MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

AMBIENTAL.LIMPIEZA,
DESINFECCIN
Y
ESTERILIZACIN. PREPARACIN DE MEDIOS DE
CULTIVO I
I.

OBJETIVOS.

II.

Reconocer los materiales del laboratorio de microbiologa

ambiental: su funcionamiento, utilidad y correcta utilizacin.
Diferenciar los tipos y equipos de esterilizacin y su
adecuada forma de uso.
Entender los conceptos de limpieza, desinfeccin y
esterilizacin, sus diferentes tcnicas de aplicacin as
mismo conocer las tcnicas de descontaminacin fsica y
qumica.
Conocer las principales sustancias de desinfeccin que se
usan comnmente en laboratorio de microbiologa y forma
de uso.
Ensayar con los materiales de laboratorio, en la elaboracin
de medios de cultivo y agua peptonada asi tambin practicar
la tcnica para la utilizacin del autoclave como equipo de
esterilizacin.

FUNDAMENTO TERICO.
Manipulacin de material en laboratorio.
Todo material utilizado en laboratorio de microbiologa puede ser, o
desechable
o
reutilizable.

. Material desechable. Aqu se incluyen agujas, jeringas, guantes,

gorros, calzas, lancetas, placas Petri de plstico, etc. En este caso,
dicho material se adquiere estril, se utiliza una sola vez y, una
vez utilizado, se desecha y se destruye. Si el material es punzante
o cortante se tirara en recipientes resistentes a la puntuacin. Si el
material no es punzante o cortante, primeramente se introduce en
el autoclave con el fin de destruir sus grmenes (medios de cultivo
con germen problema) y posteriormente se tirara en contenedores
especiales (bolsas de color rojo o naranja) o incluso sin pasar por el
autoclave se tirara directamente a dichos contenedores para que
posteriormente y a travs de tratamientos especficos sean
destruidos.

. Material reutilizable. Aqu se incluye todo el material de vidrio

1

utilizado en microbiologa, batas, gorras de tela y en general

cualquier material que permita ser esterilizado de nuevo. En estos
casos, despus de la utilizacin, es preciso someter este material a
un proceso de descontaminacin, para lo que es necesario una
limpieza y una desinfeccin o esterilizacin; segn los casos.
Todo instrumento deber limpiarse inmediatamente despus de
haber sido utilizado, siguiendo el protocolo preciso para cada caso.
En microbiologa se puede decir que primero se destruye el
grmen (por tcnicas de esterilizacin) como medida cautelar muy
importante, ya que es necesaria la eliminacin de todo grmen,
por los menos los patgenos. Posteriormente se limpia y una vez
realizadas estas tareas, se efectuar o una desinfeccin o una
esterilizacin, segn se requiera. La esterilizacin es el mtodo
que se utiliza generalmente. Su objetivo es la destruccin total de
cualquier forma de vida, incluidas formas de resistencia o esporas.
Hay otros casos, los menos, en los que se podrn utilizar
materiales no esterilizados previamente, como, por ejemplo, los
portaobjetos para realizar alguna tincin, frascos lavadores con
agua destilada, frascos que contengan colorantes, etc. En estos
casos, dichos materiales se someten a desinfeccin, cuyo objetivo
es la destruccin de toda forma de vida patgena.
Principios bsicos de descontaminacin.
limpieza, desinfeccin y esterilizacin.

Concepto

de

LIMPIEZA. En microbiologa primeramente se destruye el grmen

por tcnicas de esterilizacin o desinfeccin y posteriormente se

limpia. A partir de aqu se suele proceder de la siguiente forma:
. Se separa el material de uso sptico del de uso asptico,
procediendo inmediatamente a su limpieza. Se tendr la
precaucin de no dejar demasiado tiempo el material en agua.

. Se limpiarn los instrumentos primeramente con agua fra, ya

que el calor hace que muchos de los residuos, por ejemplo pus o
sangre,
se
adhieran
ms.
..
. Se lavar con agua caliente y jabn frotando especialmente en
los
sitios
o
lugares
ms
angulosos.
..
. Tras el lavado y enjuagado se volver a aclarar de nuevo en agua
destilada.

.
Se
secar
y
se
comprobar
su
estado.
2

.
. Se proteger si es necesario.
DESINFECCIN. Este mtodo en microbiologa se utilizar para la

descontaminacin de materiales o superficies inertes y para la

descontaminacin de manos, piel, mucosas, etc.
. Materiales o superficies inertes (suelos o cualquier superficie del
laboratorio, incluidos sus materiales). Se utilizan sobre todo los
mtodos qumicos, es decir, los desinfectantes (detergentes,
hipocloritos, etc.), que van a producir la destruccin de todos los
grmenes patgenos, no destruyendo los grmenes no patgenos.
. Desinfeccin de manos, piel y mucosas. La desinfeccin sobre
tejidos vivos corresponde a tcnicas de antisepsia y lo que se
aplica sobre ellos no son desinfectantes sino antispticos. En lugar
donde se aplican producen una destruccin de los grmenes
patgenos.
ESTERILIZACIN. Este mtodo es utilizado en microbiologa para la

reutilizacin de cualquier me pueda y que deba utilizarse como

material asptico. Existen distintas tcnicas pero en cualquier caso
van a producir la destruccin de cualquier forma de vida.
Tcnicas de descontaminacin fsica.
a) Tratamientos trmicos por calor seco o hmedo.

. Descontaminacin por calor seco. Dependiendo de la

temperatura y del tiempo de esterilizacin se consigo o no
esterilizacin. Las tcnicas de esterilizacin por calor seco, son:
-

Flameado. Consiste en exponer un objeto o parte de un

material a la llama de un mechero durante uno o varios
minutos, segn el material de que se trate. Este mtodo se
utiliza para esterilizar la punta del asa de siembra (hasta
incandescencia), las bocas de los tubos de ensayo o matraces
cuando se abren por el motivo que sea y siempre antes de
cerrarlo, puntas de pipeta, etc.
Incineracin. Consiste en destruir en hornos crematorios el
material. Es utilizado para destruir material de un solo uso, por
ejemplo jeringas, guantes, catteres, etc.
Horno seco. Estufas Pasteur o Poupinel. Son hornos metlicos
formados por doble pared y con bandejas ajustables a su
alrededor. Suelen calentarse mediante resistencias elctricas,
pudiendo regularse su temperatura. Externamente estas

estufas presentan un termmetro que indica en todo momento

la temperatura que existe en el interior del horno (que deber
coincidir con la temperatura elegida). Tambin incluye un
selector de temperatura y en ocasiones un reloj. La
esterilizacin se consigue a 1800C durante 2 horas o 1600C
durante 3 horas y media. Este tipo de esterilizacin acta sobre
los materiales en profundidad. La esterilizacin se llevara a
cabo de la siguiente forma:
1. Se preparan los instrumentos o materiales a esterilizar, que
debern estar debidamente protegidos, por ejemplo
envolvindose en papeles especiales, colocndolos en el
interior de cajas, etc.
2. Se introducen en la estufa y se conecta sta seleccionando
la temperatura en el termostato y el tiempo en el reloj (si lo
hubiera), comenzar a contabilizar cuando alcance la
temperatura seleccionada.
3. Transcurrido el tiempo deseado a la temperatura elegida se
desconecta el interruptor y dejamos descender la
temperatura hasta unos 50-600C.
4. Abrimos la estufa y recogemos el material.
Los materiales que se pueden esterilizar por este mtodo son todo
tipo de materiales, vidrio, porcelanas, metal, etc. No se utiliza para
esterilizar medios de cultivo, productos lquidos, telas, plsticos, etc.

Horno Pasteur o Poupinel

. Descontaminacin por calor hmedo.
-

Autoclave. Es un recipiente cilndrico grande o pequeo que se

cierra hermticamente. Externamente lleva un manmetro que
registra la presin que existe en el interior del autoclave cuando
ste est en marcha. Existe un sistema que nos permite
seleccionar la presin que deseamos. Adems presenta una
vlvula de seguridad que se abrir espontneamente cuando la

presin interna supere la elegida o resulte peligrosa, una llave

de purga que permite la salida del vapor y un reloj que
selecciona el tiempo deseado con alarma que indica el final del
proceso. Interiormente en todo autoclave puede observarse en
el fondo una rejilla por debajo de la cual hay agua destilada y
un sistema de tuberas que la calienta generalmente por
electricidad. Dicho calentamiento origina vapor de agua que
asciende por la rejilla y llega a los objetos. El autoclave es un
aparato muy utilizado y sus propiedades esterilizadoras
dependern de las condiciones de presin y tiempo elegidos, es
decir, se conseguir esterilizacin si sometemos el autoclave a
0.8 atm durante 3 minutos (1180C), 1 atm durante 20 minutos
(1200C), 2 atm durante 10 minutos (134 0C) o 3 atm durante 5
minutos (1440C).

Autoclave de esterilizacin
Tcnica para utilizar el autoclave:
1. Con la autoclave apagada y abierta, aadimos agua
destilada hasta la rejilla, cubrindola ligeramente.
2. Se pondr algn soporte metlico para evitar que el material
que se desee esterilizar contacte directamente con el agua.
Esto no es siempre necesario Se colocarn adecuadamente
(en cestillos, cajas, etc.) los objetos que se van a esterilizar.
Se cierra la tapa y se ajusta a presin.
3. Se pondr la llave de purga para que permita la salida de
vapor y se ajustar la presin deseada para la esterilizacin,
as como el tiempo (por ejemplo, 1 atm-20 minutos).
4. Se pondr en marcha el aparato y se esperar hasta que
salga vapor por la llave de purga.
5. Se cerrar la llave de purga y la presin comenzar a subir
hasta llegar al nivel programado. A partir de aqu comenzar
a contar el tiempo de esterilizacin.

6. Una vez realizada la esterilizacin se apagar el interruptor

del autoclave y se esperar a que el manmetro baje a 0.
7. Cuando la presin est a 0, abriremos la llave de purga para
que salga gran parte del vapor que todava se encuentra
contenido. Esto se realizar con cuidado para evitar
descomprensiones bruscas que podran originar la apertura
de aquellos recipientes tapados con algodn graso.
8. Una vez comprobado la salida de vapor, se abre la tapa del
autoclave y se extrae el material.
b) Tratamientos a temperatura ambiente.

. Radiaciones ionizantes. Las utilizadas en microbiologa son:

-

Rayos ultravioletas. Ms que para esterilizar, se usan para

mantener la esterilidad de superficies y/o recintos. Se
caracterizan porque tienen poca penetracin. Actan
impidiendo y alterando la duplicacin del ADN celular. Se debe
evitar su presencia en la piel.
Rayos gamma. Se utilizan para conseguir esterilizacin en fro.
Son producidos por istopos radiactivos. Presentan un poder de
penetracin muy alto, constituyendo el mtodo de esterilizacin
ms utilizado a nivel industrial. Se utiliza para esterilizar
materiales de uso nico o desechable (guantes, jeringas,
vlvulas, etc.) y en general cualquier tipo de material que
pudiera alterarse por calor.

. Sistemas de filtracin. Son dispositivos que, como su nombre

lo indica, van a separar del medio a filtrar todas aquellas
estructuras que sobrepasen un determinado tamao, segn el tipo
de filtro. La efectividad de un filtro va a ser proporcional al tamao
del poro, pudiendo conseguirse esterilizacin. Otra caracterstica
es la presencia de presin, vaco e incluso la carga de filtro, que
generalmente suele ser positiva, ya que las bacterias en medios
neutros tienen carga negativa. Los ms utilizados son:
-

Filtros de membrana. Son filtros de celulosa muy purificada y

con un tamao de poro generalmente fino o muy fino. Estos
sistemas pueden ser, desde muy sencillos a estar formados por
sistemas de piezas desmontables que en muchas ocasiones
llevan acoplada una bomba de vaco para ejercer succin sobre
el medio a filtrar.
Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio. Se utilizan en
cayos especficos y tienen ms resistencia que los anteriores.

Filtros de Chamberland. Son filtros de porcelana porosa, pero

resultan ms caros que los anteriores y son menos utilizados.
Filtros de flujo laminar. Son dispositivos de filtrado donde
entra aire contaminado y sale estril. Son utilizados como
mecanismo de esterilizacin en campanas de flujolaminar, en
quirfanos y en, general, en cualquier recinto en el que se
pretenda crear o mantener un ambiente estril.Pueden ser de
flujo vertical u horizontal.
Ultrasonidos. Consiste en introducir el material en tanques de
distintos tamaos que contienen un liquido generalmente
desinfectante. Una vez puesto en marcha el dispositivo,
comienza a vibrar a gran velocidad originando pequesimas
burbujas que entran en todos los recodos del material
consiguiendo eliminar los microorganismos. Es un mtodo poco
utilizado, ya que resulta caro y poco prctico.

Medios de cultivo.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de
crecimiento y otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad
metablica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad
de medios de cultivo universal adecuado para todos ellos. A
continuacin; una idea general sobre algunos de los constituyentes
habituales de un medio de cultivo que fueron utilizados en la prctica
de laboratorio.
Constituyentes habituales de los medios de cultivo:
. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a
los medios de cultivo. El componente dominante en el agar
bacteriolgico es un polisacrido, al que acompaan algunas
impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar
al 1-2 % en agua licua hacia los 1000C y gelifica alrededor de los 400C.
Dependiendo de su grado de pureza. Con la excepcin de algunos
microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente.
. Extractos. Para su preparacin. Ciertos rganos o tejidos animales
o vegetales (ej. , carne, hgado, cerebro, semillas) son extrados con
agua y calor. Y posteriormente concentrados hasta la forma final de
pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente

empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extractos

de carne, de levadura, de malta, etc.
.Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos
nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestin
enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne,
gelatina, casena, etc.).Las peptonas son ricas en pptidos y
aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas
y
sales.

Agar agar preparado en placa Petri

III.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
Materiales

nombre
probeta

Caracteris
.
de 500 mL

Cant.

Equipos

Balanza analtica

matraz
erlenmeyer
tubos de
ensayo
Papel craft

de 250 mL

de 16 X 150

pabilo

Compuestos
nombre

Autoclave de esterilizacin
Sistema de disolucin por calor

1 pliegoPreparacin de agua
2m
Cant.

peptona

0.15g

triptona

0.75g

glucosa

0.15g

Extracto de levadura

0.38g

Agar agar

2.3g

Agua destilada

300mL

peptonada:

1. Medir con una probeta 150 ml

de agua destilada.
2. Pesar 0.15 g de peptona.

3. Colocar la peptona pesada en un matraz erlenmeyer y diluirla

con los 150 ml de agua destilada.
4. Calentar en el mechero el matraz, durante un tiempo prudente,
para que la peptona se diluya completamente.
5. Tomar otro matraz de 250 ml y colocar 90 ml del medio
preparado.
6. Repartir el resto del medio en tubos de ensayo (16x 150) 9 ml
por cada tubo.
7. Tapar la boca del matraz y de los tubos de ensayo con algodn.
8. Envolver con papel craft la boca del matraz y atarlo con pabilo,
lo mismo con los tubos de ensayo, cogidos en conjunto.
9. Colocar el matraz y los tubos preparados en una canastilla de
metal y colocarlos en el autoclave para esterilizacin.
10.
La esterilizacin en el autoclave se realiza durante 30 a
0
121 C y 15Lb de presin.
11.
Una vez terminado el proceso de esterilizacin (la presin
en el autoclave debe indicar cero) se retira la canastilla y se
dejara enfriar por media hora para luego colocarlo en el
refrigerador.
Diagrama de flujo (preparacin de agua peptonada):

Preparacin de Agar plate court (medio enriquecido):

1. Pesar :
- triptona 0.75 g
- glucosa 0.15 g
- extracto de levadura 0.38 g
- agar agar 2.3 g
2. Medir con una probeta 150 ml de agua destilada
3. Colocar todos los elementos pesados en un matraz y diluirlos
con los 150 ml de agua destilada.

10

4. Calentar el matraz preparado en el mechero para una mejor

disolucin, durante un tiempo prudente.
5. Tapar la boca del matraz con algodn, envolver hasta el
cuello del mismo con papel craft y atarlo con pabilo.
6. Colocar el matraz en una canastilla de metal para ser
introducida en el autoclave junto con los otros preparados de
agua peptonada.
7. La esterilizacin en el autoclave se realiza durante 30 a
1210C y 15Lb de presin.
8. Una vez terminado el proceso de esterilizacin (la presin en
el autoclave debe indicar cero) se retira la canastilla y se
dejara enfriar por media hora para luego colocarlo en el
refrigerador.
Diagrama de flujo (preparacin de Agar plate court (medio
enriquecido)

11

IV.

OBSERVACIONES.
Al trabajar con constituyentes de medios de cultivos en
ellos se not que algunos de ellos como la peptona y el
agar agar se encuentran en estado slido y otros como el
extracto de levadura que se encontraba en forma de polvo,
as tambin la glucosa se encontr en una forma muy
viscosa y poco manejable.
Los procedimientos de elaboracin de ambos componentes
(tanto el agua peptonada como el agar plate court) se
obtuvieron en un tiempo aproximado de 30 a 40 minutos
debido a los inconvenientes que se tuvo que se darn a
conocer en la discusin de este informe.
El proceso de esterilizacin fue realizado sin ningn
inconveniente, los matraces preparados fueron sacados

12

cuando la presin del autoclave indicaba cero, y con

mucho cuidado se dejaron enfriar durante 30 minutos para
su posterior colocacin en el refrigerador.
El medio de cultivo Agar plate court toma forma solida al
estar refrigerado.

V.

DISCUCIN.
En los procedimientos realizados en el laboratorio se tuvieron
ciertas dificultades en el manejo de los instrumentos ya que
no se cuenta aun con la suficiente destreza para su
manipulacin, esta se adquirir durante el transcurso del
curso, estas dificultades traen retrasos en el tiempo lo cual
significa riesgos por contaminacin del ambiente.
Durante la disolucin del agar plate court en el mechero,
debido a la falta de experiencia, se obtuvo un
sobrecalentamiento donde el medio comenz a hervir o
burbujear bruscamente rebalsando gran parte de este, esto
se dio debido a la falta de movimiento durante el
calentamiento y a un exceso de exposicin al fuego.

VI.

CONCLUSIONES.
Mediante el desarrollo de la prctica se define, estudia y
aplica los procedimientos que se deben realizar para la
elaboracin de un medio de cultivo, por otro lado se practic
tambin la tcnica de esterilizacin de los medios de cultivo
en el autoclave.
La importancia de este primer laboratorio radica en el
aprendizaje prctico que se obtuvo para la elaboracin de
medios de cultivo en este caso el agar plate court y el agua
peptonada que sern elementos fundamentales para la
elaboracin de la segunda prctica de laboratorio donde se
incubaran ciertos microorganismos.

VII.

RECOMENDACIONES.
Para evitar la contaminacin por el ambiente siempre es
recomendable trabajar con el mechero encendido ya que
en el ambiente existen diversos microorganismos que
pueden ser perjudiciales para las operaciones que se estn

13

VIII.

realizando, as tambin se debe evitar hablar, como norma

de seguridad.
Es ideal que todo el proceso de preparacin de los medios
de cultivo y agua peptonada dure un tiempo aproximado
de 10 minutos, ya que as se evita problemas por
contaminacin.
Cuando se realiza la disolucin calentando el matraz con el
mechero, se debe tener mucho cuidado, este proceso debe
ser durante un tiempo prudente ya que se corre el riesgo
de que rebalse la solucin por ello durante la operacin se
debe hacer pequeos movimientos circulares con el
matraz cuidadosamente.
Al extraer los compuestos como la glucosa que tienen una
alta viscosidad se recomienda colocarlo sobre un plato de
vidrio o plstico y que ocupe la menor rea posible ya que
si se embarra la glucosa por toda la superficie del plato, va
ser ms laborioso el trabajo de traspasarla al matraz con el
riesgo de una prdida de peso en esta.
Cuando se mide el volumen de agua destilada en la
probeta se suele agregar unos 0.3 ml de ms ya que
siempre ocurre una pequea variacin en el volumen al
transvasar el agua de la probeta al matraz y/o al calentar
el matraz para la disolucin.
Antes de someter a esterilizacin los componentes se los
debe cubrir la tapa adecuadamente con algodn evitando
que estos tengan contacto con el medio, asi mismo se
debe tener cuidado en atar correctamente los tubos.

BIBLIOGRAFA.
URMETEA, Alonso y otros, Manual
microbiologa, 2da edicin. Masson.

Prctico

de

GRANADOS, Raquel; Villaverde, Carmen. Microbiologa.

Bacteriologa.
Caractersticas
y
clasificacin
bacteriana, virologa. Caractersticas y tcnicas
bioqumicas.Tomo I .Thomson

14

IX.

ANEXOS.
Fotografas en laboratorio de microbiologa tomadas
durante la preparacin de agua peptonada.

15

Agua peptonada preparada para el proceso de

esterilizacin.

Fotografas en laboratorio de microbiologa

tomadas durante la
preparacin del agar plate court.
16

Agar plate court preparado para

el proceso de esterilizacin.

17