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TTULO:

GUA PARA LA VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS

RESUMEN: Este documento describe las actividades para la validacin de Mtodos de Ensayo
Microbiolgicos que soliciten su acreditacin ante el Organismo Argentino de Acreditacin.
Este documento reemplaza al documento complementario DC-LE-08 versin 1

Este documento se distribuye como copia no controlada. Debe confirmarse su vigencia antes de hacer
uso de esta versin, por si ha sido modificada.

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1. OBJETIVO .......................................................................................................... 3
2. ALCANCE ........................................................................................................... 3
3. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA .............................................................. 3
4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES ................................................................. 4
5. RESPONSABILIDADES ..................................................................................... 8
6. DESCRIPCIN ................................................................................................... 8
6.1. Requisitos generales para las actividades de validacin y para la estimacin de
la incertidumbre de medicin..................................................................................... 8
6.2. Validacin de los mtodos................................................................................ 10
6.3. Estimacin de la incertidumbre de medicin .................................................... 14
6.4. Expresin de la Incertidumbre de medicin en los informes de ensayo ........... 16
7. DOCUMENTACIN RELACIONADA ............................................................... 16
8. Anexo I - Parmetros de validacin y expresiones para su clculo .................. 17

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1. OBJETIVO
Establecer una gua, de aplicacin no obligatoria, para la validacin de mtodos de ensayo
no normalizados, desarrollados o diseados por el Laboratorio, mtodos normalizados
empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los mtodos
normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar
correctamente los mtodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos. Establecer
los principios y los requisitos para la evaluacin de la incertidumbre de medida en los
ensayos y para la expresin de dicha incertidumbre. Esta gua est dirigida a Laboratorios
que realizan ensayos microbiolgicos utilizados en el anlisis de agua y de alimentos
destinados al consumo humano y la alimentacin animal, a muestras ambientales en el
mbito de la produccin y manipulacin de alimentos y, en productos farmacuticos o
cosmticos.

2. ALCANCE
Esta gua la pueden aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA, los
laboratorios que solicitan su acreditacin, y los evaluadores y expertos tcnicos que actan
en los procesos de acreditacin.

3. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA
3.1. Norma IRAM 301 vigente (ISO/IEC 17025: vigente), Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo / calibracin.
3.2. Norma ISO 9000 vigente. Sistemas de Gestin de la Calidad - Fundamentos y
vocabulario.
3.3. Norma ISO 16140: 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs Protocol for
the validation of alternative methods.
3.4. Norma ISO/TR 13843 vigente. Water quality - Guidance on validation of microbiological
methods.
3.5. Norma ISO/TS 19036:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs
Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations.
ISO/TS 19036:2006/Amd 1:2009. Measurement uncertainty for low counts.
3.6. Norma ISO 17994 vigente. Water quality -- Criteria for establishing equivalence
between microbiological methods.
3.7. Norma ISO 5725-2 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results -- Part 2: Basic method for the determination of repeatability and
reproducibility of a standard measurement method.
3.8. Norma ISO 5725-3 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results -- Part 3: Intermediate measures of the precision of a standard
measurement method
3.9. Norma ISO 8199 vigente. Water quality -- General guidance on the enumeration of
micro-organisms by culture.
3.10. Norma ISO 11133-2 vigente. Microbiology of food and animal feeding stuffs -Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical guidelines on
performance testing of culture media

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3.11. AOAC INTERNATIONAL Methods Committee Guidelines for validation of qualitative

and quantitative food microbiological official methods of analysis. Journal of AOAC Int. Vol.
85, No 5, 2002
3.12. AOAC INTERNATIONAL Presidential Task Force on Best
Microbiological Methodology. BPMM Task Force Final Report 8-7-06.

Practices

for

3.13. EA Guide EA-04/10: 2002. Accreditation for Laboratories Performing Microbiological

Testing.
3.14. Environment Agency. Standing Committee of Analysts. Methods for the Examination
of Waters and Associated Materials. The Microbiology of Drinking Water (2002) - Part 3 Practices and procedures for laboratories
3.15. Oficina Internacional de Pesos y Medidas (BIPM). Vocabulario Internacional de
Metrologa - Conceptos fundamentales y generales, y trminos asociados (VIM). JCGM
200:2008. JCGM 200:2008 Corrigendum. May 2010.
3.16. NMKL/NordVal. Protocol for the validation of alternative microbiological methods.2009
3.17. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA) vigente.
3.18. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington:
1998.

4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES

4.1. ABREVIATURAS
- AOAC: Association of Analytical Communities.
- EA: European co-operation for Accreditation.
- ISO: International Standardization Organization

- IRAM: Instituto Argentino de Normalizacin.

- NMKL: Nordic Committee on Food Analysis
4.2. DEFINICIONES
Analito: componente medido por el mtodo de anlisis. En el caso de mtodos
microbiolgicos esto es el microorganismo sus componentes o productos asociados
(enzimas o toxinas) (3.11)
Especificidad: (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): Fraccin del
nmero total de cultivos o colonias negativos que son asignados correctamente con el
mtodo utilizado (3.4).
Nota: Tambin puede definirse como la capacidad de un mtodo de no detectar el
microorganismo diana, si este no est presente.
Exactitud de medida: proximidad entre un valor medido y un valor verdadero de un
mensurando (3.15).
Nota: Es la combinacin de la precisin y la veracidad. La exactitud en los ensayos
microbiolgicos, pueden determinarse mediante los resultados obtenidos en los
interlaboratorios (que dan una idea de precisin) y mediante el anlisis de un material de
referencia certificado (que da una indicacin de la veracidad).

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Exactitud relativa: Grado de concordancia entre los resultados del mtodo evaluado y los
obtenidos utilizando un mtodo de referencia reconocido (3.3).
Nota: En lo posible deben utilizarse muestras idnticas. Sin embargo, cuando se utilizan
diferentes pre-enriquecimientos, se hace necesario la duplicacin de las muestras.
Factor de cobertura (k): factor numrico utilizado como multiplicador de la incertidumbre
de medida para obtener una incertidumbre expandida de medicin. (3.5).
Nota: Tpicamente su valor se encuentra entre 2 y 3
Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que
caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al
mensurando (3.5).
Nota: El parmetro puede ser, por ejemplo, una desviacin estndar (o un mltiplo de ella),
o la mitad de un intervalo de un nivel de confianza determinado.
Incertidumbre combinada, uc (y): incertidumbre estndar de un resultado, y, de una
medicin cuando ese resultado es obtenido a partir de valores de otras cantidades, que es
igual a la raz cuadrada positiva de la suma de los trminos, siendo estos trminos, las
varianzas o covarianzas de esas cantidades divididas por los resultados de esas
mediciones (3.5).
Incertidumbre estndar, u (xi): incertidumbre del resultado xi de una medicin expresada
como una desviacin estndar (3.5).
Incertidumbre expandida (U): cantidad que define a un intervalo en torno al resultado de
una medicin que puede esperarse que incluya una fraccin grande de la distribucin de
los valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando (3.5).
Inclusividad/ Exclusividad: inclusividad es la capacidad de un mtodo alternativo de
detectar el microorganismo diana a partir de un amplio rango de cepas. Exclusividad es la
falta de interferencia, en un mtodo alternativo, a partir de un rango amplio de cepas nodiana (3.3).
Nota: La exclusividad expresa la capacidad del mtodo de no detectar a los
microorganismos no - diana, es decir aquellos que pueden presentar reacciones cruzadas
con el microorganismo diana. La inclusividad es el rango de cepas que refleja la diversidad
gentica y / o serolgica del microorganismo diana que el mtodo puede detectar.
La inclusividad y la exclusividad se determinan sobre un amplio rango de cultivos puros de
cepas diana y no - diana, mientras que la sensibilidad/especificidad se determinan en
matrices contaminadas. La inclusividad/exclusividad da una medida de la selectividad del
mtodo.
Este requisito no es aplicable al recuento total de microorganismos viables, recuento de
hongos y levaduras o mtodos de enumeracin que no estn dirigidos contra
microorganismos especficos.
Lmite de deteccin: aplicado a ensayos microbiolgicos cualitativos, es el nmero
mnimo de microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no
pueden estimarse con precisin (3.13).
Lmite de cuantificacin: aplicado a ensayos microbiolgicos cuantitativos, es el nmero
mnimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse
en las condiciones experimentales del mtodo evaluado (3.13).

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Nota: Tambin se lo denomina lmite de determinacin. Representa el nivel ms bajo

validado con una precisin satisfactoria.
Mensurando: magnitud que se desea medir (3.15).
Nota: En microbiologa el mensurando es definido en trminos del mtodo empleado.
Puede expresarse, por ejemplo, como ufc por la unidad de cantidad de muestra (ufc/ml
ufc/g). Ejemplo: en la determinacin cuantitativa de Listeria en leche, el mensurando puede
ser el resultado obtenido a partir del recuento de colonias, luego que se han seguido todos
los pasos especificados en el mtodo de ensayo.
Mtodo cualitativo: mtodo de anlisis cuya respuesta es la presencia o ausencia del
analito, detectado de forma directa o indirecta en una cierta cantidad de muestra. (3.3).
Mtodo cuantitativo: mtodo de anlisis cuya respuesta es la cantidad del analito medido
de forma directa (enumeracin en masa o volumen), o indirecta (color, absorbancia,
impedancia, etc.) en una cierta cantidad de muestra (3.3).
Mtodo de referencia: mtodo internacionalmente reconocido y ampliamente aceptado
(3.3).
Nota: (por ejemplo, NMKL, ISO, CEN, mtodos de AOAC Internacional, mtodos que se
indican en la Unin Europea, en las legislaciones nacionales y ciertas normas nacionales
de calidad equivalente).
Mtodo alternativo: mtodo de anlisis que demuestra o estima, para una dada categora
de productos, el mismo analito que se mide utilizando el correspondiente mtodo de
referencia (3.3).
Precisin de medida: proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos
en mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares, bajo condiciones
especificadas. (3.15).
Nota: Es habitual que la precisin de una medida se exprese numricamente mediante
medidas de dispersin tales como la desviacin tpica, la varianza o el coeficiente de
variacin bajo las condiciones especificadas. Las condiciones especificadas pueden ser
condiciones de repetibilidad, condiciones de precisin intermedia, o condiciones de
reproducibilidad
Precisin intermedia: precisin de medida bajo un conjunto de condiciones de precisin
intermedia. (3.15).
Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medicin, el mismo
lugar y mediciones repetidas del mismo objeto u objetos similares durante un periodo
amplio de tiempo, pero que puede incluir otras condiciones que involucren variaciones.
Las variaciones pueden comprender nuevas calibraciones, patrones, operadores y
sistemas de medida. En la prctica, conviene que toda especificacin relativa a las
condiciones incluya las condiciones que involucren variaciones y las que no.
Rango de validacin: rango de nmero medio de partculas por porcin analtica para el
cual las expectativas de las especificaciones de validacin (en particular linealidad)han
sido aceptablemente demostradas.
Nota: por lo general se expresa como el rango de recuento de colonias confiable (3.4).
Repetibilidad: precisin de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad.
(3.15).

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Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medida, los mismos
operadores, el mismo sistema de medida, las mismas condiciones de operacin y el mismo
lugar, as como mediciones repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodo
corto de tiempo.
Reproducibilidad: precisin
reproducibilidad (3.15).

de

medida

bajo

un

conjunto

de

condiciones

de

Nota: Este conjunto de condiciones incluye diferentes lugares, operadores, sistemas de

medida y mediciones repetidas de los mismos objetos u objetos similares. Los diferentes
sistemas de medicin pueden utilizar diferentes procedimientos de medida. En la prctica,
conviene que toda especificacin relativa a las condiciones incluya las condiciones que
varan y las que no.
Robustez: capacidad de un mtodo para mantenerse sin cambios ante pequeas pero
deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo, que provee una indicacin de su
confiabilidad durante el uso normal (3.18).
Nota; las variaciones a las que hace referencia la definicin son por ejemplo, cambios en
las condiciones ambientales, en las condiciones de incubacin (tiempo/temperatura),
calidad y vida til de medios de cultivo y reactivos, pH, etc. La informacin de la prueba de
robustez puede utilizarse para especificar las condiciones en que debe ser aplicado el
mtodo
Sensibilidad (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): Fraccin del nmero
total de cultivos o colonias positivos que son correctamente asignados con el mtodo
utilizado (3.4).
Tambin puede definirse como la capacidad de un mtodo de detectar el microorganismo
diana, cuando este est presente.
Tasa de Falsos Positivos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): es la
probabilidad o frecuencia con que la muestra sea asignada como positiva cuando en
realidad es negativa. Falsos Positivos son aquellos que han sido asignados como tales
conociendo que en realidad son negativos. La incidencia de falsos positivos es igual a: 1
menos la especificidad (3.11).
Tasa de Falsos Negativos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): es la
probabilidad o frecuencia con que una muestra conocida como positiva, sea asignada
como negativa por el mtodo. La incidencia de falsos negativos es igual a 1 menos la
sensibilidad (3.11).
Validacin: Confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista (3.2).
Verificacin: Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos especificados. (3.2).
Veracidad: proximidad entre la media de un nmero infinito de valores medidos repetidos
y un valor de referencia (3.15).
Nota: El verdadero valor de una cantidad es un concepto terico y, en general, no puede
ser conocido exactamente. En la prctica el valor de referencia aceptado puede sustituir al
valor verdadero. La veracidad se expresa habitualmente en trminos de sesgo o bias. Es
aceptado, en los ensayos microbiolgicos cuantitativos, que no se tenga en cuenta al
sesgo, en la estimacin de la incertidumbre de medicin debido a la naturaleza emprica de

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los mtodos microbiolgicos. Es el procedimiento analtico el que determina directamente

el resultado de la medicin, por ejemplo, el nmero de unidades formadoras de colonias
por unidad de muestra. Por lo tanto, no es posible en la prctica determinar el valor
verdadero que se requiere para determinar el sesgo. Incluso cuando se utilicen materiales
de referencia certificados, o los valores derivados de los Ensayos de Aptitud, slo puede
evaluarse una parte del sesgo. En cualquier caso, an cuando no se evale el componente
de la incertidumbre debida al sesgo, el laboratorio puede demostrar que se encuentra bajo
control, por ejemplo, mediante su participacin en ensayos de aptitud o mediante el ensayo
de materiales de referencia certificados.

5. RESPONSABILIDADES
Se encuentran descriptas en el documento DC-SG-07, Responsabilidades y en el
punto 6 de este documento.
6. DESCRIPCIN
Un Laboratorio que realiza ensayos microbiolgicos puede utilizar mtodos cualitativos y/o
cuantitativos, los cuales se basan en la capacidad natural de los microorganismos de
desarrollarse en un determinado medio de cultivo, a fin de detectarlos y/o poder
cuantificarlos.
El laboratorio debe utilizar mtodos de ensayo, que satisfagan las necesidades del cliente
y que sean apropiados para los ensayos que realiza, es decir ajustados a su propsito.
Para ello puede utilizar:

mtodos normalizados: son aquellos mtodos publicados como normas

internacionales o nacionales, o por organizaciones tcnicas reconocidas (Ej.: ISO, NMKL,
UNE, EN, AOAC, APHA, FDA, EPA, Standard Methods for Water and Wastewater, USP,
EP, etc.)

mtodos alternativos: se trata de mtodos que han sido validados por comparacin
con el mtodo de referencia que corresponda, de acuerdo a un estndar aceptado (ej.
ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994) y son reconocidos formalmente como
equivalentes al mtodo de referencia por un organismo competente de acuerdo a unos
datos experimentales obtenidos por ej. mediante ensayos colaborativos.

mtodos no normalizados: pueden considerarse aquellos mtodos normalizados

modificados o utilizados fuera de su alcance. Por ejemplo: otra matriz, otros medios de
cultivo, diferentes tiempos/temperaturas de incubacin, equipos con distintas tolerancias a
las especificadas, combinacin de partes del mtodo normalizado con partes de una
referencia bibliogrfica, etc.

mtodos internos: son aquellos elaborados por el propio laboratorio y que no se

encuentran en normas o u otras colecciones de mtodos.

6.1. Requisitos generales para las actividades de validacin y para la

estimacin de la incertidumbre de medicin
a) La validacin de los mtodos de ensayo y la estimacin de la incertidumbre de
medicin, debe ser realizada por miembros del personal experimentados, competentes y,
por lo tanto, autorizados. El laboratorio debe operar bajo un sistema de aseguramiento de
la calidad de sus ensayos. Los equipos e instrumentos deben ser calibrados y/ o validados

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antes de su uso, los medios de cultivo evaluados y controlados, etc. Ver lo dispuesto en el
documento CE-LE-06 Criterios especficos para la evaluacin y acreditacin de laboratorio
que llevan a cabo ensayos microbiolgicos.
b) Para la validacin/verificacin de los mtodos, el nmero y categora de matrices a
analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditacin y debe basarse en
referencias bibliogrficas o estndares reconocidos, por ejemplo el anexo B de la norma
ISO 16140 o el anexo B del documento Final Report and Executive Summaries from the
AOAC International Presidential Task Force on Best Practices in Microbiological
Methodology.
c) Para la estimacin de la incertidumbre, debe tenerse en cuenta: el tipo de matriz (o
grupo consistente de matrices), el microorganismo (o grupo consistente de
microorganismos, por ejemplo, coliformes) y el mtodo empleado. El nmero y categora
de matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditacin y debe
basarse en referencias bibliogrficas o estndares reconocidos, por ejemplo la norma
ISO/TS 19036.
d) Las actividades de validacin y las de estimacin de incertidumbre de medicin deben
reflejar las condiciones reales de la aplicacin de los mtodos de ensayo, es decir, deben
tener en cuenta las condiciones encontradas en la prctica diaria. Por ello pueden
utilizarse: de preferencia muestras naturalmente contaminadas, contaminadas por mezcla,
o en su defecto muestras inoculadas o materiales de referencia. El Anexo C de la norma
ISO 16140 sirve como referencia para alimentos. Una gua para la preparacin de
muestras de agua, se encuentra en la referencia 3.14 de este documento. Cuando se
utilice la inoculacin, debe tenerse en cuenta que segn la naturaleza del mtodo y de la
matriz, se hace necesario considerar la presencia de la flora acompaante a fin de evaluar
posibles interferencias. Para ello se pueden utilizar matrices estriles inoculadas, con el
microorganismo diana y con cepas distintas a la diana en concentraciones superiores.
Tambin pueden utilizarse muestras no esterilizadas inoculadas, que hayan demostrado
previamente la ausencia del microorganismo diana. Para la seleccin de los
microorganismos a utilizar puede servir como referencia lo indicado en el Anexo G de la
norma ISO 16140 o en la norma ISO 11133-2. El nivel del inculo debe ser acorde a lo
analizado por el laboratorio en la prctica diaria y lo especificado por el mtodo de ensayo,
por ejemplo el anlisis de muestras de alimentos con alta carga y baja carga en la
determinacin de Salmonella. Tambin debe tenerse en cuenta el estado fisiolgico del/los
microorganismo (s) de acuerdo a las matrices analizadas.
e) Tanto en la validacin como en el clculo de la incertidumbre de medicin se debe
tener en cuenta el rango de trabajo que emplee el Laboratorio en sus anlisis de rutina.
f) Para los modelos descriptos en 6.3.2.1 y 6.3.2.2, la incertidumbre debe recalcularse
cuando se produzcan cambios significativos en las condiciones: por ejemplo, cambio en los
equipos, en los analistas, en los medios de cultivo, etc. Si se necesita estimar la
incertidumbre para un cliente o para la interpretacin de un resultado en contra de una
especificacin, y el clculo no se ha actualizado en los ltimos 6 meses, es recomendable
que se lo revise.
g) Se debe designar a un Responsable que tenga las calificaciones y la competencia
necesarias, para evaluar el diseo experimental y los resultados obtenidos, tanto en la
validacin de los mtodos como en la estimacin de la incertidumbre de medicin. ste

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decidir adems las acciones a seguir en caso que no se obtengan los resultados
esperados.
h) La participacin en Ensayos de Aptitud (EA), no puede ser utilizada como nico mtodo
para la validacin ni para la estimacin de la incertidumbre de medicin, debido a las
siguientes limitaciones:
en las rondas de EA, las matrices, en muchos casos, son diferentes a las que analiza el

Laboratorio en su rutina diaria y no tienen en cuenta la presencia de flora acompaante;

las muestras distribuidas durante la ronda, han sido especialmente homogeneizadas y

estabilizadas;
los niveles de microorganismos en las muestras del EA, pueden no ser aquellos que el

laboratorio analiza rutinariamente y pueden no cubrir el rango encontrado en el trabajo

diario;
los laboratorios participantes, utilizan una variedad de mtodos empricos para obtener

su resultado, por lo cual para evaluar el resultado de la ronda se utilizan valores de

consenso.
Sin embargo la participacin en EA, puede utilizarse como actividades complementarias a
la validacin y pueden dar una indicacin de la precisin obtenida para un mtodo en
particular.
La participacin en EA puede utilizarse en la estimacin de la incertidumbre de medicin
bajo las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente.

6.2. Validacin de los mtodos

El trmino validacin se utiliza para indicar el proceso que provee evidencia objetiva que
el mtodo es capaz de servir a su uso esperado, es decir para detectar o cuantificar un
microorganismo o grupo de microorganismos especficos, para lo cual deben determinarse
sus caractersticas de desempeo a fin de comprobar que cumple con los requisitos
especificados para ese uso particular.
El trmino verificacin se utiliza, en el contexto de este documento, para indicar el
proceso que lleva a cabo el laboratorio con el fin de demostrar su capacidad para ejecutar
correctamente un mtodo normalizado cuando lo realiza exactamente como est descripto
en la norma.
En adelante se mencionar el trmino validacin pero lo expuesto aplica igualmente a la
verificacin de los mtodos de ensayo.
6.2.1. Etapas en el proceso de validacin
El proceso de validacin de un mtodo debe estar cuidadosamente planificado, por ello
deben contemplarse los siguientes pasos:
a) Conocer el problema analtico a resolver. Los procedimientos y el alcance de la
validacin no son siempre los mismos. Deben ser establecidos de acuerdo a las
caractersticas del mtodo de ensayo utilizado por el Laboratorio y tener en cuenta las
necesidades del cliente.
b) Planificar las acciones a seguir. Esto implica especificar los requisitos y condiciones
a cumplir, determinar los parmetros de desempeo del mtodo, establecer el diseo

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experimental y el mtodo de anlisis de resultados. El diseo experimental y el anlisis de

resultado tienen que ser estadsticamente vlidos. En esta etapa es fundamental definir el
alcance de la validacin de acuerdo al mtodo a emplear, especificar la matriz o matrices
a estudiar; establecer condiciones tales como temperatura y tiempo de incubacin, lmites
de operacin; realizar una clara descripcin del/los microorganismos de inters; y
establecer otras limitaciones y especificaciones. Si los parmetros de desempeo no
estn ya especificados, el laboratorio debe decidir cules deben ser caracterizados con el
fin de validar el mtodo, lo cual deber estar fundamentado de manera confiable y
cientfica.
En todos los casos se requiere un Protocolo de validacin (ver 6.2.3.1).
c) Llevar a cabo la validacin y evaluar los resultados obtenidos, por comparacin
con los parmetros de desempeo establecidos. Confirmar la validez del procedimiento
utilizado de acuerdo al propsito establecido y, si se han satisfecho los requisitos.
d) Realizar el Informe de validacin (ver 6.2.3.2).
6.2.2. Alcance de la Validacin/verificacin de los mtodos
El alcance depender del tipo de mtodo utilizado. Se pueden presentar los siguientes
casos.
6.2.2.1 Mtodos normalizados: el Laboratorio utiliza un mtodo normalizado que se aplica
exactamente como est descripto en la norma. En este caso el laboratorio debe confirmar
que puede aplicarlo correctamente previo a su uso en ensayos, mediante la comprobacin
del cumplimiento de los parmetros estadsticos que figuran en el mtodo normalizado
(siempre y cuando se indiquen en la norma).
Los parmetros a determinar son:
Ensayos cualitativos
Ensayos cuantitativos
Lmite de deteccin
Precisin (Repetibilidad + Precisin
Verificacin de la sensibilidad y la intermedia)
especificidad
Lmite de cuantificacin (a)
Verificacin de la veracidad
(a)

El lmite de cuantificacin debe ser determinado en los casos que afecte o est cercano
al lmite especificado en la norma correspondiente.
Debe tenerse en cuenta que cualquier variacin en el mtodo normalizado implica la
repeticin de dicha confirmacin.
6.2.2.2 Mtodos modificados: el Laboratorio realiza modificaciones al mtodo de ensayo
normalizado que pueden tener una repercusin sobre la calidad de los resultados. En el
caso de los mtodos microbiolgicos se consideran modificaciones relevantes, entre otras:
incluir en el alcance del mtodo otra matriz que la especificada en el mtodo
normalizado;
la utilizacin de medios de cultivos diferentes a los descritos en el mtodo de
referencia;

cambios en las condiciones de incubacin (tiempo-temperatura);

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el uso de equipos crticos con distinta tolerancia a la especificada en el mtodo

normalizado, por ejemplo estufas de incubacin, baos termostticos utilizados para la
incubacin de caldos de pre - enriquecimiento o de enriquecimiento, etc.;

utilizacin de un rango de recuento diferente al especificado en el mtodo normalizado;

utilizacin de un mtodo de recuento de colonias o un mtodo de clculo y expresin

de los resultados diferente al especificado en el mtodo normalizado;

utilizacin de una porcin de ensayo o suspensin inicial diferente;

utilizacin de una sola placa de Petri para el recuento cuando el mtodo normalizado
indica dos;
combinacin de partes del mtodo normalizado con partes de una referencia
bibliogrfica;
En estos casos se debe tener en cuenta que los parmetros a determinar dependern de
las modificaciones introducidas y la naturaleza del mtodo, prestando particular atencin a
aquellas caractersticas de desempeo que puedan haber sido afectadas por el cambio
introducido.
6.2.2.3 Mtodos alternativos: el Laboratorio utiliza mtodos alternativos o mtodos
rpidos de confirmacin. En estos casos, cuando se dispone de los datos de validacin, el
Laboratorio debe realizar una verificacin de su aplicabilidad, siguiendo los lineamientos
establecidos en 6.2.2.1. Los datos de validacin pueden obtenerse de ensayos
colaborativos o de datos provistos por el fabricante y sometidos a la evaluacin de una
tercera parte (por ejemplo, AOAC, AFNOR, NMKL). Cuando no se disponga de esta
informacin (datos de validacin), o estos no son plenamente aplicables, el Laboratorio
debe realizar la validacin, antes de utilizar el mtodo en el laboratorio, siguiendo los
lineamientos establecidos en la Norma ISO 16140 o los protocolos de AOAC, NordVal.
6.2.2.4 Mtodos internos: para estos mtodos, la validacin es mucho ms exigente y
deben ser adecuada y totalmente validados antes de su uso, ya que al no disponerse de
informacin previa sobre el desempeo del mtodo, se debern evaluar, segn sus
caractersticas, todos los parmetros de desempeo posibles, para satisfacer las
necesidades del tipo de aplicacin. Se pueden utilizar como guas, segn las matrices, por
ejemplo: la Norma ISO 16140, la Norma ISO/TR 13843, o los protocolos de AOAC,
NordVal. El diseo experimental y el anlisis de los resultados tienen que ser
estadsticamente vlidos.
Los parmetros a determinar son:
Ensayos cualitativos
Ensayos cuantitativos
Recuento de microorganismos Recuento de microorganismos
Lmite de
totales (a)
en medio selectivo/diferencial
deteccin
Adems de los especificados
Precisin (Repetibilidad +
Sensibilidad
en (a):
Precisin
intermedia)
Especificidad
(b)
Sensibilidad
Lmite de cuantificacin
Inclusividad/
Especificidad
Rango validado
Exclusividad
Inclusividad

Incertidumbre
de
medicin
Robustez
Exclusividad
Robustez
(b)

El lmite de cuantificacin debe ser determinado en los casos que afecte o est cercano
al lmite especificado en la norma correspondiente.

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6.2.3. Protocolo e Informe de validacin

6.2.3.1 Protocolo de validacin. Con el fin de organizar y planificar las actividades de la
validacin se debe elaborar un protocolo de validacin que incluya:

Objetivo

Alcance: mbito de aplicacin del ensayo a validar. Aqu tiene suma importancia la
especificacin de la matriz, especialmente cuando pueden causar diferencias significativas
en la recuperacin de los microorganismos y el rango de aplicacin en el caso de los
ensayos cuantitativos.

Personal que llevar a cabo la validacin

Metodologa y diseo experimental. Este debe incluir: la definicin del analito, la

naturaleza de las muestras (naturales o inoculadas) utilizadas para la validacin, el
acondicionamiento y preparacin de las mismas, los microorganismos utilizados, la
estandarizacin del inculo, las condiciones del ensayo, etc.
Listado de equipos, instrumentos, materiales, medios de cultivo, reactivos y cepas de
referencia.

Condiciones ambientales, cuando corresponda.

Parmetros de desempeo a determinar.

Criterios de aceptacin para cada uno de los parmetros.

Anlisis estadstico

Metodologa para el clculo de la incertidumbre, cuando corresponda.

Registros asociados

El Protocolo de validacin debe ser revisado y aprobado por el Responsable.

6.2.3.2 Informe de validacin. Debe reflejar el protocolo de validacin e incluir, adems
de lo especificado en 6.2.3.1
Resultados obtenidos, incluyendo la incertidumbre de medicin, cuando corresponda a
un mtodo de ensayo cuantitativo.
Conclusiones y declaracin de conformidad sobre la aptitud del mtodo de ensayo,
fundamentada en la evaluacin de los parmetros de desempeo respecto a los criterios
establecidos.

Criterios de revalidacin

El Responsable debe justificar y fundamentar apropiadamente si considera al mtodo

adecuado, an cuando se hayan producido desviaciones del protocolo o, cuando uno de
los puntos del informe no concuerde con el requisito establecido previamente, por ejemplo
los criterios de aceptacin.
Se deben adjuntar al informe de validacin los datos originales o hacer referencia en donde
estos se encuentren.
El Informe de validacin debe ser revisado y aprobado por el Responsable.

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6.3. Estimacin de la incertidumbre de medicin

Para todos los mtodos, ya sean cualitativos o cuantitativos, el Laboratorio debe:
a) identificar las distintas fuentes de incertidumbre, como por ejemplo, la homogeneidad
de los reactivos, la interpretacin de los analistas, etc. y demostrar que se encuentran bajo
control.
Esto puede realizarse de muchas maneras, tales como diagramas de flujo, tablas, listas o
diagramas de causa-efecto (espina de pescado).
6.3.1. Mtodos de ensayo microbiolgicos cualitativos: El concepto de clculo de
incertidumbre de medicin no puede aplicarse directamente a los resultados de los
ensayos cualitativos como los obtenidos en los anlisis de deteccin o en los de
determinacin de atributos para fines de identificacin. No obstante, el Laboratorio debe,
adems de lo especificado en 6.3 a):
a) determinar el lmite de deteccin, basado en requisitos de especificidad y sensibilidad y
realizado en matrices representativas, teniendo en cuenta, cuando corresponda la
presencia de la flora acompaante, ya que es un importante indicador de la validez del
mtodo en el laboratorio.
b) determinar la incidencia de resultados falsos positivos y falsos negativos asociada a los
ensayos cualitativos que se realizan (Tasa de Falsos Positivos y Tasa de Falsos
Negativos). Esta no debe exceder las recomendaciones publicadas, ya sea en la literatura
(normas o publicaciones relevantes al sector) o por los fabricantes, en este ltimo caso
para los mtodos alternativos o de confirmacin rpida.
6.3.2. Mtodos de ensayo microbiolgicos cuantitativos: el Laboratorio debe, adems
de lo especificado en 6.3 a):
a) realizar un clculo para estimar la incertidumbre asociada a sus ensayos cuantitativos.
Existen diferentes modelos para estimar la incertidumbre para ensayos cuantitativos, el
laboratorio puede utilizar aquel que, basado en un pensamiento crtico y en el mejor juicio
profesional, estime conveniente. La estimacin de la incertidumbre de medicin debe
realizarse para resultados vlidos, es decir aquellos que se encuentran dentro de los
lmites de recuento especificados en el mtodo.
Dado el carcter de los ensayos microbiolgicos, mtodos empricos1, donde es difcil
construir un modelo apropiado que permita cuantificar las contribuciones de cada paso a la
incertidumbre del proceso de medida y, la poca disponibilidad de materiales de referencia
certificados que representen al microorganismo en su hbitat natural, el consenso actual
sobre la estimacin de la incertidumbre en los ensayos microbiolgicos cuantitativos es
1

Mtodo emprico: es un mtodo que determina un valor al que slo se puede llegar en trminos del
mtodo en cuestin y que, por definicin, sirve como el nico mtodo para establecer el valor
aceptado del parmetro medido (AOAC). Un mtodo de ensayo diferente (a menudo para el mismo
analito) puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se define en los trminos del
mtodo. Por esta razn, en los mtodos microbiolgicos cuantitativos, el sesgo o bias no
contribuye a la incertidumbre del mtodo, dado que los resultados dependen de las condiciones
definidas en el mtodo, tales como, la temperatura y tiempo de incubacin, los medios de cultivo,
etc. Es por ello que la utilizacin de materiales de referencia certificados, cuyo valor se obtiene
tambin de mtodos empricos, constituye una herramienta til para demostrar la competencia del
laboratorio, pero no deben ser utilizados para cuantificar el sesgo.

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que la precisin es el componente ms importante y el nico que puede determinarse de

una manera prctica, mediante la utilizacin de datos experimentales.
Por ello el Laboratorio puede utilizar los siguientes modelos:
6.3.2.1 Precisin intermedia, tal como se describe en la norma ISO 5725-3 incorpora la
mayora, sino todas, las fuentes de incertidumbre significativas.
Este enfoque es aplicable para estimar la incertidumbre en ensayos microbiolgicos
cuantitativos, cuando el recuento de los duplicados seleccionados para realizar la
estimacin se encuentra dentro del rango de recuento especificado en el mtodo que se
trate.
Sin embargo, cuando se obtienen recuentos bajos o ningn recuento, ya sea en placa o
por filtracin por membrana, lo cual para una matriz particular y para un ensayo dado
puede ser la regla, no es apropiado el clculo de la precisin intermedia, dado que el
coeficiente de variacin (CV) aumenta rpida y significativamente cuando disminuye el
recuento.
En estos casos no se considera apropiado inocular las muestras con un adecuado nmero
de microorganismos para poder llevar a cabo el clculo de la precisin intermedia, dado
que se asume que la incertidumbre asociada con los recuentos bajos en placa o en
membrana, es similar a la que se obtiene para recuentos mayores y, adems, no refleja ni
representa la verdadera condicin de estas muestras.
Para recuentos bajos ver 6.3.2.2.
6.3.2.2 Norma ISO/TS 19036:2006 y su Amd1: 2009. Esta norma propone un modelo,
que adopta un enfoque top-down o "global", y se basa en la desviacin estndar de la
reproducibilidad (sR) del resultado final del proceso de medicin, que incluye todas las
fuentes de variabilidad que pueden encontrarse en la prctica. La incertidumbre de medida
se estima mediante un enfoque simplificado tomando en cuenta la distribucin de Poisson.
Aplica a ensayos cuantitativos de productos destinados al consumo humano y la
alimentacin animal y, a muestras ambientales en el mbito de la produccin y
manipulacin de alimentos, donde la enumeracin de microorganismos se lleva a cabo
mediante tcnicas de recuento de colonias. Tambin es aplicable a ensayos cuantitativos
llevados a cabo mediante mtodos instrumentales. Aplica a cualquier resultado incluyendo
recuentos bajos y/o bajo nmero de microorganismos. No es aplicable a la enumeracin de
microorganismos utilizando la tcnica del Nmero Ms Probable.
Utiliza tres posibilidades para el clculo de la desviacin estndar de la reproducibilidad
(sR):
sR intralaboratorio, que es un caso particular de "precisin intermedia" segn lo definido
en la ISO 5725-3.

sR interlaboratorio derivado de la validacin del mtodo;

sR interlaboratorio derivado de pruebas de aptitud. Para este ltimo caso el Laboratorio

debe tener en cuenta las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente.
El laboratorio debe tener en cuenta lo especificado en la Norma ISO/TS 19036, al planificar
el diseo experimental para la recoleccin de datos y operar bajo condiciones de
aseguramiento de calidad, tanto interno como externo, de modo de demostrar que el
mtodo se encuentra bajo control y minimizar variabilidades. De este modo se asegura la

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validez de la estimacin de la incertidumbre de medicin para las actividades rutinarias del

laboratorio y no solamente en un momento dado.
6.3.3. Ensayos que utilizan el Nmero Ms Probable (NMP) para determinar el
nmero de microorganismos en una muestra de ensayo: para estos ensayos y de
acuerdo al consenso actual, el Laboratorio puede utilizar los lmites de confianza de las
tablas, siempre que:
a) identifique las combinaciones inusuales e investigue sus causas;
b) demuestre que la precisin (determinada por ejemplo, mediante el anlisis de
duplicados) se encuentra dentro de dichos lmites.
c) cumpla con lo especificado en 6.3 a).

6.4. Expresin de la Incertidumbre de medicin en los informes de ensayo

En el Amd.1 de la Norma ISO/TS 19036, se dan las indicaciones para la expresin del
resultado del ensayo y su incertidumbre asociada. El Laboratorio puede adoptar la
expresin que le resulte ms conveniente y que considere clara a fin de informar al cliente,
cuando ste as lo requiera. Debe indicarse adems el nivel de confianza considerado y el
factor de cobertura. Por ejemplo, lo expresado en el tem 8.2.1 del Amd.1 de la Norma
ISO/TS 19036. Tambin deber indicarse o hacer referencia al procedimiento empleado
para el clculo de la incertidumbre, ya que, de los diversos mtodos utilizados, algunos,
conducen a una subestimacin significativa de la incertidumbre. Este procedimiento debe
estar disponible para el cliente.
Para los mtodos de recuento que utilizan el Nmero Ms Probable (NMP), la
incertidumbre del resultado se expresar como el lmite inferior y superior del intervalo de
confianza de las tablas (de acuerdo al mtodo utilizado), indicando el nivel de confianza
considerado.

7. DOCUMENTACIN RELACIONADA

CE-LE-06, Criterios especficos para la evaluacin y acreditacin de laboratorios

que llevan a cabo ensayos microbiolgicos.

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8. Anexo I - Parmetros de validacin y expresiones para su clculo