RECOLECCIÓN Y CULTIVO DE MUESTRAS

El éxito de los procedimientos bacteriológicos depende

en gran medida del modo como se obtienen las
muestras y de la rapidez con que las mismas llegan
al laboratorio. Estos procedimientos quedan
inutilizados muchas veces por falta de cuidado y
métodos defectuosos usados en la recolección y el
manejo de las muestras.
REGLAS GENERALES PARA OBTENER UNA MUESTRA
CLÍNICA CON CALIDAD MICROBIOLÓGICA

Deben seguirse estas reglas:

1.- Marcar todas las muestras con el nombre del
paciente, fecha, persona que tomo la muestra.
Nombre y edad del paciente, Número de cuarto o
sala, naturaleza de la muestra y sitio de donde se
obtuvo, diagnóstico clínico y duración de la
enfermedad, y prueba requerida.
2.- Obtener en lo posible
muestras antes de administrar
antibióticos a agentes
antimicrobianos. Si se han
administrado informar de ello
al laboratorio. A menudo un
LCR no revela patógenos
bacterianos en frotis ni cultivo
cuando se ha tomado un
antibiótico en las 24 horas
anteriores.
3.- Como la piel, el tracto intestinal,
las mucosas, etc., tienen flora
bacteriana normal, es necesario
utilizar procedimientos especiales
para distinguir agentes
etiológicos y se recomienda los
siguientes enfoques:
a.- Limpiar el área con desinfectante (70% de
alcohol y 2% de Yodo en caso de
preparación para cultivo de sangre).
b.- Cultivar específicamente para
microorganismos conocidos como agentes
etiológicos (estreptococo grupo A en
infecciones de la garganta).
c.- Evitar áreas de la flora normal (usar aspiración
suprapúbica para muestra de orina cuando se cultiva
para anaerobios o aspiración transtraqueal en lugar de
esputo)
d.- Cuantificar los resultados del cultivo (cultivos
cuantitativos de orina)
Así mismo generalmente
casi todas las muestras
para cultivo bacteriano
representan una de 3
áreas:
1.- áreas corporales
profundas cerradas,
2.- áreas corporales
profundas
comunicantes,
3.- áreas superficiales del
cuerpo.
A.- Las muestras de áreas profundas
normalmente son estériles son las más
satisfactorias (sangre circulante, pleura,
peritoneo, articulaciones, etc.). Se necesita
una cuidadosa preparación de la piel.
B.- Las muestras de áreas profundas que comunican
con la superficie (endocérvix, vejiga, fístulas) pueden
estar contaminadas por flora normal.
C.- Las muestras de áreas superficiales del cuerpo
(piel mucosas son las más inseguras porque estos
sitios están contaminados por la flora normal.
4. Enviar las muestras lo antes posible al laboratorio,
Neisseria meningitidis es muy sensible a los
cambios de temperatura y por ello el LCR debe
entregarse todavía caliente.
5.- Tejido, entregar en frascos de boca ancha de cierre a
rosca o en recipiente de plástico estéril y seco, sin agregar
agua ni solución fisiológica. Despachar sin tardanza. Es
evidente que no debe agregarse formol.
6.- Usar recipientes estériles sin medio de transporte ni
preservativos para la recolección de orina, esputo y LCR.
Colocar una porción apropiada en un frasco en rosca para
su entrega inmediata en laboratorio. Si las heces no
pueden procesarse inmediatamente debe colocarse en un
medio de transporte o en una solución preservativa. El
esputo debe recogerse en un frasco con tapón de rosca
estéril.
7. Para materiales de garganta, nariz, ojos,
oídos, heridas, abscesos y rectos usar
hisopos (dacron)..
8.- Para obtener muestras nasofaríngeas es
recomendable usar hisopos nasofaríngeos
flexibles.
9.- La sangre debe recogerse en frascos estériles que
contienen caldo o, en tubos estériles, pero como la
muestra se coagula rápidamente es preferible usar
tubos con anticoagulante no bactericida.
10.- Demora entre recolección de cultivo, muchos
medios de transporte existen para prolongar la
supervivencia de los microorganismos. Si se
espera una demora apreciable deben
colocarse hisopos en las ampollas con medios
de transporte.
 MUESTRAS INADECUADAS

 Contaminación en el proceso de toma de muestra

 Insuficientes conocimientos del procedimiento a
realizar
 Muestras escasas o pobres,
 Fallas en la preparación del paciente
 Toma de muestra en sitios ajenos al problema,
 MUESTRAS INADECUADAS

 Desconocimiento de información de interés

para la orientación del diagnostico,
 Paciente bajo antibioticoterapia,
 Transporte inadecuado de la muestra, d
 Demoras en el proceso de especímenes
 O simplemente, lo que es
desafortunadamente muy usual, deficiente
comunicación entre el medico y el
laboratorio, lo cual redunda en un problema
adicional para el paciente
TOMA DE MUESTRAS BACTERIOLÓGICAS
VIAS RESPIRATORIAS ALTAS

Los exámenes microbiológicos

del tracto respiratorio alto
deben interpretarse
cautelosamente, debido a la
presencia de microflora
normal, tanto en cavidad oral
como en nariz y faringe;
además por la frecuente
adquisición nosocomial de
microorganismos
potencialmente patógenos.
Las muestras obtenida de las lesiones de la
boca, faringe y nariz, deben procesarse de
acuerdo con una metodología que es
prácticamente general, salvo contadas
excepciones. Con esto se busca identificar
y diferenciar la microflora normal y la
microflora patógena.
Para estos procesos el laboratorio clínico debe
disponer, entre otros, de los siguientes elementos y
materiales, debidamente esterilizados: escobillones
aplicadores, abatelenguas, laminas portaobjetos,
laminillas cubreobjetos, tubos de vidrio, medios
adecuados de transporte, Cajas de Petri, apropiados
medios de cultivo apropiados de enriquecimiento y
diferenciales, incubadora, etc.
 En los estudios de Laboratorio, cualquiera
que sea el caso, siempre se deberá interrogar
al paciente, si esta recibiendo algún tipo de
medicación (Antibióticos, antihistamínicos,
etc.).
 Esta información debe consignarse y tenerse
en cuenta, en caso de incongruencia en los
resultados finales de los estudios de
laboratorio por interferencia con
medicamento.
Todas las muestras recolectadas para estudios
de laboratorio, deben llegar al laboratorio en
donde serán procesadas, en el menor tiempo
posible.Mientras se remiten y se transportan,
deberán mantenerse en refrigeración (4º
Centígrados).
CAVIDAD ORAL Y OROFARINGE

El paciente debe abstenerse de cepillarse los

dientes (Algunos dentífricos y antisépticos
orales son bactericidas).
Visualizar correctamente el área de toma de
muestra. (Utilizar linterna, lámpara, etc.)
Pasar varias veces y vigorosamente el hisopo
sobre áreas en donde existan ulceraciones,
cavitaciones, vesículas, exudados, “placas”
e inflamación.
 CAVIDAD NASAL

Debe recolectarse siempre material de ambas fosas nasales,

por separado, a menos que el médico desee estudiar
específicamente una sola fosa nasal. El médico debe
especificar en la orden médica su deseo.
 OÍDO

Si se trata de secreción (Otorrea), recolectar con

escobillones estériles la muestra. Si existe
perforación de la membrana timpánica, el medico
especializado utilizara catéter para su recolección.
 SENOS PARANASALES Y LARINGE.

Estos procedimientos, debido a los cuidados y

dificultades técnicas de su recolección, están
reservado exclusivamente al medico especialista.
 OJO

Los procesos infecciosos en ojos incluyen en la mayoría de

los casos, conjuntivitis, úlcera de córnea.
Se observa en general escaso número de bacterias
patógenas en los exámenes directos después de su
coloración.
En los cultivos, también son escasos los crecimientos
abundantes de microorganismos, debido a la acción
antibacteriana de las lágrimas y al arrastre que éstas
producen constantemente.
No utilizar agentes locales a la toma de la muestra. Si
ya han sido aplicados, el paciente deberá
suspenderlos durante 24 horas y asistir al
laboratorio para la toma de muestras.
Utilizar escobillones estériles ( Si la muestra es escasa,
utilizar asa bacteriológica estéril ).
En muchos casos (p.ej. úlceras de córnea) el
oftalmólogo se reservará el derecho a tomar la
muestra, valiéndose de procedimientos como
raspado de la córnea mediante bisturí estéril).
 LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO

Debe recolectarse en condiciones de total asépsia.

Se requieren de 5 a 10 mL de líquido cefalorraquídeo,
los cuales deberán colocarse en tubo de vidrio
estéril con tapa.
No se debe refrigerar.
Procesar la muestra inmediatamente.
 SANGRE (HEMOCULTIVOS)

Desinfectar alrededor la zona seleccionada.

Lavar cuidadosamente la región, con agua y
jabón (remover el desinfectante).
Aplicar con gasa o algodón,
una solución de yodo sobre
el área seleccionada en forma
concéntrica del centro hacia
la periferia, y desechar el
algodón o gasa utilizados.
 No se debe tocar la piel con la mano una vez
que el área ha sido desinfectada.
 utilizar guantes desechables y estériles, para
proceder con seguridad.
Mezclar suavemente los recipientes de hemocultivo.
No agitarlos bruscamente y procurar que la
sangre se impregne en todas las superficies de
los medios de cultivo de los frascos.
Proceder con actividades propias del estudio
(Rotulación, incubación, revisión diaria de
cultivos, resiembras, interpretación de
resultados, etc.).
 MUESTRAS VAGINALES

Interrogar a la paciente sobre:

Medicamentos que esté
tomando.
Óvulos o antisépticos vaginales
que se esté aplicando.
Utilización de dispositivo
intrauterino.
Edad.
Fecha de la última
menstruación.
Indicar a la paciente que el día
del examen, no debe hacerse
baño de “ducha vaginal”.
Explicar a la paciente el procedimiento que se
le practicará.
Introducir espéculo vaginal desechable.
 TINCIONES USADAS HABITUALMENTE
EN BACTERIOLOGIA

 COLORACIÓN DE GRAM.
 COLORACIÓN DE ZHIEL NEELSEN, DE KINYOU.
 COLORACIÓN DE NARANJA DE ACRIDINA.
 COLORACIÓN DE GIEMSA.
 COLORACIÓN DE WRIGTH.
 PREPARACIÓN DE TINTA CHINA.
 PREPARACIÓN DE HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH).
PREPARACIÓN DE UN FROTIS (O EXTENSIÓN).

Si se trabaja de un medio
sólido, agregue una gota de
solución fisiológica a la
lámina con el asa
bacteriológica o con un
gotero.

Ponga una asada

bacteriológica de una
colonia bacteriana sólida o
dos asadas  de bacterias en
medio líquido en el centro
de un portaobjetos limpio.
Ahora, mezcle
completamente y
extender la mezcla hasta
cubrir la mitad del área
total de la lámina.

Desecación:
Se logra agitando la
preparación al aire o
por calor suave de una
llama. La preparación
ahora está ahora lista
para la tinción.
1 . Examen en fresco: Consiste en examinar la
muestra, o cultivo, entre porta y cubreobjetos con el
fin de observar movilidad o morfología sin
exponerse a ver deformaciones causadas por la
fijación. 
2. Frotis Teñido: Tiene por objeto apreciar con
exactitud la morfología y disposición del gérmen. 
 TINCIÓN SIMPLE.

Se utiliza solamente un
colorante, y sirve para
determinar la morfología y
agrupación de las bacterias.
MORFOLOGIA BACTERIANA Y TIPOS DE
AGRUPACIÓN
 TINCIÓN DE GRAM

Gram, bacteriológo dinamarqués, descubrió en 1884, que

algunos gérmenes (Gram positivos) contienen ciertos
elementos químicos en gran cantidad , peptidoglicano, en su
membrana dispuestos estructuralmente en forma muy
diferente a la de  otros (Gram negativos) y forman con los
colorantes derivados de la rosanilina (violeta de genciana,
cristal violeta) más el yodo, un compuesto que resiste la
acción de decolorantes (alcohol absoluto, alcohol acetona). 
En consecuencia aplicando éste método de coloración diferencial
los gérmenes que contienen esos elementos químicos quedan
coloreados violeta y se denominan Gram positivos, aquellos
que  los contienen en pequeña cantidad se decoloran y para
observarlos es necesario teñirlos nuevamente, para este fin se
utilizan colorantes como la fucsina y la safranina y se
denominan Gram negativos.
Las células teñidas de morado,
se denominan Gram Positivos.

Las células teñidas de rojo, se

denominan Gram Negativos.
 TINCIÓN DE ZHIEL NEELSEN.

La tinción de Ziehl-Neelsen
demuestra la capacidad que
tienen algunas bacterias
teñidas de resistir a la
decoloración por ácidos y
alcoholes.
TINCIÓN DE ZHIEL NEELSEN
 PREPARACIÓN DE TINTA CHINA.
(TINCIÓN NEGATIVA DE CÁPSULAS.)

Las cápsulas, por sus características químicas,

no se tiñen normalmente con colorantes
básicos como el cristal violeta o la safranina.
Sin embargo, se pueden observar directamente
mediante la tinción negativa con tinta china.
Este colorante está compuesto de partículas finas
de carbón suspendidas en agua formando un
auténtico coloide.
Las partículas son demasiado grandes para
penetrar a través de la matriz de la cápsula, por
lo que sólo se teñirá el medio circundante.
Para distinguir bien la cápsula del resto de la célula se
debe aumentar el contraste cerrando el diafragma
del condensador. La cápsula se verá como un halo
transparente alrededor de célula de color grisáceo
con el medio circundante de color negro.

Cryptococcus neoformans
TINCIÓN NEGATIVA DE CÁPSULAS.
 TINCIÓN DE ESPORAS.

Las endosporas poseen unas

cubiertas exclusivas que las
hacen resistentes a los
factores ambientales adversos.
Además estás cubiertas hacen
que las esporas aparezcan en
el microscopio óptico como
estructuras refringentes y de
difícil tinción .
TINCIÓN DE ESPORAS

Verde de Malaquita
y
Safranina