UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE
INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Determinacin de la biomasa: Recuento microscpico en

cmara de Neubauer.
CURSO:

Biotecnologa de los productos Agroindustriales

AUTORES:

Chiln Serrano, Leandro.

ASESOR:

Ing. Jess Alexander. Snchez Gonzales.

GUADALUPE PER

2016

I. INTRODUCCIN
En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero de
microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en
estudio de curvas de crecimiento, anlisis de alimentos, preparaciones de inculos para
fermentacin, etc.
Un parmetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de
agroindustriales dedicadas a procesos de fermentacin, panificacin entre otros en donde se
utilicen inculo es la concentracin de biomasa. Biomasa es un trmino general que se
refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la
concentracin de biomasa, como por ejemplo masa, volumen, extensin linear de
filamentos,

dispersin

de

luz,

conteo

de

clulas

organelas.

Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos o peso

(biomasa) de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e
indirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinacin de peso seco y el
recuento de clulas en cmara de Neubauer.
La determinacin de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy utilizado en cultivos de
gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios
procesos (filtracin, lavado, secado) se pueden causar prdidas importantes de biomasa y
errores en la cuantificacin. El mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de ser
muy rpido y econmico, aunque no se pueden distinguir las clulas viables y no viables.
Se puede calcular el nmero de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la
cmara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el
inconveniente de que la observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas
(1 5 m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen de muestra que
se utiliza (0.1 0.2 mm3).

II. OBJETIVOS
Comprender el uso y lectura por cmara de Neubauer.
Determinar la concentracin de microorganismos utilizando la cmara de Neubauer
en el microscopio.
Determinar la desviacin estndar, promedio y coeficiente de variacin de la
muestra a analizar.
III.

MARCO TEORICO

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes

perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento
mediante diversas metodologas.
Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas
individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a
los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un
aumento en el nmero total de partculas bacterianas (Franson, 1992).
III.1. La Cmara de Neubauer
Es un instrumento utilizado en medicina y biologa para realizar el recuento de clulas en
un medio lquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, lquido cefalorraqudeo,
lquido sinovial, etc. (Ames & Caedo, 2004). Es una cmara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una
depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante
una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una
separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y
marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos
ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro. Si
contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro

reas, la concentracin en la suspensin celular ser: concentracin en la suspensin

(clulas / mL) = 10000 (x/4).
Conteo en cmara de Neubauer, Esta cmara se utiliza para conteo celular.
Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, este debe
quedar centrada.
Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la
distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o
con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser
continuo en un solo intento.
La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del
recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la
apariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones del
recuadro.

Figura 1. Representacin de la cuadricula de la cmara de Neubauer con el ocular de 10x y

40x

IV.

MATERIALES Y METODOLOGIA

MaterialesPipetas
-

Lmina cubreobjetos
Levadura instantnea para panificacin
Agua destilada
Tubo de ensayo.
GradillaEquipos

Microscopio
Cmara de Neubauer.

Metodologa
Se prepararon las soluciones a distintas concentraciones de levadura con agua.
De la solucin se tom 10 ml y se colocaron en un tubo de ensayo el cual se llam
muestra original. Se tomaron 3 tubos de ensayos y se llenaron con agua a 9 ml.
De la muestra original se pipeteo 1 militro y se le adiciono al tubo de ensayo con 9
mililitros de agua, as se realizaron posteriormente para obtener diluciones de 10 -1 ,10-2
y10-3.
Con una pipeta se tom una determinada cantidad de la muestra 10 -2 y se coloc en el
borde del cubreobjetos de manera que el lquido entre por capilaridad sin que se
formen burbujas en la cmara.
Se Llev la cmara al microscopio y con el objetivo 10x se localiz en el campo visual
el cuadrante central, enfocando de tal forma que se observen ntidamente los
cuadrantes y luego se pas al objetivo 40x.
Contar las clulas presentes en los cuadros elegidos (generalmente se cuentan en los
cuadrados de los cuatro ngulos y el centro, o en forma diagonal empezando por el
primero de la parte superior izquierda. Tambin se deben contar las levaduras que estn
ubicadas tocando la primera de las tres lneas que se encuentran circundando el cuadro,
las que se encuentran en la parte superior y la derecha del cuadrado.

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Tabla 1. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras.

SUSPENSIONES DE
LEVADURAS
(g de lavadura/mL de agua)

N
Clulas/mL

Desviaci
Promedi
n
o
Estndar

Coeficiente
de
Variabilidad

12.5 g de levadura / 250 ml H20

1.4x107

6.12

56

10.94%

20 g de levadura / 250 ml H20

3.3x107

19.15

130.4

14.69%

40 g de levadura / 200 ml H20

1.0x107

6.26

40.8

15.35%

25 g de levadura / 250 ml H20

4.9x106

3.78

19.6

19.29%

150 g de levadura / 1000 ml H20

5.3x107

30.38

210.6

14.43%

En la tabla 1. Podemos observar que el coeficiente de variabilidad esta

entre 11% y 19% aproximadamente; esto nos indica el grado de
variabilidad o dispersin que existe entre los datos. Segn Nuez
(1992) si CV es menor o igual que 20% se dice que el promedio es
representativo, o que los datos son homogneos y si el CV es mayor al
20%, el promedio no es representativo de los datos, o los mismos no son
homogneos, es por ello que afirmamos que los datos son homogneos
y el mtodo de recuento en microscopio utilizando la cmara de
Neubauer es adecuado para la determinacin de biomas. En el caso de
la lectura 25 / 250 se ve que el CV es 19, ya prximo a 20; se debi
quizs a las fallas que presento el microscopio con el tema de la luz, que
al final va influenciar en el resultado final.
Segn Muoz, 2007 el conteo en la cmara de Neubauer debe efectuar
en los 25 cuadrantes de la cmara, hasta obtener un nmero de 300
clulas con el fin de tener una confianza del conteo del 90%, y al
observar la tabla 1, en la parte de total vemos que todas las muestras
sobrepasan las 300 clulas.
Segn Hernndez (2002). Es importante determinar al mosto la
concentracin de clulas para que luego se dosifique la cantidad
especfica para alcanzar una concentracin en el rango de (1,5 a 2,0) x
107cel/mL de mosto. Por lo que ciertas cantidades

halladas se han

aproximado al rango pero tambin depender de la relacin de entre la

cantidad de levadura con la cantidad de agua.
Segn Arnaiz, et al (2000), los mtodos clsicos de determinacin de
biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o
en el peso celular. Los mtodos de enumeracin celular, son mtodo de
observacin, basados en propiedades fsicas o en la actividad biolgica.
Mientras que los mtodos indirectos estiman algn componente celular
o alguna actividad metablica especfica, estos no requieren de examen
visual de los organismos ni su incubacin.
Segn Unam (1986), en la tcnica de conteo de clulas hay que tener
en cuenta que en esta tcnica uno de los factores que afecta la
observacin de las clulas de levadura es la correcta dilucin de la
muestra empleada se puede decir que si durante el conteo se observan
aproximadamente 69 clulas la muestra se encuentra muy concentrada,
mientas que si se observan menos de 20 clulas, la muestra se
encuentra muy diluida. En nuestro prctica la muestra nos arrojaron
valores de un total de clulas son mayores a 69, por lo que podemos
decir que probablemente se encuentra muy diluida.
En la prctica se contabilizaron 5 cuadros, aunque segn (Aquiahuati,
2004), Es importante contar en total 10 cuadrados, cinco en cada
cmara, es decir de la cmara de arriba y la de abajo, sin embargo en la
prctica realizada solo se contaron 5 cuadrados por lo que el porcentaje
de error se incrementar.
VI.

CONCLUSIONES

Se comprendi el uso y lectura por cmara de Neubauer.

Se determin la biomasa presente en una solucin de levadura y
expres en unidades de clulas/ml obtenindose un rango de 1.02
y 5.27 x 107Cel/mL con un promedio de entre 19.6 y 210.6 clulas
por cada cuadro de 0,2mm x 0,2mm x 0,1mm y un coeficiente de
variabilidad de entre 11 y 19 %, en las 5 celdas al azar, por lo que
nos damos cuenta que la muestra de 5 celdas al azar es una
muestra representativa de la general. Se pudo determinar las
clulas por mililitro gracias a la cmara Neubauer.

VII.

Se pudo comprender y determinar el promedio de levaduras

contadas en las 5 celdas al azar, por el mtodo de conteo directo,
usando la cmara de Neubauer, que es un mtodo eficaz para el
conteo de dichas levaduras. Por lo que la muestra de las 5 al azar
es representativa.

RECOMENDACIONES

Para realizar un recuento en cmara de Neubauer se recomienda

agitar bien la dilucin con el fin de tener una muestra ms
homognea y al momento de colocar la muestra sobre la cmara
tener

la

precaucin

para

no

derramarla

sobre

la

placa

cubreobjetos de tal manera que el conteo sea el adecuado.

Se recomienda calibrar bien el microscopio, y que est en buen

estado, con la finalidad de poder observar de manera ms clara

las levaduras, de esta forma facilitaremos el conteo de las clulas.

VIII. BIBLIOGRAFIA
ARNIZ, C., ISAC, L. LEBRATO, J. (2000). Determinacin de la biomasa en
procesos biolgicos. Sevilla-Espaa.
Aquiahuati, M. (2004). Manual de prcticas: Laboratorio de microbiologia celular.
Mxico: Universidad Autnoma Metropolitana.
Hernndez, A. (2002). Microbiologa Industrial. Costa Rica: Editorial EUNED.
Muoz, A. (2007). Microbiologa. Madrid: Editorial Paraninfo.
Nuz, A. (1992). Estadstica Basca para planificacin. Madrid: Siglo XXI
Editores.

UNAM, (1986); Biologa Celular, Manual de Prcticas. Departamento de Biologa,

Facultad de Ciencias, Universidad autctona de Mxico. Pg. 20 28