersión. La
tabla 7.4 muestra el valor de las relaciones establecidas para el diseño experimental.

Para la evaluación de cada uno de los tratamientos del diseño experimental se

prepararon botellas serológicas de 125 mL que contenían 30 mL de medio cultivo, de

40
acuerdo con las relaciones ya establecidas para cada uno de los tratamientos, además
de los respectivos controles sin inocular. Todos los tratamientos se realizaron por
duplicado. El muestreo se llevó a cabo al tiempo 0, 24 y 48 h, donde se realizaron las
pruebas de dispersión y se midió la tensión superficial.

Tabla 7.3. Estructura del diseño experimental, tipo Box-Behnken de factorial 33.

No de Relación Relación Relación

Corrida C/N C/Fe C/Mg
1 -1 -1 0
2 -1 1 0
3 1 -1 0
4 1 1 0
5 -1 0 -1
6 -1 0 1
7 1 0 -1
8 1 0 1
9 0 -1 -1
10 0 -1 1
11 0 1 -1
12 0 1 1
13 0 0 0
14 0 0 0
15 0 0 0
(1) Relación alta, (0) Relación media, (-1) Relación baja

Tabla 7.4. Niveles de las relaciones de carbono con diferentes nutrientes.

Nivel Relación Relación Relación

C/N C/Fe C/Mg

-1 5 26,000 10

0 10 36,000 30

1 15 42,000 50

41
El medio mineral consistió de (g/L): glucosa 30; KCl, 1.1; Na Cl, 1.1; KH2PO4, 3.4;
K2HPO4, 4.4; y 5 mL de una solución de elementos traza; la cual contenía (g/L):
ZnSO4* 7H2O, 0.29; CaCl2* 4H2O,0.24; CuSO4*5H2O,0.25; MnSO4 H2O, 0.17. Estas
soluciones fueron esterilizadas por separado a 15 lb/15 min, de igual forma que las
soluciones de (NH4)2 SO4, FeSO4* 7H2O y MgSO4* 7H2O con las cuales se
mantuvieron las relaciones establecidas para el diseño (Tahzibi et al., 2004;
modificado).

El inóculo se preparó a partir de un matraz semilla de acuerdo con la sección 7.6,

pero en este caso se lavaron y resuspendieron las células con solución salina (Na Cl,
0.85 %). A cada sistema se le adicionaron 300 μL del inoculo; se incubaron a la
temperatura correspondiente (Tabla 7.1); con agitación de 115 rpm durante 24 h y 48
h. Al final de este periodo se realizaron las pruebas de dispersión y de tensión
superficial de acuerdo con lo establecido en la sección 7.5.1 y 7.5.3 respectivamente.

7.9.1 Análisis estadístico del diseño experimental

El análisis estadístico de los resultados del diseño experimental se llevo a cabo

utilizando el software STATISTICA V. 6.0. Además, se realizó el análisis de superficie
de respuesta para determinar el efecto de las variables.

7.10 Producción de biosurfactante a nivel reactor

Después de realizar el análisis estadístico del diseño experimental, se eligió el

tratamiento que más favoreció la producción del biosurfactante, para cada una de las
dos cepas; con el objeto de cultivarlas en una escala mayor (de matraz a reactor).

7.10.1 Preparación del cultivo en lote

Para llevar a una escala mayor la producción del biosurfactante se seleccionó el

cultivo en lote, en un reactor de 3 L, con un sistema de monitoreo y control de
temperatura, agitación y aireación (Fig. 7.4).

42
 Figura 7.4. Cultivo en lote de los tratamientos del diseño experimental.

De igual manera que para la preparación de los sistemas de tratamiento del diseño
experimental, se utilizaron las concentraciones del medio mineral (Tahzibi et al., 2004,
modificado) y las soluciones de las sales para mantener las relaciones C/N, C/Fe y
C/Mg establecidas para el mejor tratamiento, con un volumen operacional de cultivo de
1.5 L. Para el cultivo de la cepa control, Bacillus subtilis se utilizó caldo nutritivo (1.5 L)
en el reactor. Todas las soluciones, el reactor, así como las entradas de aire y salidas
fueron esterilizados a 15 lb/15 min.

Para inocular cada reactor se preparó un matraz semilla que contenía 75 mL del medio
de cultivo correspondiente al mejor tratamiento para la producción de biosurfactante
(sección 7.9) y caldo nutritivo para la cepa control. Se adicionaron 20 mL de inóculo en
el reactor; se controló la temperatura correspondiente a cada cepa (Tabla 6.1), con
agitación 100 rpm y un flujo de aire de 15 mL/min durante 48 h.

Durante este periodo se evaluó el crecimiento microbiano como densidad óptica a 620
nm y se realizaron las pruebas de dispersión, índice de emulsificación y de tensión
superficial de acuerdo con lo establecido en la sección 7.5.1 y 7.5.3 respectivamente.
Además se llevo a cabo la cuantificación de proteína, mediante la técnica de Bradford
(1976) y de azúcares por el método de fenol-sulfúrico (Dubois et al., 1956), a las 0, 24
y 48 h. Finalmente se evaluó el efecto del biosurfactante sobre petróleo crudo.

43
7.11 Evaluación del efecto del biosurfactante sobre un aceite pesado

Debido a sus características tensoactivas los biosurfactantes son potencialmente

candidatos a aplicaciones en la industria del petróleo como mejoradores del petróleo
(Rodrigues et al., 2006). De aquí el interés de llevar a cabo una prueba que de manera
rápida y fácil que pudiera evidenciar su efecto frente a un crudo. Para ello se utilizó
una placa de vidrio de 30 x 30 cm; en la superficie de esta se colocaron 6 gotas de
aceite pesado (15ºAPI) de aproximadamente 0.5 mL, después se adicionaron sobre
ellas 0.5 mL del sobrenadante previamente centrifugado (sección 7.3). La placa fue
puesta en una posición vertical, como lo muestra la figura 7.5, durante 1min.

Figura 7.5. Prueba para la evaluación del efecto del biosurfactante sobre petróleo
crudo.

El efecto del biosurfactante sobre el crudo fue evaluado como la distancia recorrida por
el hidrocarburo en la placa.

7.12 Extracción parcial del biosurfactante

El biosurfactante fue extraído parcialmente del sobrenadante por liofilización en un

equipo Labconco, en el Laboratorio de Biotecnología del IMP.

44
7.13 Identificación de los microorganismos productores de
biosurfactantes

Los microorganismos productores de biosurfactantes IMP-X e IMP-R fueron

identificados a través del gen 16s rRNA, en el Laboratorio de Biotecnología del IMP.

7.14 Conservación de las cepas

A fin de mantener la viabilidad de los microorganismos encontrados como productores

de biosurfactantes se conservaron por transferencia periódica y congelación.

7.14.1 Conservación por transferencia periódica

Se prepararon tubos inclinados con 15 mL de agar nutritivo para las cepas mesófilas y
en el caso de las cepas termófilas con 15 mL de caldo nutritivo con gelrita. Se
sembró por estría cada cepa y se incubaron durante 24 h a la temperatura
correspondiente. Al término de este periodo se sellaron con parafilm y se guardaron
en refrigeración.

7.14.2 Conservación en congelación

Las cepas fueron sembradas por asada en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 75
mL de caldo nutritivo e incubadas durante 24 h a la temperatura correspondiente y
con una agitación de 115 rpm. Posteriormente se transfirieron 1.2 mL de cada cultivo a
viales criogénicos y se les adiciono 0.325 mL de glicerol al 80% (esterilizado
previamente en tres ocasiones). Se congelaron a -70°C para su conservación.

45
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1 Caracterización macroscópica y microscópica de los

microorganismos seleccionados

El aislamiento de microorganismos productores de biosurfactantes de sitios extremos

es de especial interés debido a su capacidad para subsistir bajo dichas condiciones y
producir metabolitos tensoactivos.

La caracterización microscópica y macroscópica de las cepas seleccionadas, permitió

determinar algunas de sus características. Como parte de esta caracterización se
analizó la morfología colonial, donde se observaron colonias de diámetro no mayor a
5 mm, de color blanco o amarillo (Tabla 8.1). A nivel microscópico se observó que las
bacterias son Gram negativas: IMP-X (cocos-bacilos, Fig. 8.1a) IMP-R (bacilos largos,
Fig. 8.1b), IMP-T (bacilos, Fig. 8.1c), y el control Bacillus subtilis, Gram positivo
(bacilos, Fig. 8.1c).

Tabla 8.1. Caracterización macroscópica de las cepas IMP-X, IMP-R e IMP-T.

Morfología IMP-X IMP-R IMP-T B. subtillis
colonial
Tamaño 2-3 mm 2 mm 5 mm 2 mm
Forma Circular Circular Irregular Circular
Elevación Convexa Convexa Plana Plana
Borde Entero Entero Entero Ondulado
Color Blanco Blanco Amarilla Blanco
Superficie Lisa Lisa Lisa Rugoso
Aspecto Húmedo Seco Húmedo Húmedo
Consistencia Viscosa Suave Suave, Viscosa
Viscosa
Luz Reflejada Brillante Brillante Brillante Opaca
Luz Transmitida - - - -
(-)No se observó

46
 a) b)

c) d)

Figura 8.1. Observación microscópica de las cepas seleccionadas (tinción Gram

100x). a) IMP-X, coco-bacilos Gram negativo; b) IMP-R, bacilos largos Gram negativo;
c) IMP-T, bacilos Gram negativo; d) B. subtillis, bacilos Gram positivo.

Los microorganismos Gram negativos, provenientes de suelos contaminados con

hidrocarburos y/o a altas temperaturas, han sido reportados como productores de
biosurfactantes o bioemulsificadores (Cameotra y Makkar, 1998). Batista et al. (2006)
aislaron bacterias Gram negativas, de tres sitios brasileños contaminados con
hidrocarburos y sus productos, los cuales mostraron actividad emulsificante y
redujeron la tensión superficial del medio de cultivo. Otro ejemplo de bacterias Gram
negativo, es una especie de Flavobacterium sp., proveniente de un suelo arenoso,
reportada como productora del biosurfactante ―flavolípido‖, el cual se caracteriza
especialmente por contener en su parte polar ácido cítrico y dos moléculas de
cadaverina (Bodour et al., 2004).

Algunos de los microorganismos más estudiados como productores de biosurfactante

son las especies de Bacillus sp., entre ellos: B. subtilis (Ghojavad et al., 2008; Joshi et
al., 2008a; Joshi et al., 2008b; Toledo et al., 2008; Whang et al., 2008; Das y
Mukherjee, 2007; Youssef et al., 2007; Dehghan et al., 2005; Makkar y Cameotra,
1999; Sen, 1997), B. licheniformis (Ghojavand et al., 2008; Joshi et al., 2008b;
Gabbito, 2006; Thaniyavarn et al., 2003; Illias e Idris, 1999; Yakimov et al., 1997), B.

47
stearothermophilus VR-8 (Thaniyavarn et al., 2003), B. pamilus (Maneat y Phetrong,
2007), B. mojavensis (McInerney et al., 2004) y B. velecenzis (Ruiz-García, 2005).

El biosurfactante lipopeptídico denominado surfactina es producido por B. subtilis.

Otros lipopéptidos con actividad surfactante y/o actividad antibiótica han sido aislados
de especies de Bacillus. Por ejemplo: bacillomicina, iturina, micosubtilina, plipastatina,
surfactante BL86, halobacilina, y liquenisina A/B/G (Thaniyavarn et al., 2003).

8.2 Evaluación de la producción de biosurfactantes en diferentes medios

de cultivo

La producción de biosurfactantes, como todo proceso microbiológico, está influenciada

por una serie de factores ambientales que afectan directamente en la actividad
metabólica de los microorganismos productores. Puesto que el objetivo de este trabajo
fue encontrar las condiciones más adecuadas para que dicha producción se
incrementara, se probaron tres medios de cultivo para evaluar la capacidad de
producción de biosurfactantes con tres cepas aisladas de ambientes extremos. Dos de
los medios consistieron en una mezcla de sales inorgánicas y glicerol o una mezcla de
eicosano y hexadecano como fuerte de carbono, y el tercer medio fue caldo nutritivo.
La evaluación del potencial de producción de biosurfactantes fue realizada mediante
la prueba de dispersión y el índice de emulsificación (E24), dos pruebas que la
literatura reporta con frecuencia debido a que son técnicas fáciles, rápidas y factibles
(Tabatabaee et al., 2005; Youssef et al., 2004).

Los resultados de la prueba de dispersión y el índice de emulsificación (E24) se

muestran en la tabla 8.2. Las cepas IMP-R e IMP-T produjeron halos de dispersión de
hidrocarburo entre 0.6 y 0.8 cm con los tres medios de cultivo probados, en el caso de
la cepa IMP-X; solo el caldo nutritivo y medio mineral con glicerol mostraron resultados
significativos de 0.8 y 0.7 cm, respectivamente. Comparados estos resultados con sus
respectivos controles (con halos de 0 a 0.2 cm) se consideraron positivos. Cardoso et
al. (2010) obtuvieron halos de dispersión de aceite de 0.4 hasta 1.1 cm con Yarrowia
lipolytica, indicativo de la producción de biosurfactante con glucosa y glicerol como
sustrato. Morikawa et al. (2000) afirman que el área de dispersión que logra el
biosurfactante contenido en el medio disolvente es directamente proporcional a la
concentración del surfactante. Youssef et al. (2004) muestran que el diámetro de la
zona clara de dispersión se incrementa linealmente con la concentración de surfactina

48
producida por las especies de Bacillus, sobre un rango de concentración de 50-400
mg/L.

Tabla 8.2. Evaluación de la producción de biosurfactantes en diferentes medios de

cultivo con las tres cepas seleccionadas.

Cepas

Medio IMP-R (60°C)* IMP-T (60°C)* IMP-X (30°C)*

Prueba de E24 Prueba de E24 Prueba de E24

dispersión % dispersión % dispersión %
(Halo, cm) (Halo, cm) (Halo, cm)

Caldo nutritivo 0.8 57 0.7 62.2 0.8 62.2

Medio mineral 0.7 41.42 0.7 35 0.7 41.42

(glicerol)

Medio mineral 0.7 38.46 0.6 38.6 - 42.85

(eicosano-
hexadecano)
* Temperatura de aislamiento e incubación. E24: Indice de emulsificación a las 24 h. (-) No hubo
dispersión

El índice de emulsificación obtenido en el caso de la cepa IMP-R fue de 57% y para

IMP-T e IMP-X fue de 62.2% a diferencia de los controles donde no se observó
emulsificación. Los porcentajes representan el grado de emulsificación que logra el
biosurfactante sobre el queroseno, esto se debe a que los biosurfactantes son
productos activos de superficie que tienen la cualidad de modificar la tensión
superficial de los líquidos en los cuales se disuelven, y en consecuencia, la tensión
interfacial entre el disolvente, tensoactivo y las sustancias insolubles en él. Teniendo
como resultado los fenómenos de emulsificación, suspensión y detergencia (Hiemenz,
1986). Patel y Desai (1997) evaluaron la producción de biosurfactates por
Pseudomonas aeruginosa GS3 sobre cinco medios que contenían diferentes
concentraciones de sales inorgánicas y melaza, como fuente de carbono. Con melaza
al 7% (v/v) obtuvieron ramnolípidos, los cuales se evaluaron mediante el índice de
emulsificación con diferentes hidrocarburos. Los ramnolípidos fueron capaces de
emulsificar eficientemente hidrocarburos alifáticos y aromáticos, mezclas de

49
hidrocarburos, aceite de oliva y crudo; por ejemplo para el n-heptano se obtuvo un E24
de 74%, con n-decano de 70%, con benceno y tolueno de 73% y con aceite de oliva
de 62%. Este índice de emulsificación depende del tipo de aceite o hidrocarburo con el
que se realiza la prueba, ya que la estructura del mismo influye en su capacidad de
emulsión.

La composición química y la actividad tensoactiva, dispersante y emulsificante del

biosurfactante no depende solamente del microorganismo productor, sino también de
las condiciones de cultivo (Toledo e. al., 2008). Es por ello que los resultados
observados durante ambas pruebas (dispersión de aceite e índice de emulsificación)
demostraron la importancia de la composición del medio de cultivo.

En el presente trabajo, con el caldo nutritivo y el medio mineral con glicerol y eicosano-
hexadecano, los microroganismos evaluados lograron la dispersión del hidrocarburo
con halos de 0.6 a 0.8 cm. Youssef et al. (2004) compararon el grado de dispersión de
aceite con la tensión superficial de los cultivos de diferentes microorganismos,
encontrando una relación lineal inversa entre el diámetro de la zona clara y la tensión
superficial.

En cuanto a la prueba de emulsificación, los mejores resultados se obtuvieron con

caldo nutritivo para los tres microorganismos evaluados. Karant et al. (1999) y Batista
et al. (2006) explican que los compuestos de superficie activa producidos por
microorganismos son de dos tipos, los que reducen la tensión superficial en la
interface aire-agua (biosurfactantes) y los que reducen la tensión interfacial entre
líquidos inmiscibles o en las interfaces sólido-líquido (bioemulsificantes). Los
biosurfactantes usualmente exhiben capacidad de emulsificación, pero los
bioemulsificantes no necesariamente reducen la tensión superficial.

Por ello, con base en los resultados obtenidos en las pruebas de dispersión e índice
de emulsificación, a los biosurfactantes producidos por las cepas IMP-X, IMP-R e IMP-
T se les puede atribuir características de dispersarte y emulsificante, favoreciéndose
cuando son cultivados en caldo nutritivo. Por lo que se eligió este medio enriquecido
para continuar con el estudio de la producción de biosurfactantes por estos
microorganismos.

50
8.3 Evaluación del efecto de la temperatura sobre el crecimiento y
producción de biosurfactantes en caldo nutritivo

Para evaluar el crecimiento y la producción del biotensoactivo en caldo nutritivo se

llevaron a cabo cinéticas a diferentes temperaturas con cada uno de los
microorganismos seleccionados. La figura 8.2 describe el comportamiento de la cepa
IMP-R durante las cinéticas de crecimiento a temperaturas de 40, 50, 60 y 70°C, las
velocidades calculadas para cada una de ellas se muestran en la tabla 8.3. La
temperatura de 40°C resultó ser la óptima para el crecimiento de este microorganismo,
ya que fue con la que se obtuvo la mayor velocidad de crecimiento (µ=0.123 h-1). Los
diámetros de dispersión producidos con el sobrenadante de esta cepa cultivada a esta
temperatura fueron de 1.2 cm, lo que indica que este microorganismo es un productor
potencial de biosurfactantes.

En general, se observa que la producción del biosurfactante inicia en la fase

exponencial, con diámetros de dispersión entre 0.9 y 1.4 cm para todas las
temperaturas, sin embargo a 60°C la dispersión de aceite se mantiene durante más
tiempo (Tabla 8.4). Lo anterior indica que a esta temperatura, la cepa IMP-R tiene un
periodo más estable de producción de biosurfactantes, a pesar de que su velocidad de
crecimiento disminuye a la mitad (µ=0.06 h-1) de la producida a 40º C. Es por ello, que
para subsecuentes experimentos se decidió continuar cultivando esta cepa a 60º C.
Además de considerar que la producción de metabolitos (biosurfactantes y/o
polímeros) a mayores temperaturas (arriba de 50º C) puede tener aplicación en
sistemas con condiciones similares a las de su producción donde pueden ser termo-
resistentes, como es el caso de la recuperación mejorada de hidrocarburos por
microorganismos (MEOR) en yacimientos.

51
 Tabla 8.3. Velocidades de crecimiento a diferentes temperaturas.

Velocidad de crecimiento (µ) (h-1)

Cepa 30°C 40°C 50°C 60°C 70°C

IMP-R Nd 0.123 0.023 0.066 0.019

IMP-T Nd 0.018 0.013 0.036 0.032

IMP-X 0.185 0.025 0.069 Nd Nd

B.subtilis 0.027 0.0286 Nd Nd Nd

Nd: No determinado

1.6
Crecimiento microbiano
(D.O a 620 nm)

1.2

0.8

0.4

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)

40 C 50 C 60 C 70 C

Figura 8.2. Cinéticas de crecimiento de la cepa IMP-R a 40, 50, 60 y 70°C; en caldo
nutritivo con agitación de 115 rpm.

52
 Tabla 8.4. Evaluación de la dispersión de aceite con la cepa IMP-R.
Tiempo
(h) Diámetro de la dispersión (cm)
40°C 50°C 60°C 70°C
0 0.4 0.4 0.4 0.5
2 0.4 0.5 0.4 0.4
4 0.4 0.5 0.4 0.4
22 0.4 0.7 1.2 0.7
24 1.2 0.8 1.2 0.7
26 0.8 1.1 1.2 1.4
28 0.8 1.2 1.2 1.0
46 0.8 0.9 0.8 0.7
52 0.8 0.7 0.8 0.6
56 0.8 0.6 0.8 0.6
72 0.8 0.5 0.8 0.5

En la figura 8.3 se muestra el crecimiento de la cepa IMP-T a diferentes temperaturas,

donde se observa que el mejor crecimiento fue a 60°C, con la mayor velocidad de
crecimiento de 0.036 h-1 (Tabla 8.3). Con todas las temperaturas evaluadas para esta
cepa, se lograron dispersiones de hidrocarburo de 0.7 y 0.8 cm (Tabla 8.5). Sin
embargo, es en la temperatura óptima de crecimiento (60º C) donde el halo producido
permanece en un intervalo de 0.7-0.8 cm durante mayor tiempo. Si se ubican los
tiempos en los que se registraron estos tamaños de halo sobre la figura 8.3, éstos se
encuentran al inicio de la fase exponencial y en el inicio de la fase estacionaria.

Las cinéticas de crecimiento y producción de biosurfactante de la cepa IMP-X se

llevaron a cabo a la temperatura de aislamiento (30º C) y a 40 y 50º C. La figura 8.4
muestra el comportamiento de la cepa en cada una de las temperaturas evaluadas, se
encontró una producción de biosurfactantes desde la fase exponencial, ya que fue en
ésta donde se ubican los diámetros mayores de la prueba de dispersión de aceite, con
dispersiones estables a 30°C (Tabla 8.6), temperatura que de acuerdo con las
velocidades de crecimiento (Tabla 8.3) es la que resulta más favorable para su
desarrollo.

53
 1.2

1
Crecimiento microbiano

0.8
(D.O a 620 nm)

0.6

0.4

0.2

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)

40 C 50 C 60 C 70 C
Figura 8.3 Cinéticas de crecimiento de la cepa IMP-T a 40, 50, 60 70°C; en caldo
nutritivo con agitación de 115 rpm.

Tabla 8.5 Evaluación de la dispersión de aceite con la cepa IMP-T.

Tiempo
(h) Diámetros de dispersión (cm)

40°C 50°C 60°C 70°C

0 0.4 0.5 0.4 0.4
2 0.4 0.4 0.4 0.4
4 0.5 0.5 0.7 0.5
22 0.7 0.8 0.7 0.8
24 0.7 0.8 0.8 0.8
26 0.7 0.6 0.8 0.8
28 0.7 0.6 0.7 0.6
46 0.7 0.6 0.7 0.5
52 0.7 0.5 0.7 0.6
56 0.7 0.5 0.7 0.5
72 0.7 0.5 0.7 0.5

54
 3

2.5
Crecimiento microbiano

2
(D.O a 620 nm)

1.5

0.5

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)

30 C 40 C 50 C

Figura 8.4 Cinéticas de crecimiento de la cepa IMP-X a 30, 40 y 50°C; en caldo

nutritivo con agitación de 115 rpm.

Tabla 8.6 Evaluación de la dispersión de aceite con la cepa IMP-X.

T(h) Diámetros de la dispersión (cm)
30°C 40°C 50°C
0 0.4 0.3 0.4
2 0.4 0.4 0.5
4 0.4 0.4 0.5
22 0.4 0.5 1.0
24 0.7 0.5 0.5
26 0.7 0.5 0.5
28 0.7 0.6 0.5
46 0.7 0.7 0.5
52 0.7 0.7 0.5
56 0.7 0.7 0.5
72 0.7 0.7 0.5

55
La cepa control B.subtilis fue evaluada a tres temperaturas 30, 40 y 50°C. Este
microorganismo a 40ºC tuvo una velocidad de crecimiento (0.028 h-1) similar a la
obtenida a 30°C (0.0270). Siendo 40°C la temperatura óptima reportada para este
microorganismo (Stainer et al., 1996). Sin embargo si se observa la figura 8.5 y la tabla
8.10, que muestran el desempeño de este microorganismo, la mejor producción de
biosurfactante fue a 30°C, ya que las dispersiones logradas con el sobrenadante son
mayores y estables (Tabla 8.7). Por lo que se seleccionó la temperatura de 30º C para
subsecuentes experimentos con este microorganismo. A la temperatura de 50º C no
se observó crecimiento de este microorganismo.

1.6
Crecimiento microbiano
(D.O a 620 nm)

1.2

0.8

0.4

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)

30 C 40 C 50 C

Figura 8.5 Cinética de crecimiento de B.subtilis a 30, 40 y 50°C; en caldo nutritivo con
agitación de 115 rpm.

56
 Tabla 8.7 Evaluación de la dispersión de aceite con B. subtillis.

Diámetros de dispersión (cm)

T(h) 30°C 40°C 50°C
0 0.5 0.5 Nd
2 0.5 0.5 Nd
4 0.5 0.5 Nd
22 0.5 0.5 Nd
24 0.5 0.5 Nd
26 0.7 0.6 Nd
28 0.7 0.6 Nd
46 0.7 0.6 Nd
52 0.7 0.6 Nd
56 0.7 0.6 Nd
72 0.7 0.6 Nd
Nd, no determinado

Las cinéticas de los tres microorganismos evaluados, evidenciaron que no todas las
temperaturas de muestreo fueron las óptimas para el crecimiento de éstos, como en el
caso de la cepa IMP-R con temperatura óptima de crecimiento de 40 ºC, pero a 60º C
mostró mayor capacidad de producción de biosurfactantes; por lo que para su cultivo y
producción de este metabolito, se decidió continuar con esta temperatura.

La cepa IMP-R e IMP-T son microorganismos aislados de aguas termales, por lo que
la respuesta de la cinética es resultado de su capacidad para desarrollarse en
ambientes extremos, al igual que otros microorganismos reportados en la literatura
(Ghojavand et al., 2008; Joshi et al., 2008; Plaza et al., 2006; Jinfeng et al., 2005; Illias
et al., 1999). Banat (1993) aisló Bacillus sp., termotolerante, productor de
biosurfactantes a temperaturas por arriba de los 50°C con un medio que contenía
hidrocarburo. Busscher et al. (1994) aislaron Streptococos termofílicos de sitios con
altas temperaturas de la industria de lácteos.

La cinética de crecimiento de la cepa IMP-X, mostró su capacidad para crecer a

temperaturas mayores a la de su aislamiento (30 oC), sin embargo la producción más
significativa de biosurfactante se registró a esta misma temperatura, por lo que se
puede incluir en el amplio conjunto de microorganismos mesófilos productores de

57
biosurfactantes. Guerra-Santos et al. (1984) y Dehghan et al. (2005), entre otros, han
reportado la producción de lipopéptidos y ramnolípidos por B.subtilis y P.aeruginosa a
temperaturas de 37°C.

La producción de biosurfactantes por Pseudomonas aeruginosa, también ha sido

reportada a una temperatura de 30°C, utilizando aceite de girasol como fuente de
carbono (Benicasa y Accorsini, 2008).

8.3.1 Cinéticas en caldo nutritivo a la temperatura de mejor respuesta en la

producción del biosurfactante

Para evaluar la producción de biosurfactantes mediante la determinación de la tensión

superficial, se llevaron a cabo las cinéticas de crecimiento y producción de este
metabolito en caldo nutritivo a la temperatura en la que se evidenció la mayor
producción con las pruebas de dispersión (ver sección 8.3). Además se evaluó la
cantidad de proteínas y CO2 producidos, lo que permitió analizar la actividad
metabólica de los microorganismos; así como la reducción en la tensión superficial,
respuesta más directa de la producción del biotensoactivo (Plaza et al., 2006).

La figura 8.6 muestra los resultados obtenidos durante la cinética de crecimiento de la

cepa IMP-R a 60 °C, con una velocidad de crecimiento (µ) de 0.0313 h-1 y tiempo de
duplicación de 22 h aproximadamente. En la figura 8.7 se muestra la producción de
biosurfactante mediante la determinación de la tensión superficial y la prueba de
dispersión, se observa que es en la fase exponencial donde se alcanza el máximo
diámetro del halo de 1.1 cm y una tensión superficial de 46 mN/m (19 unidades
reducidas). Este tipo de comportamiento es atribuido a la producción de
biosurfactantes asociada al crecimiento. Desai y Banat (1997), afirman que existe una
relación paralela entre el crecimiento, la utilización de sustrato y la producción del
biosurfactante. Por lo que durante la fase exponencial el biosurfactante se acumula en
la superficie de las células y es liberado en el medio cuando la síntesis de proteínas
decrece.

Prabhu y Phale (2003), evaluaron el papel del biosurfactante producido Pseudomonas

sp. PP2 cultivada con fenantreno, concluyendo que los cambios en la hidrofobicidad
de la superficie de la célula son dependientes del crecimiento y que la actividad

58
emulsificante sugiere que la producción del biosurfactante es constitutiva y está
asociada al crecimiento. Persson et al. (1988) reportaron la producción extraceluar de
biosurfactante asociada al crecimiento por Pseudomonas flourecens 378 usando un
medio semisintético, a un pH óptimo de 8 y obteniendo una tensión superficial de 27
mN/ m en solución acuosa.

En el caso de la cepa IMP-T su comportamiento durante su cinética de crecimiento a

60°C, mostró poca actividad metabólica en la producción del biosurfactante, ya que la
tensión superficial solo se redujo en 2 unidades (Fig. 8.9a), con halos de dispersión de
aceite de 0.7 cm (Fig. 8.9 b); diámetros que también se observaron en la cinética
anterior; con una velocidad de crecimiento de 0.0423 h-1 y con un tiempo de
duplicación de 16 h (Fig. 8.8a). Lo que significa que no necesariamente la disminución
de la tensión superficial está relacionada con la dispersión del hidrocarburo como ha
sido reportado por otros trabajos (Youssef et al., 2004). En este caso la producción del
biosurfactante fue mucho menor comparada con la cepa IMP-R a 60 ºC.

Las figuras 8.10 y 8.11 muestran el comportamiento de la cepa IMP-X durante su

cinética de crecimiento a 30°C, con una velocidad de crecimiento (µ) de 0.152 h-1 y un
tiempo de duplicación (td) de 5 h aproximadamente. La actividad productora de
biosurfactante de este microorganismo, logró reducir la tensión superficial en 34
unidades (31 mN/m) con diámetros de dispersión de 1.2 cm. Para este
microorganismo si existe una relación directa entre la dispersión de aceite lograda por
el biosurfactante y la disminución de la tensión superficial.

59
 1.4 350
a)
1.2 300
Crecimiento microbiano

1 µ=0.0313 h-1 250

(D.O a 620 nm)

t=22.14 h

Proteína (mg/L)
0.8 200

0.6 150

0.4 100

0.2 50

0 0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano Proteína

1.4 70
b)
1.2 60
Crecimiento microbiano

1 50

(mmoles CO2/ L)
(D.O a 620 nm)

0.8 40 CO2

0.6 30

0.4 20

0.2 10

0 0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano CO2

Figura 8.6 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-R a 60°C, con caldo nutritivo. a)
Cuantificación de proteína; b) producción de CO2.

60
 1.4 65
a)
1.2
60

Tensión superficial (mN/m)

Crecimiento microbiano

1
(D.O a 620 nm)

55
0.8

0.6
50

0.4
45
0.2

0 40
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano Tensión superficial

1.4 1.2
b)
1.2

Diámetro de dispersión (cm)

1
Crecimiento microbiano

1
(D.O a 620 nm)

0.8
0.8
0.6

0.4
0.6

0.2

0 0.4
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano Diámetro de dispersión

Figura 8.7 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-R a 60°C con caldo nutritivo y
evaluación de: a) Tensión superficial; b) diámetro de dispersión.

61
 1.4 300
a)
1.2 250
Crecimiento microbiano

1 μ=0.042 h-1
200

Proteína (mg/L)
t=4.55 h
(D.O a 620 nm)

0.8
150
0.6
100
0.4

0.2 50
b)
0 0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)

Crecimiento microbiano Proteína

1.4 60
b)
1.2 50
Crecimiento microbiano

1
40
(D.O a 620 nm)

CO2 (mmoles /L)

0.8
30
0.6
20
0.4

0.2 10

0 0
0 20 40 60 80

Tiempo (h)
Crecimiento microbiano CO2

Figura 8.8 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-T a 60°C con caldo nutritivo: a)
Cuantificación de la proteína; b) producción de CO2.

62
 1.4 65.5
a)
1.2

Tension superficial (mN/m)

65
Crecimiento microbiano

1
64.5
(D.O a 620 nm)

0.8
64
0.6
63.5
0.4

0.2 63

0 62.5
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano Tensión superficial

1.4 0.8
b)
1.2

Diámetro de dispersión (cm)

Crecimiento microbiano

0.7
1
(D.O a 620 nm)

0.8
0.6
0.6

0.4
0.5

0.2

0 0.4
0 20 40 60 80

Tiempo (h)

Crecimiento microbiano Diámetro de dispersión

Figura 8.9 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-T a 60°C con caldo nutritivo y
evaluación de: a) Tensión superficial; b) diámetro de dispersión.

63
 4 300

3.5
a) 250
Crecimiento microbiano

3
200
(D.O a 620 nm)

Proteína (mg/L)
2.5 μ=0.1522 h-1
td=4.55 h
2 150

1.5
100
1
50
0.5

0 0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano Proteína

4 60

3.5
b) 50
Crecimiento microbiano

CO2 (mmoles /L)

40
(D.O a 620 nm)

2.5

2 30

1.5
20
1
10
0.5

0 0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano CO2

Figura 8.10 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-X a 30°C, con caldo nutritivo: a)
Cuantificación de la proteína; b) producción de CO2.

64
 4 70
a)
3.5
60

Tensión superficial (mN/m)

Crecimiento microbiano

3
(D.O a 620 nm)

2.5 50
2

1.5 40

1
30
0.5

0 20
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano Tensión superficial

4 1.4
b)
3.5
1.2

Diámetro de dispersión (cm)

Crecimiento microbiano

3
1
(D.O a 620 nm)

2.5

2 0.8

1.5
0.6
1
0.4
0.5

0 0.2
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Crecimiento microbiano Diámetro de dispersión

Figura 8.11 Cinética de crecimiento de la cepa IMP-X a 30°C con caldo nutritivo y
evaluación de: a) Tensión superficial; b) diámetro de dispersión.

65
La mayor reducción de la tensión superficial y dispersiones se observaron en la fase
exponencial de las cinéticas de las cepas IMP-R e IMP-X, por lo tanto la producción
del biosurfactante está asociada al crecimiento. Arino et al. (1996) reportan el mismo
comportamiento durante la cinética de crecimiento de Pseudomonas sp; ya que es en
esta etapa donde la producción de los glicolípidos aumenta. De la misma manera que
sus similares Pseudomonas fluorescens y Pseudomona aeuroginosa (Persson et al.,
1988; Patel y Desai, 1997) incrementaron la producción de ramnosa durante la fase
exponencial del crecimiento a 30 °C, donde se tienen tiempos de duplicación similares
al de la cepa IMP-X de 5 h aproximadamente.

La determinación de la cantidad de proteínas y el CO2 producido permitieron analizar

la actividad metabólica de los microorganismos durante su crecimiento y producción
del biosurfactante. La evaluación de la producción de CO2 es una medida indirecta de
la actividad microbiana en los cultivos, e indica el consumo de la fuente de carbono.
En las figuras 8.6 b, 8.8 b y 8.10 b de las cepas IMP-R, IMP-T y IMP-X,
respectivamente, se puede observar la producción de CO2.

Los datos experimentales de producción de CO2 durante las cinéticas fueron ajustados
con el modelo modificado de Gompertz (Shi y Yu, 2004). Este modelo describió los
datos con coeficientes de correlación de 0.98 para las cepas IMP-R e IMP-T; y 0.97 en
el caso de la cepa IMP-X, además se obtuvieron otros parámetros cinéticos como la
producción máxima (Pmax), velocidad de producción (rmax) y fase de adaptación (λ)
(Tabla 8.8). La máxima producción de CO2 fue de 68.6 mmoles / L, correspondiente a
la cepa IMP-R. La velocidad máxima de producción de CO2 se obtuvo con la cepa
IMP-R, similar a la obtenida para la cepa IMP-X.

El CO2 además de otros productos como el acetato, lactato, etanol y 2-3 butanodiol
han sido estudiados como indicativos de la producción de biosurfactantes por especies
de Bacillus en laboratorio y en campo (Youssef et al., 2007).

66
Tabla 8.8. Parámetros cinéticos de la producción de CO2 obtenidos con el modelo de
Gompertz de las cepas IMP-R, IMP-T e IMP-X.
Producción Velocidad de Fase lag Coef. de
máxima de CO2 producción CO2 correlación

Pmax rmax λ r2

Cepa
(mmoles CO2/L) (mmoles CO2/L d) h
IMP-R 68.597 1.387 8.601 0.987
IMP-T 59.233 0.855 7.522 0.989
IMP-X 53.800 1.280 11.989 0.979

8.4 Optimización de la producción de biosurfactantes

De los resultados obtenidos en la sección 8.2, se observó que el mejor medio de

cultivo para la producción de biosurfactantes fue el caldo nutritivo; sin embargo, para
llevar a cabo la producción de este compuesto y hacer económicamente factible su
aplicación, se necesita utilizar materias primas de bajo costo. Por lo que en lugar de
caldo nutritivo, el medio se cambió por uno mineral con glucosa como fuente de
carbono.

Los diseños experimentales sirven para evaluar varios factores a diferentes niveles,
reduciendo el tiempo y el costo del desarrollo experimental. Además el análisis de los
resultados a través de la metodología de superficie de respuesta ayuda modelar y
estudiar problemas en los cuales una respuesta de interés está afectada por diferentes
variables, obteniendo la optimización de dicha respuesta (Mutalik et al., 2008;
Rodrigues et al., 2006; Sen, 1997).

En este trabajo se utilizó un diseño experimental Box-Behnken de factorial 33 que

permitió evaluar 3 variables (relaciones C/N, C/Fe y C/Mg) a 3 niveles (Tablas 7.3 y
7.4) para determinar su efecto sobre la producción de biosurfactantes por las cepas
IMP-X e IMP-R.

67
 Los resultados de tensión superficial y dispersión de aceite con la cepa IMP-X después
de 24 y 48 h de incubación a 30º C, se muestran en la tabla 8.9. Se puede observar
que el biosurfactante producido no disminuyó la tensión superficial en más de 10
unidades en la mayoría de los tratamientos a las 24 h; sin embargo el tratamiento No 1
(C/N 5, C/Fe 26 0000, C/Mg 30) logró disminuirla hasta 33 unidades. Este resultado
también fue corroborado con la prueba de dispersión, obteniendo el máximo halo de
dispersión de 1.3 cm, respecto a su control.

Tabla 8.9 Resultados del diseño experimental Box-Behnken para la cepa IMP-X
(30°C).
24 h 48 h
No de Tensión Unidades Prueba de Tensión Unidades Prueba de
tratamiento superficial de T.S dispersión superficial de T.S dispersión
(mN/m) reducidas (cm) (mN/m) reducidas (cm)
1 30 33 1.3 33 30 1.1
2 49 13 1 49 13 1
3 61 2 0.4 53 10 0.7
4 62 0 0.4 57 5 0.9
5 57 5 0.9 44 18 1
6 62 0 0.4 47 15 1
7 59 3 0.7 58 4 0.9
8 58 4 0.8 35 27 1.2
9 53 10 0.9 44 19 0.9
10 51 11 0.9 47 15 0.9
11 53 10 0.8 51 12 0.9
12 53 10 0.9 57 6 0.8
13 45 19 1.1 45 19 1.1
14 52 12 0.6 45 19 1
15 52 12 0.6 45 19 1

Después de 48 h de incubación, se observa que la disminución de la tensión

superficial se incrementó en algunos tratamientos de la cepa IMP-X, comparada con la
obtenida a las 24 h. El tratamiento No. 1 disminuyó ligeramente su efecto sobre la
tensión superficial (30 unidades reducidas), lo que indica que la producción del

68
 surfactante se mantuvo hasta las 48 h. El tratamiento No. 8 (C/N 15, C/Fe 36 000,
C/Mg 50) también logró disminuir la tensión en 27 unidades a las 48 h.

En el caso de la cepa IMP-R, los resultados de la producción de biosurfactantes

(tensión superficial y dispersión de aceite) después de 24 y 48 h de incubación a 60º C
se muestran en la tabla 8.10. A las 24 h no se observan cambios significativos en la
tensión superficial, ni en dispersión de aceite. A las 48 h de incubación, con los
tratamientos No. 9 (C/N 10, C/Fe 26 000, C/Mg 10) y No. 12 (C/N 10, C/Fe 36 000,
C/Mg 50) este microorganismo logró disminuir la tensión superficial en 37 unidades y
producir halos de dispersión de 1.2 cm; lo que indica que fueron condiciones
favorecedoras de la producción de biosurfactante.

Tabla 8.10. Resultados del diseño experimental Box-Behnken para la cepa IMP-R
(60°C).
24 h 48 h
No de Tensión Unidades Prueba de Tensión Unidades Prueba de
tratamiento superficial de T.S dispersión superficial de T.S dispersión
(mN/m) reducidas (cm) (mN/m) reducidas (cm)
1 58 9 0.6 44 23 0.9
2 65 2 0.5 55 10 0.8
3 63 4 0.5 53 14 0.8
4 55 12 0.6 47 20 0.9
5 62 5 0.5 44 23 0.9
6 65 2 0.5 45 22 0.9
7 63 2 0.4 58 7 0.7
8 60 5 0.4 55 10 0.8
9 60 7 0.4 30 37 1.2
10 63 2 0.4 46 19 0.9
11 58 9 0.5 50 17 0.9
12 58 9 0.5 30 37 1.1
13 60 7 0.4 42 25 0.9
14 60 7 0.4 43 24 0.9
15 60 7 0.4 42 25 0.9

69
8.4.1 Análisis estadístico del diseño experimental

El análisis estadístico del diseño experimental permitió construir un modelo adecuado

para ajustar y estimar la producción de biosurfactante, con base en la tensión
superficial y en términos de las relaciones C/N, C/Fe y C/Mg. Los resultados fueron
ajustados a un modelo de 3 factores considerando los términos lineales, cuadráticos y
sus interacciones. Se obtuvo el análisis de varianza, valores predichos, coeficientes de
regresión y superficies de respuesta del diseño experimental para cada una de las
cepas de estudio con el software Statistica v 6.

En la ecuación. 8.1 se muestra, el modelo cuadrático aplicado a los resultados de la

cepa IMP-X.

T.S.=45+0.5x1+4.25x2+2.225x3-0.375x12+3.75x22+1.375x32+1.375x1x2-6.5x1x3 +0.75x2x3
+6.5x1x22+ 0.75x12x2-2.225x12x3...........................................................................(Ec. 8.1)

Donde: T.S.es la tensión superficial, x1, x2 y x3 son los términos codificados de la

variables independientes, C/N, C/Fe y C/Mg respectivamente.

El análisis ANOVA (Tabla A3.1) muestra que el modelo cuadrático fue altamente
significativo, como se evidencia con en el análisis de Fisher del modelo (F= 105.59).
Comparando este valor con F de tablas (F0.05, 12,17, = 2.38) a un nivel de significancia (α)
de 0.05, se puede observar que Fmodelo es mayor que Ftabla. Lo anterior indica que el
modelo cuadrático fue adecuado para describir los valores de tensión superficial
observados, con un coeficiente de correlación (R2) de 0.98676, por lo que solo el
1.324% del total de la variación no es explicado por el modelo.

En la figura 8.12 se observa la correlación de los valores predichos y observados de

tensión superficial. Los valores observados están distribuidos cerca de la línea recta, lo
que muestra que son muy parecidos a los valores predichos (R2= 0.98676).

70
 Observed vs. Predicted Values
3 3-level factors, 1 Blocks, 30 Runs; MS Residual=1.176471
DV: Tensiòn superficial
65
65

60
60

55
Valores predichos

55
50
Predicted Values

50
45
45
40
40
35

35
30

25
30
30
25 3035 35 40 40 45 45 50 50 5555 60
60 65
65
Observed Values
Valores observados

Figura 8.12. Reducción de la tensión superficial observada vs. reducción de la tensión

superficial predicha del diseño experimental de la cepa IMP-X.

El valor de t (t-student) representa la relación entre el efecto de los parámetros

estimados con su desviación estándar. Por otra parte el valor de p es usado como una
herramienta para determinar la significancia de cada uno de los coeficientes. Mientras
mayor sea la magnitud de t y menor el valor de p más importante es la variable en el
modelo de regresión múltiple (Yetilmezoy et al., 2009).

De acuerdo con el ANOVA y los resultados de la regresión múltiple (Tablas A3.1 y

A3.2), el componente más significativo del modelo fue la interacción entre las variables
C/N y C/Mg (t=16.94, p<0.0001, F=287.30), seguido por la relación C/N (t=16.9,
p<0.0001, F=285.94) y la relación C/Fe (t= 16.61, p<0.0001, F= 276.16). La grafica de
Pareto (Fig 8.13) muestra que de los componentes del modelo, las interacciones entre
x12x2 (t= 1.383, p=0.185, F= 1.91), x2x3 (t= 1.956, p=0.067, F= 3.82) y x12 (t= 0.9395,
p=0.3606, F=0.88) no tiene efecto significativo sobre la variable repuesta, ya que se
encuentran por debajo de la línea donde p=0.05. Por otro lado en el porcentaje de
contribución (PC) calculado para cada uno de los términos se observa que la mayor
contribución está dada por los factores lineales x1 (20.35%) y x2 (19.66%), así como la
interacción x1x3 (20.45). En general, el mayor efecto fue dado por los factores de
primer orden con un PC de 45.8%. Estos resultados muestran la influencia de las

71
 variables de estudio sobre la tensión superficial y por lo tanto sobre la producción de
biosurfactante.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Tensiòn superficial
3 3-level factors, 1 Blocks, 30 Runs; MS Residual=1.176471
DV: Tensiòn superficial

x1x3
1Lby3L -16.9499

x1
(1)C/N(L) 16.90976
x2
(2)C/Fe(L) 16.61821
2x
x1 3
1Qby3L 13.36834
x1x2 2
1Lby2Q -11.9854
x3
(3)C/Mg(L) -9.03798
x22
C/Fe(Q) -8.45565
x1x2
1Lby2L -7.82304
x3 2
C/Mg(Q) -3.4449
x2x3
2Lby3L 1.955761
2x
x1 2
1Qby2L -1.38293
2
xC/N(Q)
1 .9395171

p=0.05
p=.05
Efecto estimado
Effect Estimate (valorValue)
(Absolute absoluto)
Figura 8.13. Grafica de Pareto muestra los efectos de las variables C/N, C/Fe y C/Mg
sobre la tensión superficial del modelo correspondiente a la cepa IMP-X.

Las superficies de respuesta del análisis del diseño experimental, en función de 2 de

las variables independientes, manteniendo la tercera en un nivel fijo, permitió entender
los efectos principales y sus interacciones.

En las figuras. 8.14 y 8.15 se presentan las superficies de respuesta más significativas
para la cepa IMP-X. La naturaleza no lineal de las superficies de respuesta demuestra
que existen interacciones entre las variables independientes y el cambio en la tensión
superficial.

En la figura 8.14 se observa el efecto de las relaciones C/N y C/Fe sobre la tensión
superficial, con la relación C/Mg fija a un valor de 30. La mejor respuesta fue con las
relaciones C/N y C/Fe más bajas, lo que implica que mayor contenido de nitrógeno y
de hierro favorece la producción de biosurfactante. En la figura 8.15 se presentan los
efectos entre las variables C/Fe y C/Mg, manteniendo la relación C/N constante en un
valor de 5. La respuesta más favorable se obtuvo con las relaciones de C/Fe menores

72
(26,000) y C/Mg a un valor intermedio de 30. Con base en estas dos superficies de
respuesta, los valores óptimos para la producción de biosurfactantes por la cepa IMP-
X fueron C/N de 5, C/Fe de 26,000 y C/Mg de 30. Estas relaciones de nutrientes
coinciden con el tratamiento No. 1, el cual disminuyó la tensión superficial hasta 33
mN/m. Tensión superficial (mN/m)

60

50

40

30

1 60
1 55
50
45
0 40
0 35
30

-1 -1

Figura 8.14. Superficie de respuesta de la cepa IMP-X (30º C) durante el diseño

experimental, cuando la relación C/Mg es de 30 (media).

73
 70
Tensión superficial (mN/m)

50

30

1
1
50
45
0 0
40
35
30

-1 -1

Figura 8.15. Superficie de respuesta de la cepa IMP-X (30º C) durante el diseño

experimental, cuando la relación C/N es de 5 (baja).

Para la cepa IMP-R, la ecuación que describe el modelo cuadrático en función de las
tres variables independientes (C/N, C/Fe y C/Mg) y de la variable de respuesta
(tensión superficial) se presenta en la ecuación 8.2.

T.S.= 42.3+6 x1+9.45 x12+ x2-2.04 x22- x3-1.29 x32-4.25 x1x2-5.75 x1x22+0.25 x12x2-
x1x3+0.5 x12x3-9 x2x3………………………………………………..Ec. 8.2

Donde T.S. es la tensión superficial; x1, x2 y x3 son los términos de las variables
independientes C/N, C/Fe y C/Mg respectivamente, en su forma codificada.

Los resultados del análisis de varianza (ANOVA), muestran que el modelo cuadrático
tiene alto grado de significancia, ya que el valor de la prueba de Fisher del modelo (F =
136.43), fue mayor a la F de tablas (F 0.05, 12, 17= 2.38) a un nivel de significancia (α) de
0.05 (Tabla A3.3). Lo anterior también fue corroborado con el coeficiente de

74
correlación (R2) de 0.98972, lo que indica que el modelo cuadrático propuesto fue
adecuado para describir los valores experimentales obtenidos y solo el 1.08% no fue
explicado por éste.

Los valores predichos contra los valores observados de la tensión superficial se

muestran en la figura 8.16. Se observa una correlación alta entre los valores
experimentales y los predichos; por lo tanto el modelo es adecuado para predecir la
tensión superficial, bajo las correspondientes condiciones experimentales.

Observed vs. Predicted Values

3 3-level factors, 1 Blocks, 30 Runs; MS Residual=1.137255
DV: T.S
65
65

60
60

55
55
Valores predichos

50
50
Predicted Values

45
45

40
40

35
35

30
30

25
25
25
25 30
30 35
35 40
40 45
45 50
50 55
55 60
60 65
65
Observed Values
Valores observados
Figura 8.16. Reducción de la tensión superficial observada vs. reducción de la tensión
superficial predicha del diseño experimental de la cepa IMP-R.

Con base en los resultados del análisis ANOVA y la regresión múltiple (Tabla A3.4), el
componente más significativo del modelo es el término cuadrático de la relación C/N
(t= -24.1, p<0.0001, F= 580.9) y la interacción entre la relación C/Fe y C/Mg (T=-23.87,
p>0.0001, F=569.79). En la figura 8.17 se muestra que las interacciones x12x2 (t= 0.47,
p=0.1645, F= 0.22). y x12x3 (t= 0-94, p=0.362, F= 0.88) no tuvieron un efecto
significativo sobre la variable repuesta, ya que se encuentran por debajo de la línea de
p=0.05. Con en el porcentaje de contribución (PC) calculado para cada uno de los
términos también se muestra que la mayor contribución está dada por el término
cuadrático de la variable x1 (38.16%) y la interacción x2x3 (37.43) que corresponde a la

75
relación C/N y la interacción C/Fe y C/Mg respectivamente. En general, el mayor
efecto fue dado por las interacciones de los términos lineales de las variables con un
PC de 46.23%.

La medición de la tensión superficial para los diferentes tratamientos mostró una

variación de 58 a 30 mNm-1 esto indica que las variables estudiadas afectan de
manera importante la reducción de la tensión superficial y por lo tanto la producción
del biosurfactante.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: T.S
3 3-level factors, 1 Blocks, 30 Runs; MS Residual=1.137255
DV: T.S

2
xC/N(Q) -24.1018
1
x2Lby3L
2x3 -23.8703
x1Lby2L
1x2 -11.2721
x1x22
1Lby2Q 10.78373
x1
(1)C/N(L) 7.709824
x2 2
C/Fe(Q) 5.202593
x2
(2)C/Fe(L) 4.151443
x32
C/Mg(Q) 3.291437
x1Lby3L
1x3 -2.65226
x3
(3)C/Mg(L) -2.37225
2x
x1 3
1Qby3L -.937715
2x
x1 2
1Qby2L -.468858

p=.05
p=0.05
Effect Estimate
Efecto estimado (Absolute
(valorValue)
absoluto)

Figura 8.17. Distribución de Pareto muestra los efectos de las variables C/N, C/Fe y
C/Mg sobre la tensión superficial del modelo correspondiente a la cepa IMP-R.

En la figura 8.18 se observa el efecto de las relaciones C/N y C/Fe sobre la tensión
superficial, con la relación C/Mg fija a un valor de 50. La mejor respuesta fue con las
relaciones C/N media y C/Fe alta, lo que implica que menor contenido de nitrógeno y
de hierro favorece la producción de biosurfactante. En la figura. 8.19 se presentan los
efectos entre las variables C/N y C/Mg, manteniendo la relación C/Fe constante en un
valor de 42000. La respuesta más favorable se obtuvo con las relaciones de C/N
media (10) y C/Mg a un valor alto de 50. Con base en estas dos superficies de
respuesta, los valores óptimos para la producción de biosurfactantes por la cepa IMP-

76
R fueron C/N de 10, C/Fe de 42,000 y C/Mg de 50. Estas relaciones de nutrientes
coinciden con el tratamiento No. 12, el cual disminuyó la tensión superficial hasta 30
mN/m.

70
Tensión superficial (mN/m)

60

50

40

30

60
1
55
1 50
45
0 40
0 35
30

-1 -1

Figura 8.18 Superficie de respuesta de la cepa IMP-R (60º C) durante el diseño

experimental, cuando la relación C/Mg es de 50 (alta).

77
 70
Tensión superficial (mN/m)
60

50

40

30
65
1 60
55
1
50
45
0 40
0 35
30

-1 -1

Figura 8.19 Superficie de respuesta de la cepa IMP-R (60º C) durante el diseño

experimental, cuando la relación C/Fe es de 42000 (alta).

8.4.2. Efecto del nitrógeno sobre la producción de biosurfactante

Uno de los nutrientes que afecta la producción de biosurfactante es el nitrógeno, y esto

depende de su naturaleza y cantidad en el cultivo (Mulligan y Gibbs, 1989). Se ha
observado que la limitación de nitrógeno incrementa la producción de biosurfactantes
en Pseudomonas (Sildatk et al., 1985). Aunque también se ha encontrado la
producción de ramnolípidos con Pseudomonas utilizando una relación C/N de 12.24
(Silva et al., 2010) y producción de glicolípidos por P. aeruginosa con una relación C/N
de 11.73 (Arino et al., 1996). Relaciones C/N mayores a los valores anteriores, no
favorecieron la producción de biosurfactantes con Pseudomonas (Silva et al., 2010).

En el presente trabajo, las relaciones C/N que favorecieron la producción del

biosurfactante fueron de 5 y 10 para las cepas IMP-X y IMP-R, respectivamente. De
manera similar Wu et al. (2008) encontraron alta producción de biosurfactante con una
relación C/N de 8.77 y 15.17, con cultivos optimizados que incrementaron en un 47%
el rendimiento del biosurfactante.

78
Haba et al. (2000) encontraron que al variar la concentración de nitrógeno, la cantidad
de ramnolípidos producidos fue mayor con una relación C/N de 8 seguida de una C/N
de 5.7 por P. aeruginosa, valor parecido al obtenido en el tratamiento 1 con una C/N
de 5 en el presente trabajo.

8.4.3. Efecto del hierro y magnesio en la producción de biosurfactante

Los cationes multivalentes son otro de los factores determinantes en la producción de

biosurfactantes. Guerra-Santos et al. (1986) demostraron que la limitación de las
concentraciones de sales de magnesio, calcio, potasio y elementos traza repercuten
en el rendimiento de ramnolípidos por P. aeruginosa DSM 2659. Sin embargo, se
recomienda elevar las concentraciones de hierro de nivel micromolar a milimolar para
mejorar la producción de surfactina por B. subtilis ATCC 21332 (Wei y Chu, 1998).
Kiran et al. (2009) reportan un incremento en la producción de biosurfactante con
FeSO4 y MgCl2 a una concentración de 0.1 mM, pero el incremento de estas sales
inhibió la producción de biosurfactante.

Makkar y Cameotra (2002) encontraron que la interacción de los cationes favorece la

producción de biosurfactantes por Bacillus subtilis MTCC 2423. La máxima
productividad de biosurfactante la obtuvieron con 2.43 mM de de Mg2+, sin embargo
concentraciones mayores a 9.74 mM inhibieron la producción de biosurfactante. En
cuanto al hierro, la concentración óptima de FeSO4 fue de 0.719 mM, obteniendo una
tensión superficial de 32 mN/m y concentraciones mayores a 11.5 mM inhibieron la
producción de biosurfactante.

Guerra-Santos et al. (1984) reportaron que la más alta concentración de biosurfactante

por P. aeruginosa fue alcanzada a una relación C/Fe de 72,000. Relaciones de este
orden también han sido reportadas para Pseudomonas putida, observando que
relaciones de C/Fe (26,000) incrementan la productividad del biosurfactante (Amezcua
et al., 2004). Estas relaciones son similares a las utilizadas en el presente trabajo. La
cepa IMP-X mostró cambios en la tensión superficial cuando fu cultivada con una
relación C/Fe de 26,000, logrando disminuir la tensión superficial a 33 mN/m y de
42,000 para la cepa IMP-R, con una tensión superficial de 30 mN/m.

Najafi et al. (2011) evaluaron la producción de biosurfactante con Paenibacillus alvei

ARN63, con una relación C/Fe de 25,879 y MgSO4 a una relación C/Mg de 104.24,

79
reduciendo la tensión superficial del medio a 35 mN/m. Tahzibi et al. (2004) produjeron
altos niveles de ramnolípidos con P. aeruginosa utilizando una relación C/Fe de
428,571, C/N de 9.71 y C/Mg de 492.3 con 6% de glucosa, alcanzando una tensión
superficial de 28 mN/m. Por otro lado la relación C/Mg que favoreció la disminución de
la tensión superficial fue de 30 y 50 para las cepas IMPX e IMP-R, respectivamente.

Lo anterior implica que las relaciones C/N, C/Fe y C/Mg óptimas para la producción de
biosurfactantes dependen del tipo de microorganismo, de las condiciones de cultivo y
de la interacción de estos componentes.

Con base en este análisis se seleccionaron los mejores tratamientos para llevar a cabo
el escalamiento de la producción de biosurfactantes a nivel reactor con las cepas IMP-
X e IMP-R.

8.5 Producción de biosurfactante a nivel reactor

La producción de biosurfactante se llevo a cabo en un reactor utilizando los

microorganismos seleccionados y los mejores tratamientos del diseño experimental.
Para cada microorganismo se evaluó su cinética de de crecimiento y producción de
biosurfactante.

Las figuras 8.20 y 8.21 muestran las cinéticas de las cepas IMP-X e IMP-R,
respectivamente. Con la cepa IMP-X se logró una mayor reducción de la tensión
superficial (Tabla 8.11) con 38.7 unidades, en cambio para la cepa IMP-R fue de 27.9
unidades.

La producción de biosurfactante también fue evaluada mediante las pruebas de

dispersión y actividad emulsificante que producen los sobrenadantes de los sistemas
con cada uno de los microorganismos. La cepa IMP-X fue la que tuvo el mayor halo de
dispersión (1.1 cm) y la mayor actividad emulsificante (71.4%).

En el caso de la cepa IMP-X, se observa que la producción del biosurfactante inicia en

la fase exponencial de crecimiento (Fig. 8.20) y se mantiene durante la fase
estacionaria al igual que cuando se cultiva con caldo nutritivo (sección 8.2) lo que
indica que la producción del metabolito está asociada al crecimiento (Bant, 1995;

80
Desai y Banat, 1997; Ferraz et al., 2002; Toledo et al., 2008). Para la cepa IMP-R, la
producción del biosurfactante también inicia en la fase exponencial del crecimiento.

2.5 70

Tensión superficial (mN/m)

60
Crecimiento microbiano
(D.O a 620 nm)

1.5
50
1

40
0.5

0 30
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

Crecimiento microbiano Tensión superficial

Figura 8.20 Crecimiento de la cepa IMP-X durante su cultivo en reactor y evaluación

de la producción de biosurfactante mediante la medición tensión superficial.

81
 0.4 65

0.35
60

Tension superficial (mN/m)

0.3
Crecimiento microbiano
(D.O a 620 mn)

0.25 55
0.2

0.15 50

0.1
45
0.05

0 40
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

Crecimiento microbiano Tensión superficial

Figura 8.21 Crecimiento de la cepa IMP-R durante su cultivo en reactor y evaluación

de la producción de biosurfactante mediante la medición tensión superficial.

El consumo de azúcares fue similar en ambos microorganismos (del 66 al 69 %), sin

embargo la producción de biomasa fue mayor con la cepa IMP-X (594 mg/L) a 30°C,
mientras que con la cepa IMP-R que crece a 60º C, solo se produjeron 202 mg/L de
biomasa, por debajo del 50% con respecto a la cepa mesófila.

La cepa control B. subtilis cultivada en caldo nutritivo a 30 °C, mostró producción del
biosurfactante durante la fase exponencial y estacionaria (Fig. 8.22), reduciendo la
tensión superficial hasta 30.2 mN/m, produciendo 507 mg/L de biomasa y un consumo
de azúcares de 67%.

82
 2.5 70

65
2

Tension superficial (mN/m)

Crecimiento microbiano

60
(D.O a 620 nm)

1.5
55
1
50

0.5
45

0 40
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)

Crecimiento microbiano Tensión superficial

Figura 8.22. Crecimiento de B. subtilis durante su cultivo en reactor y evaluación de la

producción de biosurfactante mediante la medición tensión superficial.

También se llevaron a cabo mediciones de tensión interfacial con hexadecano para los
sobrenadantes de los cultivos microbianos. Los resultados mostraron reducciones de
37.9 a 1.48 mN/m para los microorganismos (IMP-X e IMP-R) cultivados en reactor.
De acuerdo con lo reportado por Mulligan (2005) los mejores biosurfactantes son
aquellos que son capaces de reducir la tensión interfacial de 40 hasta 1 mN/m. Por lo
tanto se considera que los biosurfactantes producidos por las cepas IMP-X e IMP-R
tienen buena actividad tensoactiva.

Los biosurfactantes fueron separados de los sobrenadantes de los cultivos de las

cepas IMP-X, IMP-R y B. subtillis mediante liofilización. En la tabla 8.12 se presentan
los rendimientos obtenidos con cada liofilizado, los cuales corresponden al producto
crudo (biosurfactante) obtenido de cada microorganismo. La cepa IMP-X fue el
microorganismo con el que se obtuvo el mayor rendimiento de bisurfactante (21.6 g/L),
seguido de la cepa IMP-R (20 g/L), estos rendimientos son similares a los reportados
en otros trabajos con microorganismos donde han obtenido 21 g/L de soforolípidos
(Solaiman et al., 2004) y 24.3 g/L de ramnolípidos por P, aeruginosa UW1 (Rahman et

83
al., 2002). Estos resultados demuestran la factibilidad de la producción de
biosurfactantes bajo las condiciones de cultivo propuestas, por los microorganismos
provenientes de sitios extremos y contaminados con hidrocarburos.

Tabla 8.11. Evaluación de la cinética de crecimiento y producción de biosurfactantes.

Cepa Tiempo Biomasa Consumo P.D. T.S. E24 T.I.
(Temp. (Proteína) azúcares
incubación)
(h) (mg/L) (%) (halo, cm) (mN/m) (%) (mN/m)
IMP-X 0 2.0 0 0 69.9 0 37.9
(30º C) 24 452.7 41.9 1.1 35.8 65.7 nd
48 594.1 66.9 1.0 31.2 71.4 1.81

IMP-R 0 2.0 0 0 69.9 0 37.5

(60º C) 24 150.9 43.2 0.6 46.7 58.6 nd
48 202.7 69.6 0.9 42 67.1 1.72

Bacillus 0 2.9 0 0 68.55 0 35.8

subtilis 24 240.9 32.9 1.1 48.85 62.9 nd
(30º C) 48 507.3 67.1 1.1 40.3 68.6 1.48
Temp: temperatura, P.D: prueba de dispersión de aceite, TS: tensión superficial, T.I: tensión
interfacial; E24: actividad emulsificante, nd: no determinado.

Tabla 8.12. Producto crudo obtenido después del proceso de extracción por
liofilización.
Peso del producto Rendimiento de
Microorganismo
crudo producto crudo
(g) (g /L)
B. subtillis 9 15.0
IMP-X 13 21.6
IMP-R 14 20.0

84
8.6 Efecto del biosurfactante sobre un aceite pesado

Debido a la importancia del papel de los biosurfactantes como mejoradores de flujo se

llevo a cabo una prueba para evidenciar la acción del biosurfactante producida sobre
un aceite pesado (15° API). La figura 8.23 muestra la actividad del biosurfactante
presente en los sobrenadantes de las cepas IMP-X, IMP-R y B. subtilis. Las distancias
recorridas por el crudo, después de haber estado en contacto con el sobrenadante de
los cultivos y sus respectivos controles (Tabla 8.13), fueron mayores en el caso de las
cepas IMP-X y IMP-R con 16.9 y 18 cm, respectivamente. Al compararlos con la línea
del control (9.3 cm, únicamente aceite pesado) se puede observar que el
desplazamiento del hidrocarburo casi se duplico, lo cual supone la acción del
biosurfactante presente en el sobrenadante sobre el aceite; esto debido a sus
propiedades tensoactivas lo que le permite modificar la viscosidad del hidrocarburo.

Los biosurfactantes pueden mejorar las propiedades reológicas de los aceites, entre
ellas la disminución de su viscosidad (Ilias et al., 1999), permitiendo que puedan ser
desplazados con mayor facilidad dentro del yacimiento y en tubería; por lo que pueden
ser utilizados como mejoradores de flujo (Bognolo, 1999). Además, al disminuir la
tensión superficial e interfacial entre los fluidos del yacimiento permiten la liberación
del aceite y por lo tanto incrementan la recuperación del mismo (Kitamoto et al., 2002).
Es por esta razón que los resultados de la prueba indican la influencia del
biosurfactante producido por las cepas IMP-X e IMP-R sobre un aceite pesado.

85
 Control Cepa Cepa
CN B. subtilis M.M
IMP-R IMP-X

12 cm

Figura 8.23. Evaluación del efecto del biosurfactante producido por los
microorganismos IMP-R, IMP-X y Bacillus subtilis, sobre un aceite pesado de 15 ºAPI.
CN: caldo nutritivo, MM: medio mineral.

Tabla 8.13. Desplazamiento de hidrocarburo.

Controles Microorganismos

Aceite CN Medio Bacillus IMP-R IMP-X

pesado mineral subtilis

Desplazamiento 9.3 11.5 7.6 10.4 16.9 18

del aceite
pesado (cm)
C.N: caldo nutritivo, M.M: medio mineral

86
8.7 Identificación de los microorganismos productores de biosurfactantes

El aislamiento de microorganismos productores de biosurfactantes de sitios extremos y

sitios contaminados con hidrocarburos es de especial interés debido a su capacidad
de subsistir bajo dichas condiciones y producir metabolitos tensoactivos.

La cepa IMP-X es un coco-bacilo Gram-negativo que fue aislado de un suelo

contaminado con hidrocarburos de Veracruz, México. Identificada mediante pruebas
bioquímicas (Tabla A4.1) con el sistema API 20 E como Serratia sp. con una
confiabilidad de 97.5%.

A través del análisis del gen 16s rRNA se identificó a la cepa IMP-X como Serratia
marcescens, perteneciente a la familia de las Enterobacterias. A diferencia de la
mayoría de las especies de esta familia S. marcescens es única por su producción de
exoenzimas y exolípidos. Este microorganismo produce el biosurfactante exolípido
serraewetina (Tanikawa et al., 2006; Matsuyama et al., 2011). Se ha reportado la
producción de biosurfactantes (5.8 g/L) por S. marcescens utilizando sacarosa como
fuente de carbono con una reducción de tensión superficial de 68 a 27 mN/m (Pruthi y
Cameotra, 1997). En el presente trabajo, con la cepa IMP-X se obtuvo un rendimiento
mayor de biosurfactante de 21 g/L con un valor de tensión superficial de 31 mN/m.

La producción de biosurfactantes con S. marcescens también ha sido evaluada con

compuestos hidrofóbicos, como el glicerol y aceites vegetales. Con glicerol han
obtenido un rendimiento de 20 g/L de arabinolípido (Bidlan et al., 2007), valor similar al
obtenido en el presente trabajo; con aceite de girasol este microorganismo fue capaz
de reducir la tensión superficial a 29.75 mN/m (Ferraz et al., 2002). Esto nos permite
ampliar las perspectivas de optimización de la producción y aplicación de
biosufactantes por la cepa IMP-X, si se utilizan otros tipos de sustratos.

En cuanto a la cepa IMP-R es un bacilo largo Gram-negativo, aislado de aguas

termales de Jalisco, México. Este microorganismo fue identificado como Geobacillus
thermoleovorans a través del análisis del gen 16s rRNA.

Diferentes especies de Geobacillus han sido estudiadas como productoras de lípidos,

como fosfolípidos (Siristova et al., 2009). Sin embargo pocas de ellas han sido
reportadas con características biotensoactivas. G. thermoleovorans ha sido reportado
como degradador de fenol a 65º C (Feitkenhauer et al., 2003); y aunque la producción

87
de biosurfactantes por bacterias está frecuentemente relacionada a la degradación de
hidrocarburos, existen pocos trabajos de especies de Geobacillus productoras de
estos metabolitos con evidencia de componentes de superficie activa (Marchat y
Banat, 2010). Wang et al. (2007) reportaron la producción de biosurfactantes por G.
thermolevorans, el cual fue capaz de disminuir la tensión superficial del medio hasta
32.17 mN/m.

88
9. CONCLUSIONES

Los microorganismos IMP-X, IMP-R e IMP-T aislados de sitios contaminados con

hidrocarburos y extremos de México, mostraron capacidad productora de
biosurfactantes.

El caldo nutritivo y la temperatura de aislamiento de los microorganismos evaluados

(IMP-X, IMP-R e IMP-T) favorecieron en mayor medida la producción del
biosurfactante.

De los microorganismos evaluados, los que tuvieron mejor producción de

biosurfactantes fueron las cepas IMP-X e IMP-R. La producción de biosurfactantes por
estos microorganismos está asociada con el crecimiento microbiano ya que inicia en la
fase exponencial.

El cambio de medio de cultivo (caldo nutritivo) por uno mineral con glucosa como
fuente de carbono, no afectó la producción del biosurfactante por la cepa IMP-X,
manteniéndose con una disminución de la tensión superficial de 30 a 33 unidades. En
cambio con la cepa IMP-R se lograron mejores resultados disminuyendo la tensión
superficial en 37 unidades.

El diseño experimental Box-Behnken y el análisis de superficie de respuesta

permitieron evaluar el efecto de las relaciones C/N, C/Fe y C/Mg sobre la producción
de biosurfactantes, encontrando que:

 El modelo cuadrático fue adecuado para describir los valores de tensión

superficial del diseño experimental de las cepas IMP-X e IMP-R.

 El componente más significativo del modelo para la cepa IMP-X fue la

interacción entre las variables C/N y C/Mg y el mayor efecto fue dado por los
factores de primer orden.

 Mientras que en el caso de la cepa IMP-R el término cuadrático de la relación

C/N fue el componente más significativo del modelo y el mayor efecto estuvo
dado por los términos lineales de las variables.

89
  Las relaciones óptimas para la producción de biosurfactantes por la cepa IMP-
X fueron C/N de 5, C/Fe de 26,000 y C/Mg de 30 y en el caso de la cepa IMP-R
C/N de 10, C/Fe de 42,000 y C/Mg de 50.

 Las relaciones de nutrientes (C/N, C/Fe y C/Mg) afectan la producción de

biosurfactantes, pero dependen del tipo de microorganismo y de las
condiciones de cultivo.

Las mejores condiciones de nutrientes para la producción de biosurfactante con la

cepa IMP-X fueron escaladas a nivel reactor, corroborando y validando estos
resultados. En el caso de la cepa IMP-R su escalamiento a nivel reactor, con el mejor
resultado de nutrientes del diseño experimental, mostró ligeramente una disminución
en la producción de biosurfactante evaluada como tensión superficial (de 37 a 30
unidades disminuidas).

Los biosurfactantes producidos por las cepas IMP-X e IM-R fueron capaces de
emulsificar queroseno, disminuir la tensión interfacial entre el sobrenadante y
hexadecano e incrementar la movilidad de un hidrocarburo pesado (15º API).

Se identificó a las cepas IMP-X e IMP-R como Serratia marcescens y Geobacillus

thermolevorans, respectivamente.

Estos microorganismos tienen potencial aplicación en la industria del petróleo, como

mejoradores de flujo, en la recuperación mejorada de hidrocarburos y en la
biorremediación.

90
10. PERSPECTIVAS

De acuerdo a los resultados encontrados en esta investigación, los microorganismos

seleccionados mostraron capacidad para producir biosurfactantes, y aunque se evaluó
el efecto de algunos substratos y otros nutrientes (N, Fe y Mg) sobre dicha producción,
para complementar este trabajo se sugiere realizar lo siguiente:

 Evaluar otras fuentes de carbono de bajo costo sobre la producción de

biosurfactantes, de tal manera que se pueda reducir los costos de producción y
hacer competitiva su utilización comparada con los surfactantes químicos.

 Los biosurfactantes producidos por los microorganismos seleccionados deben

ser purificados y caracterizados.

 Evaluar su actividad a diferentes temperaturas, pH, y salinidades, para

determinar su espectro de aplicación.

 Evaluar su producción a mayor escala.

 Evaluar su aplicación sobre diferentes tipos de aceite.

 Determinar las modificaciones que provocan en los aceites (viscosidad,

disminución tensión superficial e interfacial entre fluidos).

 Evaluar su aplicación en un medio poroso dirigido al incremento de la

recuperación de hidrocarburos.

 Evaluar su aplicación en la biodegradación de contaminantes en suelo y agua.

 Evaluar su producción in situ en yacimientos petroleros, para la recuperación

de hidrocarburos y en sitios contaminados con hidrocarburos u otros
contaminantes para su biodegradación.

91
11. REFERENCIAS

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102
 12. ANEXOS
ANEXO 1

MEDIOS DE CULTIVO

A continuación se presentan los diferentes medios de cultivo utilizados.

a) Medio de Cultivo Sólido para Mesófilas Aerobias (30º):

*Agar Nutritivo
Peptona 5 g/L
Extracto de Levadura 3 g/L
Agar 15 g/L
pH final 6.8±0.2

b) Medio de Cultivo Sólido para Termofilas Aerobias (60 °C):

Gelrita 15 g/L
Glucosa 5 g/L
MgCl2 6H2O 0.25g/L

Disolver la gelrita en 800 mL de agua, posterior mente adicionar los 200ml restantes
con la glucosa y el Cloruro de Magnesio disueltos; agitar y esterilizar a 121°C 15 lb de
presión.

Medios de Cultivo Líquido

*Caldo Nutritivo

*Medio mineral adicionado con Hidrocarburo (MHC)

KH2PO4 0.4g/L
K2HPO4 1.6g/L
NH4Cl 1.5g/L
MgCl2 6H2O 0.17g/L
NaSO4 7H2O 0.79g/L
CaCl2 2H2O 0.045g/L
Solución mineral 1.0ml/L

103
 Mezcla de Hexadecano/Eicosano 1ml/L
pH final 6.8
Las sales se disuelven en el orden señalado, posteriormente se ajusta el pH a 6.8
adicionando hidróxido de sodio (NaOH) 1N o ácido clorhídrico (HCl) 1N. Se esteriliza a
15 lb/15 min y posteriormente se agrega 1ml de la mezcla de hexadecano/eicosano , y
finalmente la solución mineral (1ml por litro de medio), previamente esterilizada, la cual
contiene las siguientes sales:

MgCl2 6H2O 5.1g/L

MnCl2 2H2O 0.66g/L
NaCl 1.0g/L
FeCl3 6H2O 1.0g/L
CaCl2 2H2O 0.1g/L
CuCl2 0.01g/L
ZnCl2 0.08g/L
AlCl3 0.05g/L
H3BO3 0.01g/L
Na2MoO4 0.04g/L

*Médio mineral con Glicerol (MG)

KH2PO4 0.4g/L
K2HPO4 1.6g/L
NH4Cl 1.5g/L
MgCl2 6H2O 0.17g/L
NaSO4 7H2O 0.79g/L
CaCl2 2H2O 0.045g/L
Solución mineral 1.0ml/L
Glicerol 1g/L
pH final 6.8

Las sales se disuelven en el orden señalado, posteriormente se ajusta el pH a 6.8

adicionando hidróxido de sodio (NaOH) 1N o ácido clorhídrico (HCl) 1N. Se
esteriliza a 15 lb/15 min y posteriormente se agrega 1g de glicerol (0.79ml), y

104
finalmente la solución mineral (1ml por litro de medio), previamente esterilizada, la
cual contiene las siguientes sales:

MgCl2 6H2O 5.1g/L

MnCl2 2H2O 0.66g/L
NaCl 1.0g/L
FeCl3 6H2O 1.0g/L
CaCl2 2H2O 0.1g/L
CuCl2 0.01g/L
ZnCl2 0.08g/L
AlCl3 0.05g/L
H3BO3 0.01g/L
Na2MoO4 0.04g/L

105
ANEXO 2

1. Calibración del tensiometro DuNouy

1. Sujetar el, brazo nivelador con los tornillos D.

2. Remover cuidadosamente el anillo del contenedor.
3. Limpiar el anillo en una flama, colocándolo momentáneamente en la zona
oxidante (roja). Flamear únicamente la porción del anillo que estará sumergida
en el líquido a medir y no sobrecalentar para evitar que se deforme o afloje de
su soporte.
4. Para calibraciones posteriores limpiar el anillo según sección 4.1 del manual de
uso de equipo.
5. colocar el anillo limpio y seco en el gancho H con mucho cuidado, teniendo la
precaución de no doblarlo.
6. Cortar una tira de papel y colocarlo sobre el anillo en forma de plataforma.
7. Liberar el brazo nivelador y girar el botón A hasta que el índice I se libere y su
imagen en el espejo esté en línea con la línea de referencia del espejo.
8. Liberar el sujetador del dial C y rotar el dial por medio del ajuste fino F hasta
que el Vernier lea exactamente cero.
9. Apretar el sujetador del dial C y rotar el dial por medio del ajuste fino F hasta
que el Vernier lea exactamente cero.
10. Colocar sobre el papel una masa con peso conocido entre 500 y 800 mg.
11. Girar el botón A hasta que el índice I este nuevamente puesto a la línea de
referencia.
12. Registrar la lectura del dial con un error aproximado de 0.01.
13. Determinar cual debería ser la lectura del dial con la siguiente ecuación:

P = Mg/2L

Donde:

P = Lectura del dial o tensión superficial aparente en dinas/cm

M = Peso que se coloca en el anillo sobre el papel expresado en gramos.

g = Valor de la gravedad del lugar donde será usado el tensiómetro, expresada en

cm/seg2. Para chicago es de 980.3 cm/seg2.

106
 L = Circunferencia media (promedio de la circunferencia interna y externa) del
anillo. Para el tensiómetro 70545 es de 5.992 cm dada en el contenedor del anillo.

14. Si la lectura registrada es más grande que el valor calculado por 0.5 dinas/cm,
ajuste la tuerca G para acortar el brazo nivelador. Si la lectura del dial es menor
que el valor calculado por 0.5 dinas/cm ajuste la tuerca G para alargar el brazo.
15. Repetir el procedimiento de calibración reajustando la posición cero con el
papel sobre el anillo después de cada ajuste de la tuerca G hasta que la lectura
del dial este de acuerdo con la calculada.
16. si el tensiómetro ha sido correctamente calibrado cada unidad del dial
representa exactamente una tensión superficial o interfacial de 1 dina/cm.
17. Después de que la calibración ha sido completada, remover el papel del anillo y
ajustar nuevamente a la posición cero. Girar el botón A hasta que el índice I su
imagen especular este exactamente en línea con a línea del espejo.
18. Liberar el sujetador del dial C y rotar el dial hasta que el cero esté cercano a la
posición del cero del vernier. Apretar el sujetador y con el tornillo fino realizar
un ajuste fino hasta que quede en cero.
19. El tensiometro está listo para usarse.

2. Determinación proteínas por la técnica de Azul de Coomassie.

Para llevar a cabo la determinación de proteínas por medio del la técnica de Azul
de Coomassie se debe realizar lo siguiente:

1. Hidrolizar 300 μL de la muestra de interés. Para ello es necesario agregar 1.2

mL de solución salina al 0.85% y 1.5 mL de NaOH a un tubo de ensaye de 10
mL. Agitar las muestras y ponerlas en baño Maria durante una hora.

2. Dejar enfriar.

3. Cuantificar las proteínas colocando 0.5 mL de cada hidrolizado en un tubo de

ensayo y adicionar 0.5 mL del reactivo de Coomassie. Agitar y leer después de
5 min a 620 nm.

4. Posteriormente hacer el análisis respectivo interpolando en la curva para

proteínas de albúmina a 620 nm.

107
ANEXO 3

Tabla A3. 1. Análisis de Varianza (ANOVA) del modelo de superficie de la cepa IMP-
X.
Factor SC gl SCM F p
Modelo 1490.67 12 124.22 105.59
x1 336.40 1 336.40 285.94 <0.0001
2
x1 1.04 1 1.04 0.88 0.3606
x2 324.90 1 324.90 276.16 <0.0001
x22 84.12 1 84.12 71.50 <0.0001
x3 96.10 1 96.10 81.68 <0.0001
2
x3 13.96 1 13.96 11.87 0.0031
x1x2 72.00 1 72.00 61.20 <0.0001
x1x22 169.00 1 169.00 143.65 <0.0001
x12x2 2.25 1 2.25 1.91 0.1846
x1x3 338.00 1 338.00 287.30 <0.0001
2
x1 x3 210.25 1 210.25 178.71 <0.0001
x2x3 4.50 1 4.50 3.82 0.0671
Error 20.00 17 1.18
Total 1510.67 29

SC,suma de cuadrados; gl, grados de libertad; SCM, suma de cuadrados media; p,

probabilidad.

108
Tabla A3.2 . Regresión múltiple y el grado de significancia de los componentes para el
modelo cuadrático de la cepa IMP-X.

Error
Factor Coeficiente Efecto estandar t(17) p PC, %
Intercept 45.000
x1 0.500 9.667 0.571 16.9098 <0.0001 20.357
x12 -0.375 0.375 0.399 0.9395 0.361 0.063
x2 4.250 9.500 0.571 16.6182 <0.0001 19.661
2
x2 3.375 -3.375 0.399 -8.4557 <0.0001 5.090
x3 2.250 -5.167 0.571 -9.0380 <0.0001 5.815
x32 1.375 -1.375 0.399 -3.4449 0.003 0.845
x1x2 -3.000 -6.000 0.766 -7.8230 <0.0001 4.357
x1x22 6.500 -6.500 0.542 -11.9854 <0.0001 10.227
x12x2 0.750 -0.750 0.542 -1.3829 0.185 0.136
x1x3 -6.500 -13.000 0.766 -16.9499 <0.0001 20.454
2
x1 x3 -7.250 7.250 0.542 13.3683 <0.0001 12.723
x2x3 0.750 1.500 0.766 1.9558 0.067 0.272
PC, porcentaje de contribución

109
Tabla A3.3. Análisis de Varianza (ANOVA) del modelo de superficie de la cepa IMP-R.
Factor SC gl SCM F p
Modelo 1861.87 12 155.16 136.43
x1 67.60 1 67.60 59.44 <0.001
2
x1 660.63 1 660.63 580.90 <0.001
x2 19.60 1 19.60 17.23 0.001
x22 30.78 1 30.78 27.07 <0.001
x3 6.40 1 6.40 5.63 0.030
2
x3 12.32 1 12.32 10.83 0.004
x1x2 144.50 1 144.50 127.06 <0.001
x1x22 132.25 1 132.25 116.29 <0.001
x12x2 0.25 1 0.25 0.22 0.645
x1x3 8.00 1 8.00 7.03 0.017
2
x1 x3 1.00 1 1.00 0.88 0.362
x2x3 648.00 1 648.00 569.79 <0.001
Error 19.33 17 1.14
Total 1881.20 29
SC, suma de cuadrados; gl, grados de libertad; SCM, suma de cuadrados media; p,
probabilidad.

110
Tabla A3.4. Regresión múltiple y el grado de significancia de los componentes para el
modelo cuadrático de la cepa IMP-R.
Error
Factor Coeficiente Efecto estandar t(17) p PC, %
Interc. 42.333
x1 6.000 4.33 0.56 7.71 <0.0001 3.90
x12 9.458 -9.46 0.39 -24.10 <0.0001 38.16
x2 1.000 2.33 0.56 4.15 0.001 1.13
2
x2 -2.042 2.04 0.39 5.20 <0.0001 1.78
x3 -1.000 -1.33 0.56 -2.37 0.030 0.37
x32 -1.292 1.29 0.39 3.29 0.004 0.71
x1x2 -4.250 -8.50 0.75 -11.27 <0.0001 8.35
x1x22 -5.750 5.75 0.53 10.78 <0.0001 7.64
2
x1 x2 0.250 -0.25 0.53 -0.47 0.645 0.01
x1x3 -1.000 -2.00 0.75 -2.65 0.017 0.46
x12x3 0.500 -0.50 0.53 -0.94 0.362 0.06
x2x3 -9.000 -18.00 0.75 -23.87 <0.0001 37.43
PC, porcentaje de contribución

111
ANEXO 4

Tabla A4.1. Resultados de las pruebas bioquímicas con el sistema API 20E para la
cepa IMP-X.

Prueba Resultado Prueba Resultado

Β-galactosidasa + Glucosa +

Alanina deshidrolasa - Manitol +

Lisina - Inositol +
descarboxilasa

Ornitina + Sorbitol +
descarboxilasa

Utilización de citrato + Ramnosa -

Producción de ácido - Sacarosa +

sulfihídrico (H2S)

Ureasa + Melobiosa +

Triptofano - Amigdalina +
deamidasa

Indol - Arabinosa +

Acetoína + Oxidasa -

Hidrólisis de gelatina +

(+) positivo;( -) negativo

112