Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Manual Citologia 2009-04-17 B
Manual Citologia 2009-04-17 B
Abril 2009
Red LatinPapa
Centro Internacional
de la Papa (CIP)
ii
Tabla de Contenidos
Prlogo
iv
Agradecimientos
Introduccin
vi
1.1.1
1.1.2
Meiosis
3.1 Meiosis I
3.2 Meiosis II
11
12
3.4 Gametos 2n
13
14
14
17
Literatura consultada
19
21
iii
Prlogo
La citogentica surge de la necesidad de relacionar los hechos descritos por la gentica
con los fenmenos que ocurren dentro de la clula u rganos especializados. Ella ha
permitido conocer la estructura y funcin de cada uno de los componentes de la clula, y de
estructuras ms especializadas, en relacin con funciones como la reproduccin sexual.
La citogentica clsica y molecular ha hecho posible el anlisis, interpretacin y
trascendencia de ciertas caractersticas, desde las ms simples a las ms complejas
(cromosomas y genes, cromosomas condensados y linearizados), contribuyendo en gran
medida a la resolucin de problemas en aspectos taxonmicos, evolutivos y aplicativos.
Asimismo, los estudios citogenticos permiten realizar valiosos aportes al conocimiento de
los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiacin en las plantas.
Tambin permite la observacin de los caracteres citolgicos de clulas especializadas, su
funcin y comportamiento ante cambios del entorno, o la serie de procesos que se suceden
durante la fertilizacin, aportan conocimiento a la ciencia bsica.
En los programas de mejoramiento la citogentica ayuda dilucidar ciertos fenmenos
genticos, como: el apareamiento y entrecruzamiento entre los cromosomas homlogos, la
relacin entre el polen y pistilo (fertilizacin-fecundacin) e identificacin de
incompatibilidades, irregularidades meiticas en hbridos, produccin de gametos 2n y su
relacin con la formacin de poliploides, etc.
El presente manual servir como gua de capacitacin de investigadores, profesores,
estudiantes y tcnicos. El documento busca llevar a la prctica diversas tcnicas clsicas y
bsicas, que faciliten la observacin e interpretacin de parmetros y resultados genticos,
ayudando a proyectar convenientemente un plan de mejoramiento, as como tambin en
determinados estudios a nivel molecular.
Los ejemplos y las ilustraciones han sido tomados de la papa, la cual, a pesar de contar con
cromosomas pequeos, hace posible evidenciar ciertos fenmenos al nivel citolgico y
estos a su vez relacionarlos con la constitucin y el comportamiento gentico.
Adems, se da los conceptos tericos en cada uno de los temas tratados, pudiendo estas
tcnicas ser aplicadas en otros cultivos.
Los autores
iv
Agradecimientos
La publicacin del presente Manual es gracias al soporte financiero de:
INIA Espaa
FONTAGRO
Introduccin
vi
Este proceso ocurre en las clulas conocidas como meristemas (races, hojas, flores) y
meristemas axilares, estas estructuras tienen la capacidad de dividirse a lo largo de todo el
ciclo de vida del organismo.
Es un proceso continuo, en el cual se suceden en una secuencia cuidadosamente
ordenada los complejos preparativos para la divisin, por la cual se hace un reparto
equitativo del material gentico ya duplicado entre las dos clulas resultantes, manteniendo
as la ploida original de la clula. Implica que cada cromtida pueda migrar a un diferente
polo, separacin que es posible mediante el huso mittico o acromtico, estas fibras estn
formadas de microtbulos y sus protenas asociadas por un proceso de polimerizacin, que
se asocian a las cromtides permitiendo que cada una migren hacia los polos una vez que
ambas se separan a nivel centromrico.
Esta polimerizacin puede ser inhibida experimentalmente y muchos tratamientos con
sustancias como la colchicina, 8-hidroxiquinolena, Tjio y Levan (1950), paradiclorobenceno, piretroides (Klein, 1990, Watanabe y Orrillo 1993, Chen, 2005) y
tratamiento por fro pueden efectivamente acumular clulas en metafase y cromosomas
condensados durante la mitosis. La mitosis comprende una divisin nuclear y somtica
(citocinesis) lo que permite que los organelos pasen ms o menos al azar a una u otra de
las dos clulas.
El ms importante carcter de la mitosis es que el nmero cromosmico permanece
constante a travs de sucesivas divisiones celulares, con una exacta distribucin de
cromosomas en las nuevas clulas formadas, genticamente idnticas entre s,
mantenindose la ploida original de la clula.
Convencionalmente la mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y
telofase.
Interfase. Es el periodo entre las sucesivas divisiones donde los cromosomas son
prcticamente invisibles an con la ayuda del microscopio, durante esta fase antes
que la clula se divida tiene lugar la replicacin, que es la sntesis del ADN y
formacin de las fibras que conforman el uso mittico o spindle bipolar. Este
periodo pertenece a las etapas G1, S, G2. El genoma completo se replica una y solo
una vez en cada ciclo.
Eliminar la solucin
de pre-fijacin
24
horas
Aplastado
(Squash)
Lmina lista
Observar al
microscopio
4X
2X
4X
3. Fijacin
Es optativo, se puede obviar este paso si es que se desea ver las muestras
inmediatamente, caso de querer guardar las muestras por ms tiempo se fijaran en
alcohol 96 % 3p: cido actico 1p; y se deja a medio ambiente por 24 horas.
Si se quiere guardar en fijador hacerlo en alcohol de 70% y en refrigeracin a 4 C,
prepare suficiente cantidad de solucin fijadora, de tal manera de cubrir bien las
races. Los fijadores se preparan al momento de ser usados.
4. Hidrlisis
Se colocan las muestras en HCl 1N a 60 C de temperatura, por 8 -10 minutos; el
cido se calentara previamente, transcurrido el tiempo de hidrlisis se proceder a
quitar el cido y a lavar con agua destilada.
5. Coloracin
Con lacto-propinico orcena u orcena-actica, se procede a colocar las races en
pequeos contenedores o Petris conteniendo el colorante.
6. Aplastado o squash
Se colocan las races en un porta-objeto, usamos solamente 1-2 mm de la punta,
con una gota del mismo colorante (tambin podemos usar cido actico al 45 %), se
coloca un cubre-objeto y asegurando uno de los extremos procedemos con una
varilla de goma, o un borrador de un lpiz o la punta de l a presionar suavemente, o
dando golpecitos repetidos, pero firmes, permitiendo la disociacin del tejido.
Colocar el porta-objeto entre papel de filtro y presionar fuerte con el dedo pulgar
squash, pero tratando de evitar cualquier movimiento lateral del porta-objeto.
7. Observacin
La muestra se coloca bajo microscopio ptico, inicialmente a 10 X, 20 X con el
objetivo de seleccionar las mejores metafases y luego pasar a objetivos de 40 X y
100X para el conteo de cromosomas, las clulas deben estar intactas, no
superpuestas ni con artefactos que puedan distorsionar el conteo exacto de
cromosomas.
Pre - tratamiento
Propsito: Separacin de los cromosomas, acortarlos, y la clarificacin de los
centrmeros a fin de hacerlos visibles para chequear el nmero bsico.
Otro pre-tratamiento que da buenos resultados es con agua helada, en lugar del uso
de Permetrina, se utiliza agua destilada helada por 48 horas a 4 C y colocando los
frascos (vials) que contienen las raicillas en un termo en el cual se ha colocado
cubitos de hielo con agua, el resto del procedimiento es igual.
Colecta de hojas,
foliolos
Promedio del N
de cloroplastos
por clula guarda
Posible
ploida
7-8
2X
9 - 11
3X
12 -14
4X
15 -16
5X
ncleo
Cloroplasto
Clula
guarda
Huamn, 1995
Genotipo Diploide
Posiblemente Genotipo
Tetraploide
Preparacin de KI-I
1. 1 g de KI
2. 1 g de I
3. Ambos reactivos disolver en 100 ml de Etanol al 70%, guardar en frasco oscuro.
Procedimiento
1. Materiales
Colectar fololos jvenes de la parte apical y colocarlos en placas Petri, y luego
tomar aprximadamente unos 40-50 mg. Fig. 7.
2. Preparacin
La muestra a analizar se coloca en una placa Petri y se adiciona 0.5 ml del buffer de
extraccin (CyStain UV Ploidy) y se cortan los fololos con una hoja de afeitar,
seccionando muy finamente en pequeos cuadraditos. Una vez est disgregado el
tejido, se le adiciona nuevamente 1.5 ml del buffer de extraccin y se incuba por 5
minutos a temperatura ambiente. Este buffer de extraccin de ncleos, contiene el
fluorocromo DAPI (4, 6 diamino-2-phenilindole), que tie el ADN.
Una vez resuspendida la mezcla se pasa a travs de un filtro de nylon de 30 m
(Partec 50 m, Cell TricsTM), lo cual permite separar los ncleos, que caen a un tubo
receptor, el cual se coloca en el analizador. Figs. 8 y 9.
3. Observacin
Los resultados de la muestra son cuantificados por el sistema electrnico, que se
encarga de la cuantificacin de los destellos de la fluorescencia y de la luz
dispersada, bajo el control del ordenador, el cual almacena los datos de miles de
clulas por cada muestra, y representa los resultados grficamente.
El sistema informtico que lleva incorporado el citmetro convierte cada seal
fluorescente en un resultado que es presentado en un histograma en una escala
logartmica. El grfico resultante ordena los datos segn el contenido nuclear de
ADN en el eje de abscisas, y contabiliza el nmero de ncleos de cada tipo en el eje
de ordenadas. Figs. 9 y 10.
Todas las clulas que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN
medido, y este pico representa un nivel de ploida.
El ruido consiste en una pequea seal indeseada y aparece en los canales bajos.
Una razn para este ruido son los fragmentos resultantes de las clulas al momento
de su preparacin.
La cuantificacin del ADN nos permite conocer tambin la existencia de
aneuploidas, donde los histogramas se desplazan levemente hacia uno u otro lado
de la ploida esperada.
Colocarlos en 0.5 ml el
buffer de extraccin
(Cystain UV ploidy)
Colocar la muestra en el
Clitmetro de Flujo
Filtrar la muestra en
filtros de 30m
(Partec Cell Trics 30)
Citmetro de Flujo
Ploidy Analyzer (PA) Partec I
K.Soto
Histograma de la muestra
2x
4x
< 4X
Fig. 11: Histogramas con los resultados para plodas 2, 4 y <4, encontradas en GON,
ADG y en un hbrido somtico respectivamente.
Captulo 3. Meiosis
Este trmino se deriva del griego meioum (reducir). Cada organismo tiene un nmero de
cromosomas caracterstico de su especie.
Este proceso ocurre antes de la formacin de las clulas reproductivas o esporas, en el
cual el nmero diploide normal se reduce a un juego nico o haploide (n) en cada gameto,
el nmero haploide se designa como n y el nmero diploide como 2n. La meiosis es
tambin precedida por una fase S, durante la cual ocurre la sntesis de ADN (algo de
sntesis de ADN ocurre durante la primera profase de la meiosis). Antes de iniciarse la
meiosis el material gentico en el ncleo diploide ha sido replicado slo una vez, cada
cromosoma consiste de dos cromtidas hermanas idnticas.
Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, ellas son distinguidas como meiosis I y
meiosis II.
La comprensin del proceso de la meiosis es fundamental para interpretar el proceso y
funcin de la recombinacin gentica en la evolucin cromosmica.
Todo este proceso es dinmico, abarca atraccin, apareamiento, intercambio y ulterior
separacin de los cromosomas homlogos paternos y maternos.
Durante este proceso cada gameto lleva slo un miembro de cada par de homlogos.
En toda clula diploide, cada cromosoma proviene del gameto de uno de los progenitores y
su pareja, del gameto del otro progenitor, estos pares de cromosomas se conocen como
pares homlogos, los que se asemejan en tamao, forma y en el tipo de informacin
hereditaria que contienen.
Adems de mantener un nmero constante de cromosomas de generacin en generacin,
es una fuente de nuevas combinaciones de material gentico dentro de los mismos
cromosomas.
Cada divisin meitica es formalmente dividida en profase, metafase, anafase y telofase.
De esos el ms complejo y largo es la profase I la cual est subdividida en: leptoteno,
zygoteno, paquiteno y diacinesis.
3.1 Meiosis I
3.1.1 Profase I
La cromatina se condensa y los cromosomas se hacen visibles con el microscopio ptico.
Durante este proceso cada gameto lleva slo un miembro de cada par de homlogos.
3.1.2 Metafase I
Los bivalentes se sitan a cada lado del plano ecuatorial. El huso (spindle) se ha formado
completamente y cada homlogo tiene su centrmero. Por ello el cromosoma completo se
dirige a uno de los polos. Los cromosomas aparecen ms condensados.
3.1.3 Anafase I
Los cromosomas homlogos se han separado y migran hacia los polos respectivos u
opuestos de la clula por accin de los microtbulos del huso acromtico, sin embargo
debido a los entrecruzamientos ocurridos, las cromtidas no son idnticas como lo fueron al
comienzo de la meiosis. Nuevas combinaciones han surgido en cromtidas no hermanas,
en tanto que las otras dos quedan intactas. Los centrmeros no se dividen, las cromtidas
hermanas continan unidas, pero los homlogos se separan. Como resultado para
cualquiera de los pares homlogos, un polo recibe un cromosoma de origen paterno y el
polo contrario un cromosoma de origen materno. Y no todos los cromosomas paternos se
dirigen hacia el mismo polo. De hecho cualquier combinacin de cromosomas maternos y
paternos puede desplazarse hacia un polo determinado.
3.1.4 Telofase I
Los cromosomas propenden a alargarse, algunas veces el nuclolo y la membrana nuclear
reaparece. Las clulas formadas contienen la mitad del nmero de cromosomas presentes
en la clula madre. Set haploide de cromosomas. Los cromosomas se encuentran
reagrupados en cada polo.
10
3.2 Meiosis II
Se parece a la mitosis, excepto en que no est precedida por la duplicacin del material
cromosmico
3.2.1 Profase II
Cada clula es haploide, la membrana nuclear empieza a desintegrarse y el nuclolo
desaparece al final de la profase II, sta es corta y le sigue una reorganizacin del huso
acromtico.
3.2.2 Metafase II
En esta etapa los cromosomas que han quedado en los polos se colocan en el plano
ecuatorial y se adhieren a las fibras del huso.
3.2.3 Anafase II
En esta fase los centrmeros se dividen y las cromtidas hermanas, que ahora son
cromosomas, se separan y se van hacia los polos opuestos.
3.2.4 Telofase II
En esta fase se forma una ttrada de microsporas, se han formado nuevas paredes
celulares, cada ncleo lleva un nmero haploide de cromosomas, cada cromosoma est
representado una vez, Y cada ncleo de un segmento puede recibir cualquier combinacin
factible de cromtidas de origen materno y paterno.
11
Procedimiento
1. Fijacin
Usar Carnoy modificado fresco (3:1 alcohol absoluto: solucin saturada de acetato
frrico en cido propinico), el cual es dispensado en frascos con tapa rosca,
sumergir la muestra de botones de diferentes estados de desarrollo, previamente
haciendo un corte con un bistur en la punta de los botones para permitir que el
fijador penetre. Aqu deben permanecer de 24 a 48 horas a temperatura ambiental.
Para largos periodos de almacenamiento en refrigeracin, se recomienda guardar
las muestras en etanol al 70 % a 4 C.
2. Preparacin
Tomar varios tamaos de botones en una placa Petri o en un vidrio de reloj con 70
% de etanol y chequear cada botn si est en estado ptimo para la observacin de
meiosis.
Diseccionar la antera, sobre una lmina porta objeto, cortando los extremos aplastar
presionndola con una aguja de diseccin para luego remover los restos de la
antera y colocando rpidamente una gota de carmn propinico o de lacto propinico
orcena, cubrir con un cubre objeto.
Las agujas, pinzas de diseccin deben limpiarse frecuentemente para evitar su
corrosin.
3. Observacin
Examinar la preparacin bajo el microscopio ptico, a un aumento de 40 X o 100 X,
si estuviera en un estado ptimo, calentar levemente la muestra pasando por la
llama de un mechero y retirar el exceso de tinte colocando la lmina entre 2 papeles
de filtro. Se puede golpear suavemente el cubre objeto para expandir los
cromosomas.
12
Antera diseccionada
Microsporognesis
Clulas madre del
polen
Clulas madre del
polen
Clulas
nutritivas
Arquesporio
Polen
Profase I
Paquiteno
Diacinesis
AI
MI
Metafase I
Anafase I
Fig. 14: Meiosis I, mostrando Paquiteno - Diacinesis (Profase I), Metafase I y Anafase I.
Telofase I
M II
AII
Anafase II, ps y
telofase temprana II
(flecha)
TI
Telofase I,
Anafase II
Anafase II, husos
normales y
paralelos
AII
Fig. 15: Meiosis I, Telofase I y Meiosis II, Metafase II, Anafase II, Telofase II, husos
normales y paralelos.
3.4. Gametos 2n
Gametos con el nmero somtico de cromosomas (gametos 2n) son el resultado de
mecanismos que afectan formacin normal de los gametos, durante la fase premeiotica,
meitica y post meitica. La incidencia de gametos 2n es frecuente en el reino vegetal, y su
ocurrencia ha sido reportada en muchas especies de familias, incluyendo Crucferae,
Leguminosae, Rosaceae, Solanaceae y Vitaceae (Veilleaux, 1985).
Los gametos no reducidos son de gran utilidad, ya que facilitan la poliploidizacin sexual y a
la vez proporcionan un mtodo muy efectivo para transmitir la heterocigosidad y la epistasis
del nivel 2X al 4X.
Pueden ser detectados: Por la ocurrencia de progenie tetraploide en cruzamientos 2x 4x,
4x 2x; distribucin bimodal del dimetro del polen: grande (2n) & normal (n). La presencia
de ttradas, diadas y/o triadas en el estado de formacin de microsporas. Fig. 16.
La poliploida es una caracterstica distintiva del reino vegetal y ha tenido un papel muy
importante en la evolucin de las plantas superiores especialmente la Angiospermas,
incluyendo las especies cultivadas de mayor importancia mundial tales como el trigo, papa,
avena, caa de azcar y algodn que son poliploides. Camadro (1986).
Los poliploides pueden originarse por duplicacin espontnea del complemento
cromosmico somtico (poliploidizacin asexual) o por el funcionamiento de gametos 2n
(poliploidizacin sexual).
2n
Formacin de
ttradas y
diadas
Formacin de
polen normal y
polen 2n
Formacin de triadas
(orientacin tripolar)
y ttradas
13
14
Polen colectado en
cpsula de gelatina
Coleccin de polen
La muestra es colocada en 2 - 3
gotas de colorante
Materiales
Polen doble,
coloreado y no
coloreado
Fig. 19: Diferentes calidades de polen, normal (n), estril, polen 2n, polen doble.
Eclipse de
esterilidad
Polen
anmalo
Ttradas estriles
Fig. 20: Polen anmalo: Con eclipse de esterilidad, malformado y ttradas estriles.
Polen n y 2n coloreados
Polen n y 2n estriles
Fig. 22: A. Polen normal (n), B. Polen n y 2n, C. Polen normal y estril, D. Polen estril.
Coloracin X-Gal.
Fig. 23: A. Polen con 3 poros germinativos, B. Polen doble, C. Polen con 2 poros
germinativos, D. Polen estril. Coloracin X-Gal.
Fig. 24: Procedimiento para el cultivo de polen in vitro en medio de sucrosa, cido brico y
Tween 20 bajo condiciones de cmara hmeda.
Fig. 25: A y B. Polen germinado y con buen crecimiento en el medio de cultivo. C. Polen
con mediana germinacin D. Polen con escasa germinacin.
Fig. 26: A. Polen no germinado, B. Slo uno de los granos del polen doble germinando,
C. Escaso polen germinado, D. Polen soltando su contenido.
Polinizacin y fertilizacin
Cuando las anteras se tornan dehiscentes, los granos de polen son transferidos al
estigma(s) por los insectos o la mano del hombre. Una vez en contacto con el estigma, los
granos de polen germinan formando el tubo polnico. En cada una de las microsporas
haploides formadas durante la meiosis, el ncleo se divide por mitosis y desarrolla un grano
de polen bicelular (gametofito masculino inmaduro). Una de las clulas se divide
posteriormente otra vez habitualmente despus del desarrollo del tubo polnico, dando
como resultado tres clulas haploides por grano de polen: dos gametos masculinos
masculinos (ncleo germinativo y ncleo espermtico).y la clula generadora del tubo
polnico. El tubo contina creciendo y entra al vulo a travs del micrpilo. Los dos gametos
son entonces liberados dentro de la sinrgida. El saco embrionario contiene 8 ncleos y
cada uno con una dotacin haploide de cromosomas. Los dos ncleos cerca al centro del
saco embrionario son referidos como ncleos polares; la clula huevo u oosfera est
situada cerca al micrpilo.
Finalmente un ncleo espermtico entra en la clula huevo y el otro se une a los dos
ncleos polares, este acontecimiento es llamado doble fertilizacin, entonces se forma un
cigoto diploide, que luego desarrolla en embrin y la unin del otro ncleo espermtico con
15
dos ncleos polares, llamado fusin triple resulta en la formacin del tejido nutritivo llamado
endospermo (3n). Se conoce a este proceso como doble fertilizacin, este es un proceso
complejo, el embrin pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra
dentro del ovario de la flor, los integumentos se desarrollan en la cubierta de la semilla y el
ovario mismo madura y se transforma en fruto.
Las polinizaciones o fertilizaciones, deben realizarse usualmente en la maana antes de las
10 a m, si los das son calurosos es posible hacerlos al final de la tarde. El probable xito
del cruzamiento es apreciado por un pedicelo sostenido y ligeramente curvado, unos 2-4
das despus de la polinizacin con un posterior desarrollo de frutos (bayas), los cuales
sern cosechados cerca de 30-45 das dependiendo de las especies. Normalmente los
frutos son protegidos durante su desarrollo con una malla de fina gasa. Despus de la
cosecha, (25-40 das), se colocarn en bolsas de papel hasta su maduracin a temperatura
ambiente, esperando hasta que se tornen suaves lo cual permite que el proceso de
extraccin sea ms fcil, la extraccin que se hace en un recipiente con agua donde son
separadas las semillas de las otras partes del fruto. Las semillas viables tienden a irse
hacia el fondo, mientras las semillas llamadas vanas flotan. Las semillas obtenidas as
debern ser secadas, colocadas en papel de platina especial y selladas para guardar en
cmara de refrigeracin a 4 C. Fig. 27.
Polinizacin y fertilizacin
Colecta de polen
Identificacin del
Polinizacin
cruzamiento
Guardar el polen en
cpsulas de gelatina
16
Preparacin de la solucin
Para una cantidad total de 1.2 litros de solucin:
100 ml (1 parte) (w/v) de la solucin acuosa de azul de anilina (2%), hervir y filtrar.
700 ml (7 partes) solucin acuosa de 0.2 N K3PO4 * 3 H20 (49.53 g completar a 700
ml con agua destilada)
200 ml (2 partes) 1.0 N Na OH (8.0 g completar a 200 ml con agua destilada)
200 ml (2 partes) (v/v) 10% solucin acuosa de Tween 20 (180 ml de agua destilada
+ 20 ml de Tween 20).
Al azul de anilina preparada, se agrega las dems soluciones y luego se procede a guardar
en frasco oscuro en refrigeracin a 4 C, la solucin toma un color amarillo claro.
17
18
Niveles*
> 30
10-30
<10
17
18
13
14
15
10
11
12
Estilo (final)
Placenta
No germinado
Estigma
Estilo-estigma
Estilo
Fig. 28: Matriz de valores combinados para evaluacin cualitativa (nivel de crecimiento al
cual llegan los tubos polnicos en el pistilo) y cuantitativa (nmero de tubos polnicos
llegando a los diferentes niveles a lo largo del pistilo).
* Niveles de longitud del tubo del polen llegan: 6 - Polen no germinado; 5 - estigma; 4 - estilo
- estigma; 3 - estilo; 2 - final del estilo; 1 - placenta. (Trognitz,1991).
Fig. 29: Diferentes vistas del crecimiento del tubo polnico en el pistilo y ovario despus de
ser coloreado con el colorante fluorescente azul de anilina que reacciona con la callosa.
Procedimiento
Despus de realizados los cruzamientos las bayas se colectan dentro del lapso de 19-27
D.D.P, se efecta una desinfeccin previa usando una solucin que contiene los acaricidas
Azociclotin (Peropal 50 SC): Imidacloprid (Confidor 35 SC) al 1 , adicionndole 6 gotas de
Tween 20, colocando las bayas en esta solucin por aproximadamente 10 minutos, seguido
de una desinfeccin con alcohol 70% por 30 segundos, y finalmente se lavan 2 veces con
agua destilada, proceso que se realiza en un rea destinada para este propsito; por ltimo
se esteriliza superficialmente con una solucin de Hipoclorito de Calcio al 2.5% por 10
minutos y finalmente se enjuaga con agua destilada estril, proceso que se realiza en la
cmara de flujo laminar. En este punto las bayas estn listas para ser cortadas.
19
dispensarlo a las placas Petri. Finalmente las placas Petri se colocaran en la cmara de
crecimiento en un rango de temperatura de 18 a 22 C, 16 horas de fotoperodo y 3000 lux
de intensidad lumnica hasta su germinacin.
Una vez ha desarrollada la plantita se procede al transplante a tubos con el medio de
propagacin MSA que consiste de 4.6 g/L del medio basal Murashige y Skoog (Sigma),
fortificado con 25 g/L de sucrosa, 2.9 g/L de Phytagel y 5 mL del Stock de Vitaminas (0.025
g de GA3 (cido giberlico), 0.5 g de glicina y 0.125 g de cido nicotnico) y a pH 5.6. Fig.
30.
Torpedo
Apertura de bayas
Polinizacin
in vitro
(19-27 DDP)
Globular Corazn
Descarte de
embriones con
marcador
Pro-embriones
creciendo en medio
de
Plantas de in vitro
creciendo en invernadero
Propagacin
in vitro
Rescate de pro
embriones en
diferentes estados
cultivo in vitro
Hbrido
rescatado
20
Literatura consultada
Bamberg J.B., and R.E. Hanneman, Jr. 1991. An effective method for culturing pollen
tubes of potato. Amer. Pot. J. 68:373-379.
Brown D.C.W and Thorpe T.A. 1995. Crop improvement through tissue culture.
World Journal of Microbiology & Biotechnology. 11: 409-415.
Chen, Q. and Y. Li Hai. 2005. An improved technique for high resolution mitotic
chromosome studies in Solanum. HortScience 40(1): 54-56.
Dionne, L., and P.B. Spicer. 1958. Staining germinating pollen and pollen tubes.
Stain Technology 33: 15-17.
Haskell, G. and A.B. Wills .1968. Primer of chromosomes practice. Oliver and Boyd.
Londres. 150 p.
Marks G.E., 1954. An acetic-carmine glycerol jelly for use in pollen fertility counts.
Stain Tech 29:277.
Pellegrineschi, A., Fatokun. C.A., Thottappilly, G., Adepoju, A. 1997. Cowpea embryo
rescue. 1. Influence of culture media composition on plant recovery from isolated
immature embryos. Plant Cell Reports 17: 133138.
Schreiter, J.; Tiemann, H. 1977. Testing the pollen tube growth in vivo in dihaploids
of Solanum tuberosum L. Arch. Zchtungsforschung 7:253-258.
21
Singsit, C., and R.E. Hanneman Jr, 1991. Rescuing abortive inter-EBN potato
hybrids through double pollination and embryo culture. Plant Cell Rep 9, 475 -478.
Tjio, J.H. and A. Levan. 1950. The use of oxyquinoline in chromosome analysis. Ann.
Estacin Expt. Aula Dei 2:21-46.
Watanabe, K.N. and M. Orrillo. 1993. An alternative pretreatment method for mitotic
chromosome observation in potatoes. Am. Potato J 70:543-548.
22