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Microbiologa de la tuberculosis
Microbiology of tuberculosis
I. Dorronsoro1, L. Torroba2
RESUMEN
ABSTRACT
Durante un siglo, el diagnstico microbiolgico de

la tuberculosis, basado en la baciloscopia y en el aislamiento e identificacin de Mycobacterium tuberculosis
en los cultivos, ha sido poco sensible y lento lo que
obligaba en ocasiones a iniciar de forma emprica tratamiento con tuberculostticos.
For a century, the diagnosis of tuberculosis, based

on bacilloscopy and the isolation and identification of
Mycobacterium tuberculosis in cultures, has been slow
and not very sensitive. This has made it necessary on
occasions to initiate treatment with tuberculostatics in
an empirical way.
La incorporacin rutinaria de medios de cultivo

lquidos y tcnicas de gentica molecular, en la ltima
dcada del siglo XX, ha supuesto un avance importante al aumentar claramente la sensibilidad, precisin y
rapidez en el diagnstico.
The routine incorporation of liquid mediums and

molecular genetic techniques in the final decade of the
XX century brought an important advance by clearly
increasing the sensitivity, precision and rapidity of
diagnosis.
La actual eclosin de las tcnicas moleculares est

permitiendo un mejor conocimiento de la epidemiologa de la enfermedad, de los factores de virulencia y de
los mecanismos de resistencia lo que dar lugar, en un
futuro inmediato, a nuevas estrategias de prevencin y
tratamiento de la enfermedad.
The present blossoming of molecular techniques

is making possible a better understanding of the
diseases epidemiology, the factors of virulence and the
mechanisms of resistance, which in the near future will
give rise to new strategies of prevention and for
treating the disease.
Palabras clave. Mycobacterium tuberculosis. Diagnstico microbiolgico. Medios lquidos. Gentica

molecular.
Mycobacterium
tuberculosis.
Key
words.
Microbiological diagnosis. Liquid mediums. Molecular
genetics.
An. Sist. Sanit. Navar. 2007; 30 (Supl. 2): 67-84.
1. Servicio de Microbiologa. Hospital de Navarra. Pamplona.

2. Servicio de Microbiologa. Hospital Virgen
del Camino. Pamplona
An. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2
Correspondencia:
Luis Torroba lvarez
Laboratorio de Microbiologa
Hospital Virgen del Camino
C/ Irunlarrea, 4
31008 Pamplona
E mail: ltorroba@gmail.com
67
I. Dorronsoro y L. Torroba
INTRODUCCIN
En 1882, Robert Koch describi el agente etiolgico de la tuberculosis (TB) y lo
denomin Bacterium tuberculosis1. El nombre inicial fue sustituido por el de Mycobacterium tuberculosis en 1896 por Lehmann y Neumann2. El trmino Mycobacterium significa hongo-bacteria, y esta denominacin se debe al aspecto de los cultivos, que en ciertos aspectos recuerdan a
los de los hongos.
El descubrimiento de M. tuberculosis
caus y sigue causando admiracin dadas
las caractersticas del microorganismo. M.
tuberculosis es una bacteria que requiere
tcnicas especiales de tincin y medios de
cultivo distintos a los empleados habitualmente en bacteriologa. Adems, para
poder aislarla, y debido a su lento crecimiento, hay que realizar una decontaminacin previa de la mayora de las muestras,
con el fin de destruir la flora acompaante
que crece ms rpidamente.
Con la llegada de nuevas tcnicas de
diagnstico estn siendo descritas nuevas
especies de Mycobacterium no tuberculosis (MNT), algunas de las cuales estn
implicadas en la patologa humana. Conviene disponer de mtodos de identificacin rpidos y eficaces pero, debido a la
complejidad de las mismas, el nivel del servicio y la eleccin de los mtodos deben ir
en funcin de la poblacin atendida y de
los medios disponibles.
GNERO MYCOBACTERIUM
El orden de los Actinomycetales incluye
la familia Mycobacteriaceae, Actinomycetaceae, Streptomycetaceae y Nocardiaceae.
La familia Mycobacteriaceae contiene un
solo gnero, el gnero Mycobacterium, del
que en sus orgenes slo se conocan dos
especies: El bacilo de la lepra o Mycobacterium leprae ( A. Hansen 1874) y el bacilo
tuberculoso o M. tuberculosis.
Hoy en da, dentro del gnero Mycobacterium se han descrito ms de 120 especies
de micobacterias diferentes. Se caracterizan por ser bacterias cido-alcohol resistentes (BAAR) debido al alto contenido en
lpidos que tienen en su pared celular. Este
hecho impide que penetren los colorantes
68
habituales de anilina, por lo que no se pueden ver en la tincin de Gram, y hace que
para poder visualizarlas sean necesarios
colorantes especiales (arilmetanos), pero
que una vez teidas no se decoloran con
una mezcla de alcohol y cido.
Las micobacterias son capaces de sobrevivir durante semanas o meses sobre objetos inanimados, siempre que estn protegidas de la luz solar, y son ms resistentes a
los cidos, lcalis y desinfectantes que el
resto de las bacterias no formadoras de
esporas. Resisten la desecacin y la congelacin, pero la luz ultravioleta y el calor
(>65 C durante 30 minutos) las inactiva3.
Mycobacterium tuberculosis
complex
Engloba a un grupo de micobacterias
que presentan >95% de homologa en su
DNA y que se designa como complejo M.
tuberculosis (o MTC). Est compuesto, adems de M. tuberculosis, por Mycobacterium
bovis, M. bovis BCG (una cepa variante de
laboratorio utilizada en vacunacin y en instilaciones vesicales en pacientes con neoplasia de vejiga), Mycobacterium africanum
(principal causante de la TB en frica tropical), Mycobacterium microti (causante de la
TB en roedores, llamas y otros mamferos) y
Mycobacterium canetii. Habitualmente se utiliza el termino de M. tuberculosis o bacilo
tuberculoso como sinnimo de todas ellas,
ya que se identifican, en la mayora de los
laboratorios, mediante la hibridacin con
una sonda de DNA, comn para todo el complejo, y porque el aislamiento de cualquiera
de ellas en muestras clnicas establece, por
s mismo, el diagnstico de TB en el paciente. Sin embargo, entre ellas existen caractersticas diferenciales importantes para el
manejo de los pacientes (p. e., M. bovis es
resistente a pirazinamida) y por su inters
epidemiolgico.
Mycobacterium no tuberculosis
(MNT)
Hoy en da, el 10-30 % de las micobacterias aisladas en laboratorios clnicos
corresponden al grupo de las micobacterias no pertenecientes al complejo M.
tuberculosis. Este grupo heterogneo de
micobacterias ha recibido histricamente
MICROBIOLOGA DE LA TUBERCULOSIS
otros nombres como micobacterias atpicas, Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT), micobacterias ambientales o
micobacterias oportunistas. Inicialmente,
la nomenclatura de estas especies se realiz atendiendo a su poder patgeno para
las distintas especies animales como Mycobacterium simiae o Mycobacterium avium.
Posteriormente se fueron aislando otras
micobacterias a partir de muestras
ambientales (aguas de lagos o ros, caeras de los hospitales, suelo, polvo, etc.).
Constituyen un grupo muy numeroso,
heterogneo y difcil de sistematizar. Algunas especies son muy ubicuas y poco patgenas; otras son menos ubicuas y su aislamiento tiene un alto valor predictivo de
enfermedad; otras no tienen significado
clnico conocido y cada vez es ms frecuente la descripcin de nuevas especies
no conocidas previamente. Durante

muchos aos (primeros 2/3 del siglo XX),
apenas se les dio importancia, no obstante, ya en 1954, Timpe y Runyon realizaron
un primer intento de clasificacin de las
MNT aisladas de pacientes, basada en sus
caractersticas de crecimiento y pigmentacin (Tabla 1). Tras el declive progresivo
de la TB en los pases desarrollados y la
irrupcin del SIDA, se fue acumulando ms
experiencia sobre casos clnicos debidos a
MNT. En cualquier caso, y a diferencia de
MTC, el aislamiento de MNT en muestras
de pacientes no es criterio suficiente para
establecer el diagnstico de enfermedad
por micobacterias y son poco o nada contagiosas entre las personas.
Debido a la frecuencia con que producen enfermedad (micobacteriosis) o bien
Tabla 1. Principales micobacterias aisladas de muestras clnicas*.
Mycoba cterium tuberculosis complex

Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium africanum
Mycobacterium bovis
Mycobacterium bovis BCG
Micobacterias No Tuberculosas (MNT)
De crecimiento lento:
Micobacterias no cromgenas:
Mycobacterium avium complex
Mycobacterium celatum
Mycobacterium gastri
Mycobacterium genavense
Mycobacterium haemophilum
Mycobacterium malmoense
Mycobacterium shigmoidei
Mycobacterium terrae complex
Mycobacterium triviale
Mycobacterium ulcerans
Mycobacterium xenopi
Micobacterias cromgenas:
Mycobacterium asiaticum
Mycobacterium flavescens
Mycobacterium gordonae
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium marinum
Mycobacterium scrofulaceum
Mycobacterium simiae
Mycobacterium szulgai
Mycobacterium xenopi
De crecimiento rpido:
Micobacterias no cromgenas:
Mycobacterium abscesus
Mycobacterium chelonae
Mycobacterium fortuitum
Mycobacterium mucogenicum
Mycobacterium smegmatis
Micobacterias cromgenas:
Mycobacterium phlei
Mycobacterium vacae
*Segn un esquema modificado, tomado Vicent y col4.
69
porque se aslan con relativa frecuencia en

los laboratorios clnicos vamos a resear
algunas de ellas:
Mycobacterium avium
Se ha aislado del agua, plantas, tierra y
otras fuentes ambientales. Tienen baja patogenicidad y conocer el verdadero significado clnico de su aislamiento a partir de
muestras respiratorias suele ser muy difcil.
Cuando se aslan repetidamente ante cuadros clnicos similares a TB y no se encuentran otros patgenos puede ser que tengan
significacin clnica. Entre 1983 (aparicin
del SIDA) y 1997 (eclosin de la terapia antiretroviral intensiva) fue la causa mas frecuente de infeccin por micobacterias en
los Estados Unidos. Sola afectar a pacientes
con recuentos de CD4 inferiores a 50/mm3,
dando lugar a un cuadro diseminado (con
aislamiento en hemocultivos) que poda
afectar a cualquier rgano. Cuando fue descrito este cuadro, la TB en EEUU se hallaba
muy controlada y la infeccin por M. avium
fue una de las formas ms frecuentes de presentacin del SIDA5,6. En otros pases como
es el caso de Espaa, la incidencia de TB al
descubrirse el SIDA era alta y la principal
infeccin por micobacterias en los pacientes coinfectados con el VIH, siempre ha sido
la tuberculosis, siendo la infeccin por M.
avium mucho menos frecuente7. La morfologa del microorganismo en las tinciones es
cocobacilar y sus colonias en los medios de
cultivo son muy heterogneas.
Mycobacterium kansasii
Es una de las especies que se asla con
ms frecuencia en casos de micobacteriosis.
Produce cuadros clnicos semejantes a la
tuberculosis y su aislamiento a partir de
muestras respiratorias casi siempre suele
tener significado clnico. Pese a ello, antes
de atribuirle un significado clnico definitivo
se debe procurar su aislamiento repetido, al
igual que ocurre con todas las MNT8. Su
morfologa en la baciloscopia suele ser
caracterstica.
Mycobacterium gordonae
Se asla con frecuencia y no suele tener
significacin clnica. Hay muy pocos casos,
70
aproximadamente 20, documentados de

enfermedad producida por M. gordonae.
En cuanto al resto de micobacterias,
hay algunas a las que se atribuyen cuadros
clnicos especficos, como las infecciones
de piel debidas a M. marinum y M. ulcerans
(causante este ltimo de la lcera de Buruli), y otras que precisan enriquecimientos
especiales de los medios de cultivo para
poder crecer (Mycobacterium haemophilum y Mycobacterium genavense).
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO
El diagnstico microbiolgico de la
tuberculosis exige la deteccin, aislamiento e identificacin de M. tuberculosis, as
como la determinacin de su sensibilidad
frente a las drogas tuberculostticas. La
deteccin precoz del individuo bacilfero
es uno de los pilares bsicos de una buena
organizacin en la lucha contra la tuberculosis.
La sensibilidad y especificidad de los
distintos mtodos de deteccin es variable
y depende mucho de la experiencia e idiosincrasia de cada laboratorio en particular y
de cmo los adapte a su rutina de trabajo.
En general, el examen microscpico directo
de las muestras clnicas, mediante tcnicas
especficas de tincin (baciloscopia), es la
tcnica menos sensible pero la ms rpida.
Los cultivos son las ms sensibles y ms lentas, mientras que las tcnicas moleculares
basadas en amplificaciones genmicas tienen una sensibilidad menor que los cultivos
pero son ms rpidas.
La sensibilidad de la baciloscopia
aumenta cuando las muestras se concentran. El cultivo aumenta la sensibilidad de
la baciloscopia en un 30-60%, dependiendo
del laboratorio, del tipo de muestra, y de
los medios utilizados. La utilizacin de
medios lquidos ha mejorado notablemente los resultados del cultivo por lo que en
la actualidad, resultan imprescindibles. En
el laboratorio del Hospital de Navarra se
empez en 1996, a utilizar un medio lquido (BACTEC 460TB, Becton Dickinson),
junto con el medio slido clsico de
Lwenstein-Jensen (L-J). Posteriormente,
se observ que el 18,6% de los aislamientos de M. tuberculosis se realizaron exclusivamente en el medio lquido y el tiempo
medio de diagnstico se acort a 14,2 das,

frente a 22,7 das que tardaban en aparecer
las colonias en L-J.
Se han desarrollado una variedad de
pruebas inmunolgicas, que ponen de
manifiesto la respuesta especfica del husped frente al agente infeccioso. La prueba
de la tuberculina fue la primera empleada y
ha sido la ms utilizada, aunque no permite
diferenciar la infeccin de la enfermedad. Se
han descrito una variedad de pruebas in
vitro (QuantiFERON-TB Gold and TSPOT.TB) que miden la produccin de interferon-gamma frente a antgenos especficos
de micobacterias para ver la respuesta
inmune y de las que se ha tratado en el anterior captulo de este tratado9.
ORGANIZACIN DE LOS
LABORATORIOS
La American Thoracic Society recomienda que el diagnstico microbiolgico de la
tuberculosis se lleve a cabo, nicamente,
en laboratorios con las adecuadas medidas de seguridad y cuyo volumen de trabajo y competencia en el rea de las micobacterias est asegurada10.
En 1993, ante el resurgir de la tuberculosis en Estados Unidos, los Centers for
Disease Control and Prevention (CDC) de
Atlanta, dieron las siguientes recomendaciones para los laboratorios de micobacterias:
Proporcionar a los laboratorios los
medios para que puedan informar de los
resultados de los exmenes directos en 24
horas.
Exigir que los laboratorios utilicen tcnicas de tincin fluorescentes, ms sensibles que las clsicas de Ziehl-Neelsen.
Utilizar medios lquidos en el cultivo
primario, conjuntamente con el clsico de
L-J.
Utilizar medios rpidos de identificacin como sondas.
Realizar los estudios de sensibilidad en
medio BACTEC o similares, que proporcionen resultados fiables y rpidos.
La finalidad de estas recomendaciones
es proporcionar al clnico informacin
rpida que le sirva para la toma de deciAn. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2
siones, de modo que: los exmenes directos no se demoren ms de 24 h, el aislamiento e identificacin de M. tuberculosis
pueda realizarse en 10-14 das y los resultados del estudio de sensibilidad puedan
estar disponibles en 15-30 das11. La consecucin de estos objetivos es hoy factible
en muchos laboratorios.
Recogida y transporte de muestras

Un concepto clsico en el diagnstico
de la tuberculosis es que la eliminacin de
bacilos, en muchos casos puede ser intermitente. Este concepto lo avala el hecho
de que en ocasiones, entre varias muestras
procesadas, slamente una resulta positiva. Si bien es verdad que el estudio de
varias muestras incrementa las posibilidades de diagnstico, en la actualidad, con
las mejoras introducidas y la necesidad de
rentabilizar los procedimientos de diagnstico, hay laboratorios que han reducido de 3 a 2 el nmero de muestras respiratorias recomendadas para un procesamiento rutinario12,13. La mejor muestra es la
primera expectoracin de la maana. Las
muestras una vez obtenidas, bien cerrado
el frasco y bien identificadas, se transportan al laboratorio lo mas rpidamente
posible. Si va a transcurrir ms de una
hora entre la expectoracin y la recepcin
en el laboratorio deber permanecer en
fro (5-8C) y no a temperatura ambiente.
Se desaconseja la prctica de recomendar
al paciente que guarde 3 esputos y los
lleve a la vez al laboratorio ya que es muy
probable que se contaminen los cultivos y
no sean tiles ni para descartar ni para
confirmar el diagnstico. Se deben extremar las medidas en la identificacin de las
muestras para que no se produzcan errores en el diagnstico microbiolgico.
Tcnicas de tincin o baciloscopias

Tienen por objeto, poder visualizar en
el microscopio la presencia o no de BAAR
en las muestras. Actualmente siguen constituyendo la forma ms rpida y econmica para diagnosticar la TB. No obstante,
dado que su sensibilidad (40-70% en muestras respiratorias) y su especificidad no
son absolutas, es necesario realizar siempre cultivos para un diagnstico de certe71
za. Existen multitud de variantes descritas

de tcnicas para las baciloscopias; incluso
las hay para observadores daltnicos14. No
obstante las dos ms utilizadas son:
La tincin de Ziehl-Neelsen . Utiliza

fucsina y fenol junto con el calentamiento de las preparaciones. Las micobacterias se tien de rojo, colorante
que perdura pese a la posterior decoloracin con una mezcla de alcohol-clorhdrico, sobre un fondo azul o verde,
segn se utilice como colorante de contraste el azul de metileno o el verde
malaquita. Exige la observacin con el
objetivo de inmersin (1.000 aumentos), por lo que, debido a que en
muchas preparaciones la presencia de
bacilos puede ser escasa, es necesario
un mnimo de 10 minutos de observacin antes de valorar el examen como
negativo.
La s tinciones con flu orocromos .

Emplean como primer colorante la
auramina-rodamina. Se tien en fro y,
como en el caso anterior, tampoco se
decolora con la mezcla de alcohol-clorhdrico. Al observarlos en un microscopio de fluorescencia, las micobacterias
emiten una luz fluorescente. Esta luz
emitida puede ser detectada rpidamente. Las preparaciones se observan
con un objetivo de menor aumento,
con lo que la superficie visualizada es
mayor, lo cual hace que la tincin resulte ms sensible y requiera menos tiempo de observacin (1-2 minutos). Los
inconvenientes de esta tcnica son la
dificultad del enfoque, que requiere un
microscopio de fluorescencia, que
algunas MNT de crecimiento rpido
puede que no se tian, que puede a la
larga daar la vista del observador y,
sobre todo, que es necesario personal
con suficiente experiencia para visualizarlas. La decisin de utilizar una u
otra en cada laboratorio est en funcin del nmero de baciloscopias que
se realizan, la dotacin de personal (su
nmero y su experiencia) y del material
disponible. En una jornada laboral un
solo observador es prcticamente
imposible que pueda ver ms de 15-20
tinciones de Ziehl con garantas, mien-
72
tras que podra ver 50-60 tinciones fluorescentes.

Cuantificacin de las baciloscopias
El nmero de bacilos cido-alcohol
resistentes presentes en una muestra es
un ndice de la severidad de las lesiones y
del grado de infectividad, por lo que la
cuantificacin de las muestras positivas es
una prctica habitual pero hay que tener
en cuenta si la tincin se ha realizado de la
muestra directa o tras el proceso de HDC.
En muchos laboratorios, como en el nuestro, no se realiza rutinariamente una baciloscopia a la muestra directamente sino
que se hace siempre tras el proceso de
decontaminacin ya que se consigue
mayor sensibilidad. Cuando se utiliza un
fluorocromo3 y si nicamente se observan
hasta 9 bacilos en toda la preparacin, se
informa como Dudosa. Entre 1-9 bacilos en
10 campos, se informa: Positiva 1+. Entre 19 bacilos por campo, se informa: Positiva
2+. Entre 10-90 bacilos por campo, se informa: Positiva 3+; y si se observan mas de 90
bacilos por campo, se informa: Positiva 4+.
Morfologa de los BAAR
Habitualmente la morfologa de los
BAAR en las tinciones no permite diferenciar si se trata de una micobacteria u otra.
No obstante un observador experimentado puede sospechar que no se trata de
MTC cuando no aprecia su forma alargada
y su dishomogeneidad en la coloracin.
Hay que tener en cuenta que la morfologa
del bacilo se altera durante el tratamiento
tuberculosttico. M. kansasii puede observarse como muy largo y con morfologa
acebrada lo que, aunque no definitivo, es
muy caracterstico. M avium se ve como
bacilos muy cortos y con tincin uniforme.
Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium
chelonae pueden ser muy polimorfos.
Causas de falsos positivos
Existen una serie de circunstancias tcnicas que pueden dar lugar, en personal no
experimentado, a errores al informar como
BAAR acmulos de pigmento debidos: a la
presencia de restos de comida, aceites, cera
o fibras en la muestra, a la reutilizacin de
portas con fisuras en las que se acantona el
colorante o a la no filtracin de los reactivos. Otras veces se ven verdaderos BAAR

pero puede tratarse de MNT en vez de MTC
y ser saprofitos o colonizantes del paciente.
Tambin se dan casos de falsos positivos en
los que los BAAR visualizados no pertenecen al paciente; as, si las caeras del hospital estn colonizadas con MNT y utilizamos esta agua para preparar la solucin
decontaminante luego podremos visualizarlas en la baciloscopia, o bien cuando transferimos BAAR de un porta a otro con el aceite contaminado utilizado con el objetivo de
inmersin, en la microscopa ptica.
Causas de falsos negativos
Pueden encontrarse falsos negativos por
realizar un frotis demasiado grueso o demasiado fino, por desprendimiento del frotis si
calentamos excesivamente el porta. La falta
de tiempo, la impaciencia o el cansancio del
observador es la ms importante. En el caso
de tincin con fluorocromos la exposicin
excesiva a la luz UV pude hacer perder la
capacidad de emitir fluorescencia. Hay que
tener en cuenta que al hacer una extensin
del material en el porta para la realizacin
de la baciloscopia se utilizan 0,01 ml. Cuando en 1 ml de esputo hay un milln de BAAR
la baciloscopia siempre suele ser positiva
mientras que si hay 10.000 BAAR slo es
positiva en el 60%. La sensibilidad claramente disminuye cuando el n de BAAR/ml
de esputo es menor.
Persistencia de baciloscopias positivas
en pacientes recibiendo tratamiento
adecuado
A los 30 das de tratamiento el n de
BAAR visualizados en la tincin debe ser claramente inferior al de la baciloscopia inicial.
Hasta el 50% permanecen con baciloscopias
positivas al final del segundo mes y menos
del 20% son positivos al final del tercer mes.
Esta persistencia de baciloscopias positivas
no debe hacer pensar en fracaso del tratamiento siempre que los cultivos sean negativos. Estos deben ser negativos a partir de
los 30 das de tratamiento14.
TCNICAS DE CULTIVO
Los cultivos siguen siendo los mtodos
ms sensibles para la deteccin de MTC en
pacientes que no estn recibiendo tuberculostticos. Pueden detectar entre 10 y 100

bacilos/ml de esputo. A pesar del gran desarrollo y revolucin que han supuesto, desde
1990, las tcnicas moleculares, sobre todo
las basadas en amplificacin de cidos
nucleicos (AAN), ninguna de ellas, a fecha
actual, ha conseguido en estudios clnicos
ser tan sensible como los cultivos. Sin
embargo, precisaremos de medios de cultivo especficos ya que con la inoculacin
directa de la muestra en los medios de cultivo habituales no crecen las micobacterias.
El microbilogo por tanto debe ser informado de si a una muestra respiratoria se le
desea buscar una micobacteria o no.
La mayora de las muestras respiratorias (excepto el lquido pleural obtenido
por toracocentesis) contienen otros microorganismos que crecen rpidamente y que
es preciso eliminar para que puedan desarrollarse las micobacterias. Para ello se realizan unos procedimientos de decontaminacin de la muestra que a su vez la homogeneizan y la concentran (DHC). Estos procedimientos empleados para destruir las bacterias contaminantes deben preservar a las
micobacterias, sin embargo, no es posible
inactivar los contaminantes sin daar a las
micobacterias. Se acepta que el procedimiento es adecuado si se contaminan (y por
tanto no son tiles para establecer el diagnstico) un 5% de los cultivos realizados. Si
el porcentaje de cultivos contaminados es
inferior se asume que la decontaminacin
es excesiva y puede hacer que, si la cantidad de micobacterias presentes en la muestra es pequea, stas no sean viables y no
crezcan en los cultivos.
Todo el procesamiento, debe llevarse a
cabo en cabinas de seguridad biolgica y
por personal bien entrenado. Deben extremarse las medidas y los controles para evitar tanto la contaminacin del personal,
como la de otras muestras que se procesan al mismo tiempo15.
Existen diversos mtodos descritos
para decontaminar las muestras. Los ms
utilizados han sido los del laurilsulfato
sdico (descrito por Tacquet y Tison) y el
de la N-acetil-cistena-hidrxido sdico
(NALC-NaOH). En Europa se utilizaba ms
el del lauril y en USA el NALC-NaOH. El
73
mtodo del laurilsulfato sdico contina

manteniendo su actividad antibacteriana
durante todo el periodo de incubacin (y
no slo durante la inoculacin) cuando se
utilizan medios de cultivo lquidos o con
base de agar, lo cual puede disminuir su
rendimiento. Es muy buena opcin cuando
se utilizan medios en base de huevo ya que
la lecitina inactiva la accin antibacteriana14. La incorporacin rutinaria en los ltimos 10 aos de los medios lquidos ha
hecho que la mayor parte de los laboratorios utilicemos el NALC-NaOH siguiendo
las recomendaciones de los proveedores y
de los CDC16.
Estos mtodos de DHC son muy laboriosos y tediosos para los trabajadores
durando varias horas y en ellos hay una
serie de variables que pueden incidir en
que luego podamos recuperar o no el MTC.
La concentracin del decontaminante, el
tiempo que est en contacto con la muestra, las revoluciones y la temperatura de la
centrfuga son las ms importantes.
Una vez que las muestras se han decontaminado y concentrado, se procede a la
realizacin de las extensiones para tincin
y a la inoculacin de los medios de cultivo.
Cada vez es mayor el nmero de laboratorios que adems hacen tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos (AAN), bien sea
de forma inmediata (en el mismo da) o diferida (1-3 veces por semana).
La incubacin de los medios de cultivo
se realiza a 35-37C que es la temperatura
ptima para el desarrollo de la mayora de
las micobacterias, con excepcin de las
muestras de piel que deben incubarse adems a 28C ya que muchas micobacterias
que producen infecciones de la piel y tejido subcutneo se aslan a esta temperatura. Los cultivos se mantienen un mnimo
de 7 semanas antes de descartarlos como
negativos.
Los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos. stos a su vez se diferencian
en que la base sea agar (las diferentes
variantes del agar Middlebrook son las
ms utilizadas) o de huevo (el medio L-J y
el medio Coletsos son los ms utilizados).
La deteccin del crecimiento depende
del tipo de medios empleados. Con los
medios slidos en base de huevo la detec74
cin se realiza mediante la observacin

macroscpica 1 vez por semana. Si utilizamos medios en base de agar habr que
visualizarlos con el microscopio (100
aumentos) 2-3 veces por semana (Figs. 1 y
2). Los medios en base de agar cada vez
son menos utilizados de forma rutinaria ya
que consumen mucho tiempo de personal
experimentado para poder leerlos y a que
la fundamental ventaja que antao tenan,
que era la deteccin ms precoz del crecimiento, es menor desde la incorporacin
de los medios lquidos.
Los medios lquidos son ms sensibles
que los slidos y adems detectan el crecimiento ms precozmente. Antiguamente
slo se utilizaban en muestras muy concretas como lquidos cefalorraqudeos. A
principios de la dcada de los 80 sali al
mercado un sistema denominado BACTEC
460, hoy en da comercializado por Becton
Dickinson (BD), que consiste en unos frascos con medio lquido Middlebrook 7H9
modificado (denominado Middlebrook
7H12) en que el cido palmtico del medio
est marcado con un istopo del carbono.
Los viales son ledos 2-3 veces por semana
las dos primeras semanas y 1 vez por
semana las cinco restantes en un aparato
que pincha el frasco y detecta si hay o no
crecimiento bacteriano en funcin de la
radiactividad medida. Constituye el patrn
de referencia con el que se comparan
todos los medios antes de ser aprobados
para su uso diagnstico. Slo algunos hospitales dotados de infraestructura para
trabajar con material radiactivo lo introdujeron en su rutina de trabajo.
A partir de 1995 empiezan a salir al
mercado medios lquidos que obvian el
problema de la radiactividad y del tener
que pinchar el frasco (con la terica posibilidad de contaminar un frasco con bacterias del frasco anterior). Estos medios se
introducen en unos aparatos que incuban
los frascos y a su vez realizan una monitorizacin continua de la actividad metablica que hay en su interior para ver si hay
crecimiento o no. Los ms utilizados son el
MGIT (Mycobacterial Growth Indicator
Tube, BD), el ESP Culture System II (Trek
Diagnostic Systems) y el MB/ BacT ALERT
3D (BioMerieux). MGIT utiliza un sensor de
fluorescencia, ESP de presin y MB/BacT
Figura 1. Imagen de Mycobacterium tuberculosis en medio Middlebrook 7H11 tras crecimiento en medio
lquido MGIT.
Figura 2. Imagen de una colonia de Mycobacterium no tuberculosis (MNT) en medio Middlebrook

7H11.
75
de colorimetra para detectar el crecimiento. Estos sistemas se han introducido en la

mayor parte de los laboratorios y han
constituido un gran avance.
TCNICAS DE IDENTIFICACIN
Una vez que se ha detectado crecimiento en alguno de los medios, se realiza
la tincin de Ziehl-Neelsen para ver si lo
que ha crecido son BAAR o no (Fig. 3).
Caso de ser BAAR, su morfologa nos
puede orientar, en algunas ocasiones,
hacia una especie u otra como en el caso
de M. avium o de M. kansasii. Adems la
visualizacin de BAAR formando cordones
(en medios lquidos) es muy caracterstica
del crecimiento de M. tuberculosis, aunque
no patognomnica (Fig. 4)17.
Lo prioritario para el manejo de los
pacientes es saber si se trata de MTC o de
MNT. Para ello, hoy en da, la mayora de
los laboratorios realizan la identificacin
de MTC mediante sondas genticas debido
a su rapidez, precisin y simplicidad.
Tradicionalmente la identificacin se
realizaba en base a una serie de caractersticas fenotpicas. La velocidad de crecimiento en los cultivos y la temperatura
ptima para ello, la morfologa de la colonia, su pigmentacin y su fotorreactividad
orientaban preliminarmente hacia unas
micobacterias u otras y posteriormente se
realizaban pruebas bioqumicas a partir de
la cepa crecida. Se considera que una micobacteria es de crecimiento lento cuando al
hacer un subcultivo de una cepa, en
medios de cultivo como el L-J, tardan ms
de 5-7 das en apreciarse las colonias
macroscpicamente. Es cromgena cuando
la colonia presenta pigmentacin (Fig. 5),
no cromgena cuando no la presenta y fotocromgena cuando pigmenta tras exposicin a la luz. M. tuberculosis es una micobacteria no cromgena (Fig. 6) y de crecimiento lento. Sin embargo, cuando la baciloscopia es muy positiva, crece en los cultivos en medios lquidos en menos de una
semana. Algunas de las pruebas bioqumi-
Figura 3. Tincin de Ziehl-Neelsen de Mycobacterium no tuberculosis (MNT) tras crecimiento en medio

lquido MGIT.
76
Figura 4. Tincin de Ziehl-Neelsen de Mycobacterium tuberculosis (MNT) tras crecimiento en medio

lquido MGIT con formacin de cordn (cord factor).
Figura 5. Crecimiento de colonias de una micobacteria cromgena en medio

Lwenstein-Jensen.
Figura 6. Crecimiento de colonias de Mycobacterium tuberculosis en medio Lwenstein-Jensen.
77
cas utilizadas en la identificacin de las

micobacterias son el test de acumulacin
de niacina, la reduccin de los nitratos, la
hidrlisis del Tween, la catalasa, la captacin de hierro, la pirazinamidasa, la deteccin de actividad ureasa, arylsulfatasa, etc.
Estos mtodos clsicos, basados en
pruebas bioqumicas, son muy lentos,
laboriosos y peligrosos para el trabajador
(adems del riesgo de contagio, ya que se
requiere trabajar con inculos fuertes de
micobacterias vivas, hay pruebas bioqumicas como la de la niacina, que suele ser
positiva en M. tuberculosis en la que se formaban compuestos de cianuro).
Hoy en da, la mayora de los laboratorios realizan la identificacin de MTC
mediante sondas genticas. A principios
de la dcada de los 90 se comercializaron
sondas muy sensibles y especficas que
permiten la identificacin en 2 horas
(AccuProbe, Gen-Probe Inc, San Diego,
CA). Se trata de una prueba de hibridacin
en la que la sonda est compuesta por
DNA de cadena nica, complementario del
RNA ribosomal de la micobacteria problema, y al que se ha unido un marcador quimioluminiscente. El RNA de la bacteria se
libera previamente mediante su rotura con
ultrasonidos. La sonda de DNA marcado
combina con el RNA de la bacteria problema dando un hbrido estable DNA:RNA. La
seal emitida por el hbrido marcado
DNA:RNA se mide en un luminmetro,
dando un resultado positivo o negativo,
segn alcance o no un umbral establecido.
Tiene la limitacin de que no permite la
diferenciacin entre las diferentes variantes del complejo MTC. La diferenciacin
entre ellas se har mediante pruebas bioqumicas clsicas como la produccin de
nitritos y la sensibilidad a pirazinamida o
mediante estudios moleculares. Tambin
existen y se utilizan sondas para la identificacin del grupo Mycobacterium aviumintracellulare, M. avium, M. intracellulare,
M. gordonae y M. kansasii que son las especies que se aslan con ms frecuencia.
Para la identificacin de especies distintas de stas, se recurre a distintos procedimientos. Los mtodos clsicos de identificacin estn siendo sustituidos por los cromatogrficos o gentico-moleculares18.
78
Identificacin cromatogrfica
mediante anlisis de los cidos
miclicos
Los cidos miclicos son cidos grasos de alto peso molecular que forman
parte de la pared celular de las micobacterias y otros gneros relacionados (Nocardia , Corynebacterium, Rhodococcus, Tsukamurella , etc.) El anlisis de los steres de
estos cidos con diferentes tcnicas cromatogrficas permite realizar una identificacin rpida, precisa y reproducible. La
cromatografa lquida de alta eficiencia
(HPLC) ha sido la que ms se ha desarrollado y estandarizado. No obstante se
requiere partir de abundante masa de bacterias para poder realizarlas lo cual implica que se necesita ms tiempo hasta conseguir que el cultivo alcance la suficiente
masa. Son tcnicas complejas, que requieren una infraestructura costosa, un gran
entrenamiento del personal por lo que son
pocos los centros con dotacin y experiencia suficiente para realizarlas.
Identificacin mediante estudios

gentico-moleculares
El genoma completo de una cepa de
MTC se ha secuenciado y contiene 4,4
millones de pares de bases, 4.000 genes
que codifican protenas y 50 que codifican
RNA4. Las micobacterias contienen regiones bien conservadas de su DNA especficas de gnero y regiones hipervariables
especficas de especie. Estas ltimas son
las que se utilizan como dianas, siendo las
mejor estudiadas: el gen hsp65, que codifica la protena de 65 KDa (heat shock),
regiones genmicas de la subunidad ribosmica 16S, la regin intergnica 16S-23S y
los elementos de insercin. El grupo de
tcnicas que mayor inters y desarrollo
tienen hoy en da se basan en la AAN de
algunas de las secuencias citadas. Algunas
de las ms utilizadas son:
PCR-RFLP (PRA)
Consiste en realizar una PCR (reaccin
en cadena de la polimerasa), que es una de
las tcnicas de AAN ms utilizada, del gen
hsp65 seguida de un posterior anlisis del
polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) tras la apliAn. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2
cacin de 2 enzimas (BstEII y HaeIII) sobre

lo amplificado. Fue descrita en 1992 y, en
1993 el asturiano Telenti19,20 la simplific y
modific habiendo sido utilizada por multitud de centros (en la pgina web
http://app.chuv.ch/prasite/index.html se
pueden consultar los patrones de los polimorfismos encontrados). Consigue una
identificacin rpida (en una jornada laboral), precisa y econmica de mltiples
cepas. Tiene muchsima capacidad discriminatoria, siendo capaz de diferenciar
unas 36 especies diferentes y las subespecies de los diferentes complejos micobacterianos, pero no discrimina las diferentes
variantes del MTC. No necesita mucha
masa de micobacterias y el equipamiento
necesario no es excesivamente caro. Aunque bastante estandarizado tiene el inconveniente de que no es un mtodo demasiado sencillo de realizar y que no est
comercializado ni aprobado por la FDA.
Secuenciacin del DNA
La secuenciacin completa del 16S
rDNA (1.500 pares de bases) o del hsp65
(400 pares de bases) est fuera del alcance
de la mayora de los laboratorios. La identificacin dentro del 16S rDNA de secuencias especficas de especie, permite el
diseo de protocolos sencillos de PCR
seguidos de secuenciacin de lo amplificado. Aunque la mayora de los laboratorios
no dispone de secuenciadores automatizados se pueden enviar los amplicones obtenidos a centros de referencia para que los
secuencien. Esta tcnica permite la identificacin de muchas micobacterias en las
que no es posible hacerlo por mtodos
fenotpicos y constituye el patrn de referencia de las identificaciones genotpicas.
El rpido progreso de la tecnologa con la
aparicin de nuevos secuenciadores capilares de microchips de secuenciacin, es
posible que facilite la difusin en el futuro
de estas tcnicas.
DNA). Se aplica el producto amplificado

frente a diversas sondas en una sola prueba. Existen 2 productos comerciales con
tiras de nitrocelulosa (INNO-LIPA y
GenoType). Ambos se basan en la amplificacin de una secuencia gentica concreta
(espacio intergnico 16S-23S y el 23S rDNA
respectivamente) y su posterior hibridacin. Los resultados se obtienen en 5-6
horas, son de fcil lectura e interpretacin
y adems permiten detectar posibles coinfecciones. La sensibilidad y especificidad
de ambas es muy buena. En la tira de
INNO-LiPA hay 16 sondas que permiten la
deteccin de MTC, M. kansasii (subtipos I,
II y III y Mycobacterium gastri), Mycobacterium xenopi, M. gordonae, M. genavense, M.
simiae, M. marinum / ulcerans, Mycobacterium celatum, M. avium complex, M. avium,
M. intracellulare (grupo I y II), Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium malmoense, M. haemophilum, M. chelonae complex (grupo I y II), M. fortuitum complex y
Mycobacterium smegmatis. GenoType incluye diversas tiras con diferentes niveles de
identificacin. Una primera para 14 especies: MTC, M. kansasii, M. xenopi, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium peregrinum, M. marinum / ulcerans, Mycobacterium
abscessus, M. avium, M. intracellulare,
Mycobacterium scrofulaceum, M. chelonae,
M. gordonae, M. fortuitum y M. malmoense.
Una segunda tira dispone de otras 16 identificaciones posibles y una tercera permite
identificar las diferentes variantes de MTC.
Los chips (arrays) de DNA son los formatos de hibridacin con ms futuro
(actualmente no esta generalizado su uso)
por su flexibilidad tanto para la identificacin como para la deteccin de mecanismos genticos de resistencia a tuberculostticos.
Hibridacin en fase slida
Cada mtodo de aproximacin taxonmica tiene su utilidad y ninguno por s solo

puede dar un resultado seguro al 100%. Las
caractersticas fenotpicas clsicas son tiles inicialmente para decidir la cronologa
de los medios de identificacin a utilizar.
Se basa en la disponibilidad de sondas

cortas de DNA especficas de especie, presentadas en formatos convencionales (placas con micropocillos, tiras de nitrocelulosa, etc.) o novedosos (chips o arrays de
Dentro del complejo M. tuberculosis, la

diferenciacin de las distintas variantes
puede realizarse mediante pruebas bioqumicas clsicas como la produccin de
nitritos y la sensibilidad a pirazinamida o
79
mediante estudios moleculares, como

RFLP con IS6110 u otros.
Siempre hay que intentar la identificacin de toda micobacteria, aislada de
muestras clnicas, a nivel de especie aunque no se sepa su valor como patgeno.
PRUEBAS DIRECTAS DE DETECCIN

DE CIDOS NUCLEICOS DE MTC EN
MUESTRAS CLNICAS
Tienen por objeto detectar e identificar
sobre la muestra (y no sobre los cultivos)
la presencia de micobacterias del complejo tuberculosis. En teora seran capaces
de detectar la presencia de una sola micobacteria en la muestra, pero en la prctica
ningn estudio ha demostrado que sean
tan sensibles como los medios de cultivo
lquido. S que son ms sensibles que las
baciloscopias y ms rpidos que los cultivos. Habitualmente no se realizan sobre la
muestra directa sino sobre el producto
obtenido tras el proceso de DHC. En 24-48
horas desde la entrada de la muestra al
laboratorio se puede detectar si hay o no
MTC en la muestra. Existen varios en el
mercado21-23, que a continuacin se citan.
Amplified Mycobacterium
tuberculosis direct (AMTD)
Fue el primero aprobado por la FDA (se
comercializ por Gen Probe en 1993) y es el
ms ampliamente evaluado y utilizado. Es
una amplificacin mediada-transcripcin
realizada a temperatura constante (42C).
La diana es una secuencia especfica del
16S rRNA de la cual hay unas 4000 copias
por cada bacteria de MTC, lo cual es una
ventaja ya que en el resto de las tcnicas la
secuencia diana es menos frecuente. Un
porcentaje importante de los laboratorios
lo han incorporado a su rutina diagnstica,
si bien el coste en reactivos de cada determinacin (a modo orientativo unos 36 vs
8 que puede costar un medio lquido y 1
que cuesta un tubo de L-J) ha dificultado
su implantacin. Los resultados se obtienen en 3-5 horas.
AMPLICOR M. tuberculosis PCR tests

Basado en una PCR es similar al anterior, pero ligeramente menos sensible y
80
especfico y adems la tcnica es algo ms

larga (6-8 horas). Ha sido comercializada
por Roche y tambin aprobada por la FDA.
Otras menos utilizadas son el SDA
(Strand Displacement Amplification, comercializado por BD como BDProbeTec ET) y la
LCR (Ligase Chan Reaction, comercializada por Abbott).
PCR en tiempo real

Como norma general, esta novedosa
tecnologa permite resultados ms rpidos, especficos y es ms facil de realizar
que las tcnicas de AAN anteriormente
citadas. En el momento actual y en lo que
se refiere a su aplicacin al diagnstico de
MTC todava no hay suficientes evaluaciones concluyentes sobre su utilidad pero es
de esperar que aparezcan en un futuro
inmediato. El hecho de que estas tcnicas
requieran inicialmente la extraccin de los
cidos nucleicos, que en el caso de las
micobacterias es especialmente difcil por
las caractersticas de su pared celular, y
que su manejo en el laboratorio presenta
la dificultad del riesgo de contagio, pueden
haber ralentizado el desarrollo de la PCR
en tiempo real.
TCNICAS MOLECULARES PARA

TIPIFICACIN DE MTC. INTERS
EPIDEMIOLGICO
Durante mucho tiempo, para el estudio
de brotes se han utilizado marcadores
fenotpicos que no tenan suficiente capacidad para discriminar las posibles diferencias que pudieran existir entre una
cepa y otra. El desarrollo, a partir de 1991,
de diversos mtodos moleculares de tipificacin ha permitido comparar las huellas
genticas de los distintos aislamientos y,
por tanto, establecer diferencias entre
diversas cepas. Al diferenciar las cepas aisladas, ha sido posible obtener nueva informacin sobre la epidemiologa de la enfermedad lo que ha cambiado muchos conceptos que se haban aceptado durante
dcadas. As, se cree actualmente que la
transmisin reciente de MTC puede ser un
factor ms importante de lo que se supona, oscilando, en nuestro entorno, entre el
28% de Segovia y el 58% de Gran Canaria.
Se ha podido demostrar la conexin epideAn. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2
miolgica en brotes de tuberculosis multirresistente en Espaa. Hay datos de epidemiologa molecular, referentes a la cepa
Beijinj que permite suponer que hay
cepas ms virulentas o bien ms transmisibles que otras, cosa que antes era impensable24. Tambin ha permitido documentar
ms contaminaciones cruzadas en los
laboratorios de las que se sospechaban.
Las tcnicas ms conocidas se recogen a
continuacin.
IS6110 RFLP
La IS6110 es una secuencia de insercin
de 1.335 pares de bases que se repite entre
0 y 25 veces en diferentes lugares del cromosoma de cada cepa de MTC. El anlisis
de los polimorfismos de la longitud de los
fragmentos de restriccin (RFLP) utilizando como secuencia diana la IS6110 es el
mtodo ms utilizado y el que se considera de referencia. Se realiza siguiendo un
protocolo estandarizado y es una tcnica
muy reproducible y til para distinguir
entre los aislamientos relacionados epidemiolgicamente de los no relacionados, de
modo que se ha utilizado como indicador
de transmisin reciente. Presenta algunas
limitaciones, ya que no puede utilizarse si
la micobacteria tiene menos de 6 copias de
este fragmento en su cromosoma, en cuyo
caso es preciso la utilizacin de otras tcnicas. Adems, requiere grandes cantidades de ADN (lo que implica la realizacin
de subcultivos que precisan varias semanas), es tcnicamente complejo y caro.
Spoligotyping
Es un mtodo muy utilizado por su relativa simplicidad, rapidez y bajo coste,
generalmente como complemento del
anterior. Estudia la presencia o ausencia
de 43 fragmentos de ADN, llamados espaciadores. Requiere menos ADN que el anterior y, al expresarse en forma de positivo o
negativo (de cada espaciador), puede analizarse en un formato digital. Existe una
base de datos internacional con ms de
11.000 patrones (espoligotipos) de aislamientos obtenidos en ms de 90 pases11.
Es muy til para la confirmacin de la identificacin de las diferentes variantes dentro del MTC. Sin embargo, este mtodo no
reemplaza por completo al RFLP por su

menor poder discriminante.
Nmero variable de repeticiones en

tndem (variable number tndem
repeat, VNTR)
El mtodo se basa en la deteccin del
nmero de veces que se repiten de forma
adyacente varias secuencias dentro del
genoma de la micobacteria. El ms utilizado es el Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-variable-number tndem repeat
analysis (MIRU-VNTR), que determina las
unidades repetitivas en 12 loci tras una
PCR. En cada uno de los 12 loci hay de 2 a
8 alelos, lo que da lugar a unos 20 millones
de posibles combinaciones de alelos. El
MIRU-VNTR es ms discriminante que el
spoligotyping y, similar al basado en RFLPIS61101, se puede automatizar y tcnicamente es ms simple, por lo que es previsible que se imponga como mtodo de
referencia. Existe una base de datos internacional accesible por Internet para poder
comparar los hallazgos.
Mtodos que utilizan el genoma

completo
Estn prcticamente fuera del alcance
de casi todos los laboratorios de investigacin y son impensables, hoy en da, para
los laboratorios clnicos. Inicialmente se
somete el DNA completo a enzimas de restriccin y luego se hace una AAN selectiva
de las zonas parcialmente complementarias o/y contiguas a la zona donde actan
los enzimas de restriccin. Es capaz de
detectar mnimos cambios en las bases de
los fragmentos amplificados.
ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD
Su finalidad es poder predecir, si la
cepa aislada responder al tratamiento
tuberculosttico convencional o bien si
presenta algn mecanismo de resistencia
que indican que una determinada droga no
va a ser efectiva.
Antao en lugares donde los ndices de
resistencia eran bajos, menores del 4%
para la Isoniacida (INH) se desaconsejaba
la realizacin de los estudios de sensibilidad. Una metodologa inadecuada, en no
81
pocas ocasiones, daba lugar a que se recomendase el uso de drogas ms txicas y

menos eficaces con el consiguiente perjuicio para el paciente y para la salud pblica.
El incremento de cepas resistentes
registrado a partir de los aos 90, hace que
los estudios de sensibilidad sean recomendables hoy en da frente a todas las cepas
de M. tuberculosis que se aslan inicialmente a cualquier paciente. Aunque cada
vez la tecnologa es ms sencilla, el hecho
de que cada laboratorio, en los pases
desarrollados, no asle suficientes cepas
para coger la experiencia necesaria ha de
hacer que se plantee su realizacin o la
derivacin del estudio, hacia centros con
ms experiencia o/y mejor tecnologa4.
El problema de la resistencia en la
tuberculosis est ligada al hecho de la elevada concentracin bacteriana presente
en las lesiones. En la tuberculosis pulmonar, la mayor concentracin bacteriana se
da en las lesiones cavitadas que pueden
contener hasta 107 109 organismos, mientras que la concentracin presente en los
focos caseosos, no suele exceder los 102
104. Desde 1949, era un hecho conocido,
que la aparicin de resistencias, se daba
con mucha ms frecuencia en el tratamiento de lesiones cavitadas25,26.
David27 en 1970, demostr la probabilidad de distribucin de mutantes resistentes, mediante un test de fluctuacin, con el
que puso en evidencia, que M. tuberculosis
adquira espontneamente una mutacin
que le haca resistente a isoniacida, estreptomicina, etambutol y rifampicina con una
frecuencia media de 3x10-8, 3x10-8, 1x10-7, y
2x10-10 respectivamente. De este modo, la
probabilidad terica de adquirir una mutacin que confiera resistencia a dos drogas
es menor a 10-15. De ah que la base del tratamiento de la tuberculosis sea el empleo de
varias drogas efectivas simultneamente.
Los criterios para definir la resistencia
a una droga en M. tuberculosis se han tomado sobre una base emprica, teniendo en
cuenta que a partir de una cierta proporcin en el nmero de mutantes resistentes,
la droga no va a ser efectiva. En base a
estudios clnicos y bacteriolgicos, se
acepta como proporcin crtica la del 1%.
Si se produce un crecimiento por encima
82
de esta proporcin, se valora la cepa como

resistente.
Para estudiar la sensibilidad de las
micobacterias, se emplea generalmente el
mtodo de las proporciones, es decir se
compara el nmero de colonias que crecen
en un medio con droga y el nmero de colonias que crecen en el mismo medio libre de
droga. Si el nmero de colonias en el primero no llega al 1% del segundo, la droga se
considera efectiva. Los medios que contienen huevo, tipo L-J, no son adecuados para
el antibiograma. En un intento por conseguir una uniformidad en los estudios de
sensibilidad el CDC y el NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards)
recomiendan la utilizacin del medio agar
de Middlebrook 7H10 o 7H1128, 29.
La realizacin del antibiograma en
medios lquidos cada vez es ms frecuente
por su relativa sencillez, reproducibilidad
y rapidez, ya que los resultados pueden
obtenerse en 5-10 das, frente a 3 semanas
que requieren los medios slidos. En el
mtodo radiomtrico BACTEC, que equivale a una versin modificada del de las proporciones, la resistencia se determina
comparando el crecimiento que se detecta
en un vial control sin droga y en otro igual
que contiene la droga que se quiere testar.
El vial que contiene droga se inocula con
una concentracin de bacterias 100 veces
superior a la del control sin droga. Los viales se leen diariamente, registrndose su
ndice de crecimiento. Se determina la diferencia entre los ndices que se registran en
das consecutivos. Cuando el ndice de crecimiento en el vial control alcanza un valor
determinado, se interpretan los resultados
del siguiente modo: si la diferencia entre
los ndices de crecimiento, es menor en el
vial que contiene droga que en el control,
la poblacin es sensible; si mayor, es resistente30. Se debe hacer constar cul es la
concentracin o concentraciones a la/s
que se ha testado el frmaco. Es posible
que cepas resistentes a INH a concentraciones bajas y sensibles a concentraciones
altas respondan a INH y no se deba suspender su prescripcin. Los estudios se
realizan frente a los 4 tuberculostticos
principales: isoniacida, estreptomicina,
rifampicina y etambutol. La pirazinamida
solamente es activa en medio cido por lo
que es preciso bajar el pH del medio, con

lo que muchas veces, queda comprometido el crecimiento bacteriano. El sistema
BACTEC ha resuelto este problema utilizando una modificacin del medio de cultivo para el estudio de esta droga.
Aunque con menos experiencia que
con el BACTEC radiomtrico tambin se
han desarrollado y adaptado los antibiogramas a otros medios lquidos como el
ESP, el MGIT y el MB/BacT ALERT 3D.
Los estudios de sensibilidad frente a
otras drogas resultan problemticos y no
estn bien estandarizados31. La utilidad de
los antibiogramas de MNT para guiar el
tratamiento de las micobacteriosis no est
clara. Puede ser til testar M. avium frente
a macrlidos y M. kansasii frente a rifampicina
Cuando el paciente, por datos epidemiolgicos conocidos, es probable que
albergue una cepa de MTC resistente y la
baciloscopia sea claramente positiva,
puede plantearse realizar el antibiograma
directamente de la muestra. Posteriormente se debe confirmar el antibiograma
con la tcnica estandarizada a partir del
cultivo31.
Se han descrito diversos genes cuya
mutacin se asocia con la resistencia a
drogas. As, la resistencia a rifampicina en
ms del 96% de los casos se debe a una
mutacin en el gen rpo. En cuanto a la isoniacida, se han descrito diversos genes
katG, inhA, ahpC, kasA, que en su conjunto
son responsables de la resistencia a esta
droga aproximadamente en un 90% de los
casos; la resistencia a etambutol en un 4765% de los casos, se debe a una mutacin
en el gen embB y la resistencia a estreptomicina en un 70% se debe a la mutacin del
gen rpsL. Se han desarrollado mltiples
mtodos moleculares para detectar la
posible existencia de estos mecanismos de
resistencia con el objeto de no tener que
esperar los 5-10 das que puede tardar el
antibiograma a partir de que la cepa este
aislada, pero todava no son lo suficientemente simples como para incorporarlos a
la rutina diagnstica32.
En el Hospital de Navarra, el promedio
del porcentaje de cepas resistentes a isoniacida en 5 aos (1998-2002) es del 7%,
que es un ndice relativamente alto, sin

embargo, la incidencia de cepas multirresistentes es decir, resistentes al menos a
isoniacida mas rifampicina, en ese mismo
perodo de tiempo, no lleg al 2%.
CONSIDERACIONES FINALES
1. La baciloscopia sigue siendo el mtodo
ms rpido y barato para diagnosticar
la TB en nuestro medio.
2. El diagnstico de certeza se establece
con el aislamiento en cultivo e identificacin de M. tuberculosis a partir de
muestras clnicas.
3. La utilizacin sistemtica de medios de
cultivo lquidos ha aumentado su sensibilidad y rapidez. Tambin ha hecho
que se aslen ms micobacterias no
tuberculosas cuya significacin clnica
es, en muchas ocasiones, difcil de establecer.
4. Los estudios de sensibilidad deben realizarse a todo primer aislamiento de M
tuberculosis en centros acreditados y
con suficiente experiencia.
5. El gran desarrollo de la tecnologa
molecular de cidos nucleicos ha permitido en muchos laboratorios que la
deteccin e identificacin de M tuberculosis y otras micobacterias sea ms
rpida y precisa.
6. Las tcnicas moleculares estn permitiendo conocer mejor los factores de
virulencia del microorganismo, sus
mecanismos de resistencia y aspectos
epidemiolgicos de las micobacteriosis, que redundarn en un mejor manejo de la enfermedad y de los pacientes.
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85

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Microbiologa de la tuberculosis

Durante un siglo, el diagnstico microbiolgico de

For a century, the diagnosis of tuberculosis, based

La incorporacin rutinaria de medios de cultivo

The routine incorporation of liquid mediums and

La actual eclosin de las tcnicas moleculares est

The present blossoming of molecular techniques

Palabras clave. Mycobacterium tuberculosis. Diagnstico microbiolgico. Medios lquidos. Gentica

An. Sist. Sanit. Navar. 2007; 30 (Supl. 2): 67-84.

1. Servicio de Microbiologa. Hospital de Navarra. Pamplona.

An. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2

no conocidas previamente. Durante

Tabla 1. Principales micobacterias aisladas de muestras clnicas*.

Mycoba cterium tuberculosis complex

*Segn un esquema modificado, tomado Vicent y col4.

An. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2

porque se aslan con relativa frecuencia en

aproximadamente 20, documentados de

medio de diagnstico se acort a 14,2 das,

Recogida y transporte de muestras

Tcnicas de tincin o baciloscopias

za. Existen multitud de variantes descritas

La tincin de Ziehl-Neelsen . Utiliza

La s tinciones con flu orocromos .

tras que podra ver 50-60 tinciones fluorescentes.

colorante o a la no filtracin de los reactivos. Otras veces se ven verdaderos BAAR

pacientes que no estn recibiendo tuberculostticos. Pueden detectar entre 10 y 100

mtodo del laurilsulfato sdico contina

cin se realiza mediante la observacin

Figura 2. Imagen de una colonia de Mycobacterium no tuberculosis (MNT) en medio Middlebrook

de colorimetra para detectar el crecimiento. Estos sistemas se han introducido en la

Figura 3. Tincin de Ziehl-Neelsen de Mycobacterium no tuberculosis (MNT) tras crecimiento en medio

An. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2

Figura 4. Tincin de Ziehl-Neelsen de Mycobacterium tuberculosis (MNT) tras crecimiento en medio

Figura 5. Crecimiento de colonias de una micobacteria cromgena en medio

Figura 6. Crecimiento de colonias de Mycobacterium tuberculosis en medio Lwenstein-Jensen.

cas utilizadas en la identificacin de las

Identificacin mediante estudios

cacin de 2 enzimas (BstEII y HaeIII) sobre

DNA). Se aplica el producto amplificado

Hibridacin en fase slida

Cada mtodo de aproximacin taxonmica tiene su utilidad y ninguno por s solo

Se basa en la disponibilidad de sondas

Dentro del complejo M. tuberculosis, la

An. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2

mediante estudios moleculares, como

PRUEBAS DIRECTAS DE DETECCIN

AMPLICOR M. tuberculosis PCR tests

especfico y adems la tcnica es algo ms

PCR en tiempo real

TCNICAS MOLECULARES PARA

reemplaza por completo al RFLP por su

Nmero variable de repeticiones en

Mtodos que utilizan el genoma

pocas ocasiones, daba lugar a que se recomendase el uso de drogas ms txicas y

de esta proporcin, se valora la cepa como

que es preciso bajar el pH del medio, con

que es un ndice relativamente alto, sin

2. COLLINS CH, GRANGE JM, YATES MD.

procedures. En: Murray P.R., editor. Manual

tcnicas moleculares. Enferm

16. KENT PT, KUBICA GP. Public health

26. HOWARD WL, MARESH F, MUELLER EE, YANITELLI