ESQUEMA GENERAL

SESIN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un

plsmido para que adquieran resistencia a un antibitico

SESIN 2: AISLAR el plsmido mediante la tcnica

de
Lisis alcalina

SESIN 3: FUNCIN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN

Cortar el plsmido aislado con enzimas de restriccin y
visualizarlo en un gel de agarosa teido con bromuro de
etidio

OBJETIVO DE LA PRCTICA:
OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA

Escherichia coli

Medio LB +
KANAMICINA

Se introducir el vector pET-TEM

Sitio mltiple
de restriccin

Gen que confiere

resistencia a
kanamicina:
kanamicina
fosfotransferasa

Origen de
replicacin

PURIFICACIN PLSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA

Ccc: supercoiled circular covalently closed

Oc: open circular

La diferencia en TAMAO entre el DNA

cromosomal y el DNA plasmdico permite
desarrrollar estrategias de purificacin

Plsmidos

TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento

TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento

TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento

PURIFICACIN PLSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA

Ccc: supercoiled circular covalently closed

Oc: open circular

Purificacin de plsmidos
1. Lisis

Qumica
Mecnica
Cambios en la Tempratura

2. Remover partculas grandes

3. Purificacin intermedia

Precipitacin fraccionada
Adsorcin a membranas

4. Purificacin alta resolucin

5. Conservar

Disolver
Liofilizar
Formular

Centrifugacin
Filtracin (uso de membranas)

Mtodos cromatogrficos:
Intercambio inico
Filtracin en gel
Afinidad

ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE

PLSMIDOS POR LA TCNICA DE LISIS
ALCALINA

Aislamiento de plsmidos
por el mtodo de lisis
alcalina

Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria

Solucin GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9

La glucosa no tiene carga pero es un osmolito
El EDTA une cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ en
la membrana celular, debilitando la membrana.
Tambin el Mg2+ es cofactor de Dnasas

Componentes de la solucin GTE

Tris-HCl

Glucosa

Solucin de
lisis

Solucin de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%

Esta solucin disuelve los fosfolpidos y los
componentes protecos de las membranas celulares.
SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CLULAS
El NaOH
desnaturaliza el
DNA plasmdico y
cromosomal

Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con

protenas y lpidos.
El DNA cromosomal que se renaturaliza se atrapa en
el precipitado SDS/protenas/lpidos. Slo el DNA
plasmdico y molculas de RNA escapan del
precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL
SOBRENADANTE

Incubar por 20 min a -20C

El isopropanol precipita los cidos nuclecos

Lavar el botn con etanol al 70%: remueve sales y

remanentes de SDS. Tambin remueve el
isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se
evapora ms rpido

Purificacin de plsmidos

Por ejemplo unin al ptido 16mer

NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-HisGly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-AsnGln-COOH

Cmo podramos monitorear el progreso de la purificacin

de plsmidos?
1. Absorbancia 260 nm
2. Electroforesis en geles de agarosa

Por la electroforesis en geles de agarosa se debe

monitorear la purificacin de plsmidos

1 Precipitacin con
isopropanol
2 Cromatografa
intercambo aninico
3 Filtracin con
membrana de
nitrocelulosa
4 Lo que se retuvo en
la membrana de
nitrocelulosa

DNA cromosomal

Plsmido abierto
Plsmido superenrrollado

Microscopia
de polmero
de agarosa

Uso de colorantes

Tincin con Syber Safe