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y determinacin de la
incertidumbre de la medicin:
Aspectos generales sobre la
validacin de mtodos
Comit Editor
Boris Duffau
Fabiola Rojas
Isabel Guerrero
Luis Roa
Luis Rodrguez
Marcelo Soto
Marisol Aguilera
Soraya Sandoval
Se agradece la colaboracin prestada por el Sr. Leonardo Merino de la National Food
Administration de Suecia, para la elaboracin de esta Gua
Coordinacin Edicin
Soraya Sandoval
Seccin Metrologa Ambiental y de Alimentos
Departamento de Salud Ambiental
Edicin
Ao 2010
GUA TCNICA N 1
I: INTRODUCCION
GUA TCNICA N 1
CONTENIDO
I: INTRODUCCION
II: TERMINOLOGA
IV: VALIDACION
21
24
25
25
26
SELECTIVIDAD
LINEALIDAD
SENSIBILIDAD
LIMITES
EXACTITUD
ROBUSTEZ
APLICABILIDAD
27
28
33
34
37
45
49
V: INCERTIDUMBRE
50
VI: ANEXOS
54
VII: BIBLIOGRAFA
66
GUA TCNICA N 1
II: TERMINOLOGA:
Adecuacin al propsito: Es el grado en que la aplicabilidad de un mtodo se ajusta a los criterios o
requerimientos acordados entre el analista y el usuario final (cliente) que hace uso de los informes o
datos generados a travs de un mtodo de ensayo. Es decir es la adaptacin de un mtodo para un fin
previsto.
Analito: Sustancia (qumica, fsica o biolgica) buscada o determinada en una muestra, que debe ser
recuperada, detectada o cuantificada por el mtodo.
Aplicabilidad: Los analitos, matrices y concentraciones para los cuales puede utilizarse
satisfactoriamente un mtodo de anlisis con el fin de determinar su conformidad con una norma.
(Referencia: Manual Codex Alimentarius 16 Ed.)
Nota: La declaracin de aplicabilidad (mbito o campo de aplicacin), adems de una declaracin
del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor, puede incluir tambin advertencias
acerca de la interferencia conocida de otros analitos, o de la inaplicabilidad a determinadas
matrices y situaciones. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18 Ed.)
Blanco matriz: Matriz que no contiene el analito de inters u objetivo para el mtodo seleccionado.
Calibracin: Operacin que, en condiciones especificadas, establece primero una relacin entre los
valores con incertidumbres de medicin proporcionados por las normas de medicin y las indicaciones
correspondientes con las incertidumbres de medicin asociadas, y utiliza luego esta informacin para
establecer una relacin a fin de obtener un resultado de medicin a partir de una indicacin.
(Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
Nota1 : La calibracin se puede expresar por medio de una declaracin, una funcin, un diagrama,
una curva o una tabla. En algunos casos puede consistir en una correccin aditiva o multiplicativa
de la indicacin con la incertidumbre de medicin asociada. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
Nota 2: La calibracin no debe confundirse con el ajuste de un sistema de medicin que a menudo
se denomina errneamente autocalibracin, ni tampoco con la verificacin de la calibracin.
A menudo se percibe como calibracin solamente el primer paso mencionado en la definicin
anterior. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
Es decir, es un procedimiento de comparacin entre lo que indica un instrumento y su "valor
verdadero" de acuerdo a un patrn de referencia con valor conocido.
Componente de la Incertidumbre: Cada una de las contribuciones a la incertidumbre.
Criterios de aceptabilidad: Exigencias de una caracterstica de funcionamiento o comportamiento en
funcin de las cuales se puede determinar que un mtodo analtico es adecuado para la finalidad
perseguida y ofrece resultados confiables.
GUA TCNICA N 1
GUA TCNICA N 1
GUA TCNICA N 1
GUA TCNICA N 1
X = n xi
n
Siendo:
xi = valor de una lectura.
n = nmero de lecturas
Desviacin estndar (
, S): Es el promedio de lejana de los valores obtenidos (lecturas) respecto del
promedio.
S=
i=1 (xi-X)2
n-1
Siendo:
xi = valor de una lectura.
X= promedio de la totalidad de lecturas.
n = nmero de lecturas
Coeficiente de Variacin (CV): Desviacin estndar dividida por la media. Tambin es conocida como
desviacin estndar relativa (RSD). El coeficiente de variacin puede ser expresado en porcentaje:
%CV = S x100
X
Siendo:
S = desviacin estndar de las lecturas.
X = promedio de la totalidad de lecturas.
Varianza: Es una medida de dispersin definida como el cuadrado de la desviacin estndar.
S2 = n i=1 (xi-X)2
n-1
Siendo:
xi = valor de una lectura.
X= promedio de la totalidad de lecturas.
n = nmero de lecturas
GUA TCNICA N 1
Coeficiente de Variacin de Horwitz (CV h): Es el coeficiente de variacin definido por W. Horwitz, a
travs de la ecuacin obtenida de un estudio estadstico. En dicho estudio, Horwitz despus de reunir
una serie de datos (provenientes de 150 ensayos de interlaboratorios organizados por AOAC), observ
que el coeficiente de variacin de los valores medios dados por los diferentes laboratorios aumentaban
a medida que disminua la concentracin del analito. Comportndose como muestra la siguiente
grfica, conocida como la trompeta de Horwitz.
CVh = 2(1-0.5.log c)
H = 0.02 x c 0,8495
Dnde:
CV h= Coeficiente de variacin de Horwitz
H = Desviacin estndar calculada conforme al modelo de precisin de Horwitz.
C= concentracin del analito expresado en potencia de 10 (Ver tabla N 1).
Este coeficiente de variacin (CVh) esta expresado en potencia de 2, y la concentracin media del
analito expresado como potencia de 10, de esta forma independiente del analito y el mtodo utilizado
se puede estimar el CV esperado para la precisin.
Tabla N 1:
Concentracin
100
> 10
>1
> 0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001
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Razn
(Potencia de 10)
1
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
10-9
Unidad
100% (100 g/100 g)
> 10 % (10 g/100 g)
> 1 % (1 g/100g)
> 0,1 % (1 mg/g 0,1 g/100 g)
100 mg/kg
10 mg/Kg
1 mg/Kg
100 g/Kg
10 g/Kg
1 g/Kg
- 3
- 2
+2
+3
Nivel de significancia (Alfa, ): Es el nivel de significacin utilizado para calcular el nivel de confianza. El
nivel de confianza es igual a 100% (1 - ), es decir, un alfa () de 0,05 indica un nivel de confianza de
95%.
Factor de cobertura: Nmero mayor que uno por lo que una combinacin de incertidumbre en la
medicin estndar se multiplica a obtener una incertidumbre expandida de medida. Un factor de
cobertura suele ser simbolizada k. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
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Pruebas de Significancia
Es frecuente utilizar pruebas de significancia estadsticas durante el proceso de validacin de los mtodos
analticos en este sentido, se aplican comnmente las siguientes:
1.
2.
Al hacer una prueba de significancia se comprueba la veracidad de una hiptesis experimental, llamada
hiptesis alternativa (H1, si hay diferencia,) con respecto a la hiptesis nula (H0, no hay diferencia).
Es la hiptesis alternativa la que determina el nmero de colas. Si la hiptesis alternativa contiene la
frase mayor que menor que, la prueba es de una-cola. Si la hiptesis alternativa contiene la frase
no es igual que, la prueba es de dos-colas. (Fuente: National Food Administration of Sweden)
1. La media es igual al valor dado (H0: = x0) versus la media no es igual al valor dado (H1: x0) dos-colas
2. La media es igual al valor dado (H0: = x0) versus la media es menor que el valor dado (H1: < x0) una-cola
3. La media es igual al valor dado (H0: = x0) versus la media es mayor que el valor dado (H1: > x0) una-cola
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Prueba t-Student
Esta prueba permite comparar las medias de dos grupo de datos y determinar si entre estos parmetros
las diferencias son estadsticamente significativas.
En la prueba t , se procede a determinar el valor t de student calculado, obtenido de la experiencia
analtica, y este valor posteriormente se compara con el llamado valor crtico, este valor critico se obtiene
de la tabla de t-student para un determinado porcentaje de confiabilidad (normalmente se utiliza el 95%
de confianza, es decir, un valor de 0,05). Si no existen diferencias significativas entre 2 grupos, el t
calculado debera ser inferior al t critico (o conocido tambin como t de tabla).
El siguiente ejemplo, trata de explicar la afirmacin realizada anteriormente: Un atleta desea realizar un
salto con garrocha, para lo cual, l realiza un calculo de con que velocidad y con que fuerza (t calculado)
debe realizar la prueba de atletismo, a fin de saltar correctamente la altura establecida para la
competencia (t critico).
Si el t calculado es inferior al t crtico, entonces, no existir una diferencias significativa que permita
superar al t critico, y el atleta no podr realizar el salto.
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Si el valor t calculado es superior al t crtico, entonces, existir una diferencia significativa que
permitir superar al t crtico, y el atleta podr realizar el salto.
Para explicar de mejor manera la prueba de t-Student, hemos incluido los siguientes ejemplos:
EJEMPLO 1: Prueba t-Student para 2 variables independientes
Se realiza el anlisis de una muestra de flor en agua bajo el mtodo de cromatografa inica en
Laboratorio 1 y por EIS en Laboratorio 2. Los resultados obtenidos en mg/L de F- , fueron:
Nivel
Observaciones
1
Experiencia 1: n1=6
Experiencia 2: n2=5
Grupo/Experiencia
1
2
4,5
5,3
5,2
6,8
5,0
6,9
6,4
7,1
6,0
7,7
7,1
---
Media X1=5,70
Media X2= 6,76
X1 - X2
S1 2 (n1-1) + S2 2 (n2-1) .
n1+ n2-2
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.
1 + 1
n1 n2
13
5,70
t calc =
6,76
t calc =
1,06
0,34292
= 3,09.
Se desea determinar si son iguales las medias de la experiencia 1 y 2. Para esto se procede luego a
determinar el t critico en la tabla t-student para =0,05.
En la interseccin se lee: valor crtico para t, que es t crit= 2,262.
2 colas
/2
80%
0.10
90%
0.05
95%
0.025
3.078
1.886
1.638
1.533
1.476
1.440
1.415
1.397
1.383
1.372
6.314
2.920
2.353
2.132
2.015
1.943
1.895
1.860
1.833
1.812
12.706
4.303
3.182
2.776
2.571
2.447
2.365
2.306
2.262
2.228
v
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
calc
>t
crit
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Grupo/Experiencia
A
4
B
3
t calc =
X .
(S/n)
X =
/2
80%
0.10
90%
0.05
95%
0.025
1
2
3
4
5
3.078
1.886
1.638
1.533
1.476
6.314
2.920
2.353
2.132
2.015
12.706
4.303
3.182
2.776
2.571
Se procede a comparar el t crtico y el t calculado, t calc= 3,48. Se observa que t calc > t crit. Concluimos que
existen diferencias significativas. Por lo cual no es aceptable.
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Valor obtenido
5,8
6,1
6,4
6,2
t calc =
X- .
(S/n)
/2
80%
0.10
90%
0.05
95%
0.025
1
2
3
4
3.078
1.886
1.638
1.533
6.314
2.920
2.353
2.132
12.706
4.303
3.182
2.776
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crit
16
Experiencia 1:
Experiencia 2:
n1=10
n2=14
Grupo/Experiencia
1
2
1
2
C1,1
C1,2
C2,1
C2,2
3
4
C1,3
C1,4
C2,3
C2,4
C1,5
C2,5
6
7
C1,6
C1,7
C2,6
C2,7
8
9
C1,8
C1,9
C2,8
C2,9
10
C1,10
11
--
C2,10
C2,11
12
--
C2,12
13
--
C2,13
14
--
C2,14
Media 1=14,9
Media 2= 16,2
Varianza 1= 26,4
Varianza 2 = 12,7
Si se intenta un test de t-student con estos valores hay que verificar si las 2 varianzas no son
significativamente diferentes; por que si son diferentes, el test de t-student no podr ser utilizado. Que
se hace?
1) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-1 = 10-1=9
2) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-2 = 14-1=13
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Anlisis de Varianza
El anlisis de varianza, tambin conocido como ANOVA, es el anlisis estadstico en el cual se compara
ms de dos medias entre s.
Para ese fin, se debe proceder a comparar las diferencias entre cada grupo y las observaciones
realizadas.
Ejemplo:
Experiencia n
n= Observaciones Mtodo A Mtodo B Mtodo C
1
8,5
9,9
7,4
2
9,2
10,0
8,0
3
7,8
11,1
8,6
N= nmero de observaciones totales = 3 x 3 = 9
Se procede a calcular la sumatoria de las observaciones de experiencia (o grupo):
Calculo
xi
xi2
25,5
31,0
24,0
217,73
321,22
192,72
SCB = ( xA)2 + ( xB)2 + ( xC)2 - ( x)2 = (25,5)2 + (31,0)2 + (24,0)2 (80,5)2 = 9,0553
nA
nB
nC
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Suma cuadrados residuales o dentro del grupo, es decir , dentro de los mtodos:
Se realiza por simple resta, es decir:
Origen de la Varianza Grados de libertad (gl) Sumas cuadrticas (SC) Cuadrados medios (CM)
Entre grupos (B)
9,0553
4,5278
2,58647
0,4311
Total (T)
11,642
-----
F calc = ( SCB/glB)
(SCw/ glw)
0,4311
Se determina el valor F crtico de Tabla F (Ver Anexo n 4) y coloca los grados de libertad (gl) del
numerador (2) en la fila horizontal, y del denominador (6) en la columna, para un valor de = 0,05, 1
cola:
gl
1
2
3
4
5
6
GUA TCNICA N 1
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IV: VALIDACION
La validacin de un mtodo analtico es un paso fundamental para asegurar que los resultados
entregado por dicho mtodo son confiable. Cuando se realiza la validacin de un mtodo por parte del
laboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadstico que el mtodo es
adecuado para los fines previstos.
En este sentido, es importante que para el proceso de validacin se asigne a un responsable de realizar
dicha tarea. De manera que, la validacin se efecte en forma metdica, ordenada, trazable y
confiable.
Es importante que el laboratorio tenga claridad antes de iniciar la validacin de cuales son los
requerimientos del mtodo para establecer el alcance de la validacin.
Es esencial, entonces conocer el mtodo a validar y su aplicabilidad, es decir, el analito, su
concentracin (nivel, LMP, LMR, etc.) y la matriz (o matrices) en las cuales se desea utilizar.
En general, se establece que el laboratorio DEBE validar:
1. Mtodos no normalizados: Corresponden a mtodos desarrollados por el laboratorio o mtodo
nuevos (ejemplo: publicado en revista cientfica), o bien, a mtodos que tradicionalmente se
han utilizado en el laboratorio pero que no estn normalizados.
2. Mtodo normalizado con una modificacin significativa.
Cuando se trata de un mtodo empleado tradicionalmente por el laboratorio que no este normalizado,
se puede realizar una Validacin Retrospectiva, es decir, en base a los datos experimentales que el
laboratorio dispone, para la cual se realizar la recopilacin de la mayor cantidad de datos histricos
disponibles, para luego realizar un proceso de ordenamiento y seleccin de los datos recopilados, estos
datos pueden ser: curvas de calibracin, resultados de ensayos, cartas de control, ensayos de aptitud,
etc. A travs de estos, se debern determinar los parmetros de validacin, y evaluar si los resultados
obtenidos para los fines de la son aceptable.
En caso de ser un mtodo nuevo (o uno antiguo del que no se dispongan de datos suficientes) se debe
realizar una Validacin Prospectiva, generando a travs de anlisis datos experimentales.
En algunos casos se puede realizar lo que se conoce como validacin menor o verificacin cuando se
trate de:
1. Mtodos normalizados.
2. Mtodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo: uso en otra matriz.
3. Ampliaciones y modificaciones menores de mtodos normalizados. Ejemplo: uso en otros
analitos.
4. Cuando se trate de mtodos previamente validados, que haya sufrido alguna alteracin
significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser; cambio de
equipo, cambio de componentes de equipo como columnas, detectores, cambio analista,
cambio de la matriz que contiene la muestra o de nivel de concentracin del analito de
inters, entre otros.
GUA TCNICA N 1
21
La verificacin, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el laboratorio domina el mtodo
de ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un mtodo normalizado
modificado para la verificacin se requiere solo realizar aquellas pruebas que indiquen que la variacin
realizada no afecta el ensayo.
En ocasiones, lo que se busca a travs de una validacin es demostrar que un mtodo es equivalente a
otro.
El objetivo de la validacin y la verificacin, es demostrar que el mtodo utilizado por un laboratorio es
adecuado para la aplicacin en la que se propone utilizar, as, como tambin demostrar que las
modificaciones que pudieron haberse realizado no afectan su desempeo, ni la confiabilidad de los
resultados por este entregado.
GUA TCNICA N 1
22
Tipo de Mtodo
No
Se trata de un mtodo normalizado?
Normalizado
Normalizado
Modificado
No
No Normalizado:
Nuevo o
Desarrollado por el
laboratorio
recientemente
No Normalizado
Tradicional :
usado por el
Laboratorio hace
aos
Verificacin
Validacin Prospectiva
Validacin
Retrospectiva
Comparar resultados
versus criterios
Evaluar resultados
INFORME DE VALIDACIN
REVISIN DE INFORME
GUA TCNICA N 1
23
En relacin a los parmetros de validacin o verificacin estos debern determinarse de acuerdo al tipo
de mtodo. Para este fin la siguiente tabla puede ser utilizada como gua:
Tabla N 2
PARAMETRO
A EVALUAR
SELECTIVIDAD
LINEALIDAD
SENSIBILIDAD
LIMITES
PRECISION
VERACIDAD
ROBUSTEZ
APLICABILIDAD
CARACTERISTICA(S)
Identificacin analito
Interferencia de
matriz
Rango lineal
Pendiente
Critico (LC)
Deteccin (LOD)
Cuantificacin (LOQ)
Repetibilidad
Reproducibilidad
Sesgo (s)
Recuperacin (R)
Test de Youden y
Steiner
-------------
METODO CUANTITATIVO
METODO
CUALITATIVO
NORMALIZADO
MODIFICADO
NUEVO
No
No
No
S o No
S o No
No
No
S o No
No
No
S o No
S o No
Diseo experimental:
Establecer la(s) muestra(s) a ser analizada(s): testigos reactivos, blanco matriz, material
certificados, material control, material(es) de referencia certificado, matrices de las muestras,
muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc.
El (los) parmetro(s) y pruebas a desarrollar, en caso, de que la prueba no sea una
convencional, sino diseada por el responsable, tambin deber indicarse en el documento.
Nmero de anlisis requeridos para cada prueba y/o parmetro.
Criterios de aceptabilidad para cada parmetro de validacin.
Analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analtica(s).
GUA TCNICA N 1
24
Cualquier modificacin realizada al plan de validacin, durante el proceso, debe quedar debidamente
documentada.
En anexo N 1, Se muestra un formato de plan de validacin. En el anexo N 6, se incluye un ejemplo de
esquema de trabajo de cmo se desarrolla un plan de validacin para un mtodo normalizado.
b) DESARROLLO DE PRUEBAS DE PARMETROS DE VALIDACIN
Para el desarrollo de las pruebas de validacin, los analistas a cargo debern conocer el procedimiento
de mtodo de ensayo y el nmero de ensayos o mediciones a realizar de acuerdo a lo establecido en el
plan de validacin.
(IMPORTANTE: El personal responsable de realizar los anlisis se encuentre debidamente calificado, y
los equipos asociados al mtodo deberan encontrarse calibrados o controlados antes de su uso.)
Los resultados obtenidos en cada prueba deben ser debidamente registrados y almacenados.
Los ensayos o mediciones realizadas sern con el fin de poder realizar las siguientes pruebas de
parmetros de validacin:
Selectividad
Linealidad
Sensibilidad
Limites
Exactitud
Precisin
Robustez
Aplicabilidad
El analista o responsable de la validacin deber con los resultados obtenidos de cada prueba realizar
los clculos matemticos, comparativos y/o estadsticos correspondientes a cada ensayo para lo cual
podr utilizar para ese fin un software estadstico, calculadora o una planilla de clculo (ejemplo: Excel).
C) EVALUAR RESULTADOS DE LA VALIDACIN
Se deber evaluar para cada parmetro de validacin, si los resultados de las pruebas son
satisfactorios, es decir, si cumplen con los criterios de aceptabilidad establecidos en el plan, se
considera que el mtodo es aceptable.
GUA TCNICA N 1
25
D) INFORME DE VALIDACIN
El responsable de la validacin, deber realizar un informe en el cual presentar los resultados
obtenidos y conclusiones. El informe debe contener la declaracin de la aplicabilidad del mtodo.
En el anexo N 2, se entrega un modelo tipo de informe de validacin.
El laboratorio debe tener disponible el procedimiento usado para la validacin, y una declaracin
acerca de que el mtodo se ajusta para el uso propuesto.
Este informe deber ser revisado por una tercera persona que tenga conocimiento en el rea, y que no
haya formado parte del proceso de validacin. En dicha revisin se deber establecer si los criterios de
aceptabilidad establecidos en el plan son aceptables, y si el mtodo es idneo para el fin previsto.
GUA TCNICA N 1
26
SELECTIVIDAD
La selectividad es el grado en que un mtodo puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de
interferentes. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en la matriz de inters.
La prueba de selectividad puede disearse de acuerdo al mtodo, en el caso de cromatografa la
resolucin entrega informacin sobre la selectividad del mtodo, en el caso de espectrofotometra el
espectro de absorcin o un espectro de masas entrega informacin al respecto, en especial cuando es
comparado en presencia de una interferencia.
Una prueba de Selectividad comnmente utilizada, consiste en analizar un mnimo de tres testigo
reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estndares de concentracin conocida del analito de
inters.
Se deben comparar las lecturas (seales de medicin) obtenidas para cada caso, y observar si existen
variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estndares o muestras con analito. Si se
encuentran diferencias significativas debern ser identificadas y en lo posible eliminadas.
GUA TCNICA N 1
27
LINEALIDAD
La linealidad es la capacidad de un mtodo de anlisis, dentro de un determinado intervalo, de dar una
respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habr
de determinar en la muestra de laboratorio.
Con el fin de determinar el rango lineal se puede realizar mediante un grfico de concentracin versus
respuesta, que se conoce como Funcin Respuesta (normalmente llamada recta de calibrado). sta se
establece cada da con una cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones de
trabajos limpios de valor terico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. En este sentido se
recomienda abarcar valores desde cercano al cero y valores superiores al LMP o al valor de inters. El
nmero de puntos a analizar deber ser establecido por el analista (en general, se utiliza un mnimo de
4 valores).
Luego de realizar el grafico se puede observar el comportamiento de la curva y establecer
cualitativamente el rango lineal (fig.1). Despus de establecer el comportamiento lineal del mtodo se
deber realizar la Curva de trabajo o curva de calibracin (fig.2). Graficar los datos de concentracin de
los estndares de calibracin estimados (X) v/s la lectura observada (Y).
Fig. 1
Fig.2
Evaluar los estimadores de regresin lineal del grfico: la pendiente (m), el coeficiente de correlacin (r
) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (L0).
Y= X x m + Lo
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28
En general el criterio de aceptacin cualitativo que se usa para determinar la linealidad es el coeficiente
de correlacin:
El coeficiente de correlacin indica el grado de relacin entre la variable concentracin (X) y la variable
respuesta (Y) de la curva de calibracin. Los valores mximos que puede alcanzar son 1 y 1. El valor
mximo de 1 indica una correlacin positiva perfecta (entre X e Y) con una pendiente positiva. Cuando
r=0, no existe correlacin alguna, independencia total de los valores X e Y
En la prctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe correlacin con una
probabilidad elevada. Para una curva de calibracin o trabajo, es recomendable que el coeficiente de
correlacin obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso de trazas se admite un valor igual
o mayor que 0.99.
r = _Sxy
Sx Sy
Sxy=
i=1
n x i yi - ( x p r o m yprom )
n
Sx=
(( xi2/n) - (xprom2))
Sy=
(( yi2/n) - (yprom2))
tr = | r | (n-2)
(1- r2)
Donde:
tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlacin
| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
n 2 = Nmero de grados de libertad
r2 = Valor del coeficiente de determinacin
GUA TCNICA N 1
29
Ejemplo:
Nivel
1
2
3
4
5
Conc
mg/L
rea
1
13,4
26,6
40,8
54,7
68,6
43,8
86,2
131,2
181,7
221,6
rea
2
44,2
86,1
132,7
180,7
224,2
rea
3
44,1
87,6
133,6
178,6
221,8
A
Promedio
44,0
86,7
132,5
180,3
222,5
Desviacin
Estndar
S
CV %
0,2
0,8
1,2
1,6
1,4
0,4
1,0
0,9
0,9
0,6
Varianza
0,0
0,7
1,4
2,5
2,0
n= N de niveles= 5
r= coeficiente de correlacin= 0,99985
r= coeficiente de determinacin= 0,9997
sustituyendo los valores:
t r = | r | (n-2) = I 0,99985 I*(5-2)= I 0,99985 I*3 = 99.985
(1- r2)
(1-0,9997)
0,0003
GUA TCNICA N 1
30
El valor t critico obtenido de la tabla para: 3 grados de libertad, un = 0.05 y 2 colas es:
2 colas
/2
80%
0.10
90%
0.05
95%
0.025
1
2
3
4
3.078
1.886
1.638
1.533
6.314
2.920
2.353
2.132
12.706
4.303
3.182
2.776
t crit = 3,182
Se observa que el valor observado de tr (es decir el t calculado) es mayor que tcrit (99,85 > 3,182),
por lo cual se rechaza la hiptesis nula Ho, siendo la correlacin lineal significativa con la
probabilidad calculada.
En cuanto al rango de aplicabilidad, el Codex Alimentarius ha establecido que respecto al LMP el
Intervalo mnimo aplicable es:
Respecto de un LMP 0,1 ppm, [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ].
Respecto de un LMP < 0,1 ppm, [LMP - 2 SR , LMP + 2 SR ].
Siendo SR la desviacin estndar de la reproducibilidad.
Ejemplo:
El LMP para mercurio en sal es de 0,1 mg/Kg, por lo cual se aplicara la ecuacin de Horwitz para
determinar la SR prevista a este nivel que es igual a 10-7
SR = c 2 C0,1505
100
c= Es el LMP en mg/Kg es decir; 0,1
C= Es cociente de concentracin es decir la concentracin expresada en potencia de 10.
GUA TCNICA N 1
31
Sustituyendo obtendramos:
SR = 0,1 2 (0,0000001)0,1505 = 0,0233
100
Entonces:
Para un LMP 0,1 ppm se aplica el criterio: [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ].
Es decir:
Entonces el rango que se requera del mtodo para que fuera aceptable debera estar a lo menos entre
0,03 y 0,17 mg/Kg.
Para coeficientes de concentracin < 10-7, se aplica la teora de Thompson, esto es, CVR% = 22 %
por lo tanto, SR = 0,22 LMP
Ejemplo:
El Codex Alimentarius seala que para un LMP = 0,01 mg/kg , es decir, para una concentracin de 10-8,
es decir < 10-7:
El rango de aceptabilidad seria:
LMP + 2 SR= 0,01 2 SR = 0,01 2 (0,22 LMP) = 0,01 0,44 0,01 = 0,01 0,0044 mg/kg
El rango mnimo aplicable para un LM de 0,01 mg/kg es, por lo tanto, 0,006-0,014 mg/kg.
GUA TCNICA N 1
32
SENSIBILIDAD
La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicacin de un sistema de medicin y el cambio
correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la medicin.
En una regresin lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (m) de la recta de calibracin.
Se calcula como:
m = Xi Yi - ( Xi Yi/ n)
X2 i - ((Xi)2 /n)
El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminacin de los valores de
concentracin en base a la lectura.
En figura N 3, se puede observar que mientras ms prxima al eje de las Y est la recta, significa que a
ligeros cambios en las concentraciones esperadas habr grandes variaciones en los resultados de las
lecturas observadas [m2] En el caso de [m3] grandes cambios en la concentracin no son significativos
para la lectura.
Fig. 3
Se dice, que un mtodo es sensible cuando una pequea variacin de concentracin determina una
gran variacin de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad de respuesta instrumental
frente a una determinada cantidad de analito. En el tiempo, visualiza como se comporta el
instrumento.
GUA TCNICA N 1
33
LIMITES
Se debe tener en consideracin los siguientes parmetros: Valor critico, limite deteccin (LOD) y limite
de cuantificacin (LOQ).
Valor critico (LC): El valor de la concentracin o cantidad neta que en caso de superarse da lugar, para
una probabilidad de error dada , a la decisin de que la concentracin o cantidad del analito presente
en el material analizado es superior a la contenida en el material testigo (Referencia: Codex
Alimentarius).
Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz o testigo reactivo.
LC = t (1-;) x So
S : t ( 0.05,) 1,645
LC = 1,645 x So
Donde:
t = t-Student
1-= probabilidad b
v= Grados de libertad
So = Desviacin estndar de las lecturas del blanco matriz o testigo reactivo.
Un resultado inferior al LC que determine la decisin no detectado no deber interpretarse como
demostracin de que el analito est ausente. No se recomienda notificar tal resultado como cero o
como < LOD. Deber hacerse constar en todo los casos el valor estimado y su incertidumbre.
Lmite de deteccin (LOD): Concentracin o cantidad real del analito presente en el material objeto de
anlisis que llevar, con una probabilidad (1-), a la conclusin de que la concentracin o cantidad del
analito es mayor en el material analizado que en el material testigo (Referencia del Manual del Codex
Alimentarius ).
Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o
concentracin estimada cercana al blanco.
LOD = 2 t (1-;) x So
S : t ( 0.05,) 1,645
LOD = 3,29 x So
LOD = 3,29So, cuando la incertidumbre del valor medio (esperado) del material testigo es insignificante,
= = 0,05 y el valor estimado tiene una distribucin normal con una varianza constante conocida.
Un criterio de aceptacin adecuado es LC < LOD < LMP. En general tambin se sugiere, para un LMP >
0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOD < 1/5 LMP.
Lmite de cuantificacin (LOQ): Una caracterstica del funcionamiento del mtodo que suele expresarse
como seal del valor (verdadero) de la medicin que producir estimaciones con una desviacin
estndar relativa (RSD) generalmente de 10 % (o 6 %). El LOQ se calcula mediante la siguiente frmula:
LOQ = 10 So
GUA TCNICA N 1
34
Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o
concentracin estimada cercana al blanco.
En este caso, el LOQ es exactamente 3,04 veces el lmite de deteccin, dada la normalidad y = =
0,05. En el LOQ es posible lograr una identificacin positiva con un nivel de confianza razonable.
Un criterio de aceptacin adecuado es LC < LOD<< LOQ <LMP. En general tambin se sugiere, para un
LMP > 0,1 ppm un LOQ < 1/5 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOQ < 2/5 LMP.
Ejemplo ejercicio de lmites:
Para el analito mercurio en marisco fresco el limite mximo permisible es 0,5 mg/Kg. Se realiza la
experiencia de medir 10 veces el blanco matriz:
Medicin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Resultado
mg/Kg
0,05
0,05
0,03
0,04
0,05
0,03
0,01
0,05
0,05
0,04
LC =
Se puede observar que se cumple que el LC es inferior al LOD, ya que 0,022 < 0,044.
El LMP establecido por el analito es de 0,5 ppm es decir es > 0,1 ppm, por lo cual el LOD debe ser <
1/10 del LMP, es decir, debe ser inferior o igual a una dcima parte de 0,5.
0,044 mg/L es inferior a 0,05 mgKgL , por lo cual se estara aceptando el LOD calculado de acuerdo al
criterio de aceptacin establecido.
Si el LOQ seria:
GUA TCNICA N 1
35
Para un LMP de 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP , es decir , se debe determinar el (LMP/5) , que es : 0,5/5
de 0,1 mg/Kg.
Por lo cual no se estara cumpliendo el criterio pues 0,13mg/Kg es mayor 0,1 mg/Kg. El LOQ no sera
aceptable para el campo de aplicabilidad que le quiere dar al mtodo.
En este sentido se pude tomar la decisin de buscar otro mtodo que cumpla con estos requisitos para
este fin previsto o aceptar su aplicabilidad, considerando en la declaracin de la aplicabilidad estas
reservas u observaciones en cuanto a su LOQ.
Es importante realizar posteriormente la experiencia analtica de la determinacin del analito en el
nivel de concentracin determinado para el LOD o LOQ, es decir evidenciar resultados experimentales,
que demuestren la validez del resultado obtenido.
GUA TCNICA N 1
36
EXACTITUD
El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultado
de un ensayo y el valor de referencia.
El trmino exactitud, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una
combinacin de componentes aleatorios y un componente comn de error sistemtico o sesgo.
Cuando se aplica a un mtodo de ensayo, el trmino exactitud se refiere a una combinacin de
veracidad y precisin. En el siguiente esquema de Tiro al Blanco, ampliamente utilizado para
ejemplificar esto, los punto u orificios equivaldran a los resultados analticos y el circulo rojo al centro
el rango en el cual se espera este el valor de referencia (o verdadero).
Como se puede observar entre ms veraz y preciso sea un resultado analtico, es ms exacto.
GUA TCNICA N 1
37
VERACIDAD: Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie
de resultados y un valor de referencia aceptado.
La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperacin.
a)
Sesgo (s): La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una
medicin y el valor verdadero. En la prctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor
verdadero. El sesgo es el error sistemtico total en contraposicin al error aleatorio.
Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material fortificado, material control,
material ensayo de aptitud: Para este fin, se debe medir un analito de concentracin conocido y se
determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Una
diferencia sistemtica importante en relacin al valor de referencia aceptado se refleja en un mayor
valor del sesgo, cuanto ms pequeo es el sesgo, mayor veracidad indica el mtodo.
s= X -Xa
Donde:
s= sesgo
X = lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas.
Xa = valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado.
Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual el tobs < t crit:
t calc = [ Xa X]
S x n
Donde :
t calc= t observado o calculado
Xa = Valor esperado o valor certificado en concentracin
X= Promedio de valores ledos u observados en concentracin
S= Desviacin estndar
n= Nmero de lecturas o valores observados.
Buscar t- Student terico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridad
deseado ( 1-) para un error . Usualmente se trabaja con un valor de 0,05.
GUA TCNICA N 1
38
Resultado
mg/L
20,4
20,4-20,1
Sesgo
s
0,3
2
3
4
5
6
7
8
9
10
20,8
20,6
20,0
20,4
20,6
20,5
19,9
20,3
20,3
20,8-20,1
20,6-20,1
20,0-20,1
20,4-20,1
20,6-20,1
20,5-20,1
19,9-20,1
20,3-20,1
20,3-20,1
0,7
0,5
-0,1
0,3
0,5
0,4
-0,2
0,2
0,2
(X-Xa)
/2
80%
0.10
90%
0.05
95%
0.025
3.078
1.886
1.638
1.533
1.476
1.440
1.415
1.397
1.383
1.372
6.314
2.920
2.353
2.132
2.015
1.943
1.895
1.860
1.833
1.812
12.706
4.303
3.182
2.776
2.571
2.447
2.365
2.306
2.262
2.228
v
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A travs del ejercicio se puede observar que para la medicin de Nitritos en agua el sesgo obtenido
para el mtodo utilizado es aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable.
GUA TCNICA N 1
39
b) Recuperacin (R): Es la fraccin de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del
anlisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar.
La recuperacin permite ver el rendimiento de un mtodo analtico en cuanto al proceso de extraccin
y la cantidad del analito existente en la muestra original. Por lo cual, la recuperacin esta
intrnsecamente relacionada a las caractersticas de la matriz de la muestra.
Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres niveles. Se debe
considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de calibracin del mtodo, el LOD y el LMP
establecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor informacin posible
respecto a la capacidad de recuperacin del mtodo, en cuanto a estos valores criticos.
Se calcula de la siguiente manera:
R=
Ce Co
Ca
Siendo:
R= Recuperacin
Ce = es la concentracin de analito de la muestra enriquecida.
C0 = es la concentracin de analito medida en la muestra sin adicionar.
Ca = es la concentracin de analito adicionado a la muestra enriquecida.
Se puede igualmente expresar en porcentaje de recuperacin (%R): se calcula de la siguiente manera:
%R = [ R ] x 100
40
Si el tcalc tcrit (no hay diferencia estadsticamente significativa), no es necesario ninguna correccin.
El Criterio de aceptacin en base al valor obtenido para el porcentaje de recuperacin puede utilizarse
los criterios de AOAC. En caso de utilizar criterio de AOAC ( Ver Anexo III), se debe buscar en tabla de
acuerdo a la concentracin esperada del analito y si el % R obtenido de la experiencia analtica, se
encuentra dentro del rango de %R tericos esperados.
En caso que se cuente con un MRC utilizar el rango de aceptabilidad sealado en el certificado como
criterio de aceptabilidad. Es decir, el valor determinado analticamente deber encontrase dentro del
rango de tolerancia establecido a travs de certificado, es decir, del limite superior (LS) o limite inferior
(LI).
Cabe sealar que el Codex Alimentarius seala que existen directrices relativas a los intervalos previstos
de recuperacin en reas especficas de anlisis, como por ejemplo: Residuos de plaguicidas (RP) o
residuos de medicamentos veterinarios (RMV). En casos en los que se haya demostrado que la
recuperacin es una funcin de la matriz, podrn aplicarse otros requisitos especificados.
Co
Ca
Ce
0,1
15,0
15,0
0,993
99,3
2
3
0,0
0,1
15,0
15,0
14,0
13,0
0,933
93,3
86,0
0,1
15,0
0,0
15,0
0,2
15,0
%R
16,0
0,860
1,060
106,0
14,0
0,933
93,3
13,0
0,853
85,3
GUA TCNICA N 1
41
/2
80%
0.10
90%
0.05
95%
0.025
1
2
3
4
5
6
3.078
1.886
1.638
1.533
1.476
1.440
6.314
2.920
2.353
2.132
2.015
1.943
12.706
4.303
3.182
2.776
2.571
2.447
El t terico o critico es de 2,015, cumplindose que tcalc < t crit , ya que 0,315 < 2,571. Es decir no existen
diferencias significativas.
PRECISION: La precisin podr establecerse en trminos de repetibilidad y reproducibilidad. El
grado de precisin se expresa habitualmente en trminos de imprecisin y se calcula como
desviacin estndar de los resultados (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18 Ed.).
a)
b)
GUA TCNICA N 1
42
El Codex menciona que para coeficientes de concentracin < 10 , se aplica la teora de HorwitzThompson, esto es, CV = 22%.
T
Lectura
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
C obtenida
mg/kg
1,08
1,07
0,84
0,83
0,94
0,87
1,02
1,06
0,95
0,88
GUA TCNICA N 1
43
Fecha
C obtenida mg/L
da 1
1,08
da 1
1,07
da 2
1,00
da 3
1,10
da 4
0,99
da 5
1,00
da 6
1,02
da 8
1,05
da 8
1,06
10
da 8
1,09
GUA TCNICA N 1
44
ROBUSTEZ
La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analtico de no ser afectado por
variaciones pequeas pero deliberadas de los parmetros del mtodo; proporciona una indicacin de la
fiabilidad del procedimiento en un uso normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es
optimizar el mtodo analtico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo que
condiciones analticas ( incluidas sus tolerancias), se pueden obtener a travs de este resultados
confiables.
Un mtodo de ensayo es ms robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una
modificacin de las condiciones analticas.
Entre las condiciones analticas que podran afectar a un mtodo se encuentran:
Analistas
Equipos
Reactivos
pH
temperatura.
Tiempo de reaccin.
Estabilidad de la muestra.
Otros.
Para esta determinacin se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluacin de la robustez de un
mtodo qumico analtico. Este procedimiento permite evaluar el efecto de siete variables con slo
ocho anlisis de una muestra.
Para proceder a realizar el estudio de robustez se deben identificar aquellos factores del mtodo que
posiblemente afectaran los resultados finales obtenidos a travs de este.
Estas factores estn presentes habitualmente en el mtodo (ejemplo: temperatura, composicin de
fase mvil o soluciones reactivas, pH de solucin, tamao de celda espectrofotomtrica, flujo gas
carrier, split, etc.). Para estudiar la robustez se procede a exponer a cada factor a un estudio de
variable, es decir se expone a una variacin respecto de la establecida en el mtodo, es decir, cada
variable se estudia mediante un valor alto (A, B,...,G) y otro bajo (a,b,...,g). Una vez establecidos estos
valores se disean ocho pruebas de ensayo como, por ejemplo, muestra la tabla N 3.
Los factores a estudiar no deben ser necesariamente siete; puede considerarse un nmero menor de
variables. Esto no afectar el balance del diseo del experimento, pero es importante considerar que
siempre se den llevar a cabo los ocho pruebas de ensayo indicado.
Los resultados de la experiencia analtica obtenidos con las variaciones realizadas en estas 8 pruebas se
representan con las letras s hasta la z.
GUA TCNICA N 1
45
A partir de los resultados puede calcularse el efecto de cada una de las variables haciendo la media de
los cuatro anlisis que contienen la variable en su valor ms alto (mayscula) y aquellas que
corresponden al valor ms bajo (minscula). As, para evaluar el efecto de la primera variable obsrvese
que:
(s + t +u +v) = 4A = A
4
4
(w + x + y +z) = 4a = a
4
4
Es decir, la media de los resultados (s + t + u + v) equivalen a A porque las seis restantes variables
presentes en estos cuatro resultados se anulan entre s como consecuencia de que existen siempre dos
maysculas y dos minsculas de cada variable. Anlogamente, la media de los resultados (w + x + y + z)
equivalen a a.
Para cualquier otra variable se puede proceder de manera similar, tal como muestra la tabla siguiente:
Tabla N 3: Prueba de Robustez de Younden y Steiner
Valor de la
condicin
variable
A,a
B,b
C,c
D.d
E,e
F,f
G,g
ANALISIS
1
A
B
C
D
E
F
G
A
B
c
D
e
f
g
A
B
C
d
E
f
g
A
b
c
d
e
F
G
a
B
C
d
e
F
g
a
b
c
d
E
f
G
a
b
C
D
e
f
G
a
b
c
D
E
F
g
RESULTADOS
Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de mayor
valor versus la de menor valor:
( X-x ) < 2 S.
GUA TCNICA N 1
46
Una informacin adicional de este test de Youden es que la desviacin estndar de los resultados s a z
constituye una medida excelente de la imprecisin previsible del mtodo cuando se utiliza para el
anlisis de rutina, ya que este procedimiento introduce deliberadamente el tipo de variacin en las
variables que puede esperarse que ocurra durante el empleo normal del mtodo.
Ejemplo: Robustez para turbiedad.
CONDICIN VARIABLE
Valor
Tipo
Clave
Alto X
Temperatura, C
A,a
22
Cubeta, tipo
B,b
1
ANALISIS
Valor
Bajo x
15
2
1
22
1
2
22
1
3
22
2
4
22
2
5
15
1
6
15
1
7
15
2
8
15
2
C,c
60
30
60
30
60
30
60
30
60
30
D,d
E,e
F,f
G,g
30
si
30
1
0
no
25
0
30
si
30
1
s
30
no
25
0
t
0
si
25
0
u
0
no
30
1
v
0
no
30
0
w
0
si
25
1
x
30
no
25
1
y
30
si
30
0
z
RESULTADOS (NTU)
Resultados
Promedio X Promedio x
Diferencia
(X-x)
Comparacin
< 2 DS
A
B
C
D
E
F
a
b
c
d
e
f
21,0
21,3
21,3
20,6
21,4
21,2
21,6
21,3
21,3
22,0
21,2
21,4
0,525
0,075
0,075
1,325
0,125
0,175
21,1
21,5
GUA TCNICA N 1
No Sensible a Variable
No Sensible a Variable
No Sensible a Variable
Sensible a Variable
No Sensible a Variable
No Sensible a Variable
47
S: 0,813
2 S: 1,150
Por lo tanto las variables sensibles, no debern modificarse las variables que se establecieron como
sensibles en el estudio de robustez, y se deber mantener el valor nominal establecido en el mtodo,
para dicha condicin.
GUA TCNICA N 1
48
APLICABILIDAD
Se utiliza el trmino de Aplicabilidad, cuando un mtodo de anlisis puede utilizarse satisfactoriamente
para los analitos, matrices y concentraciones previstas. La declaracin de aplicabilidad (o mbito de
aplicacin), adems de una declaracin del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor,
puede incluir tambin advertencias acerca de la interferencia conocida de otros analitos, o de la
inaplicabilidad a determinadas matrices y situaciones.
Es decir, la aplicabilidad consiste en una declaracin de las especificaciones del rendimiento del
mtodo, que se entrega en el informe de validacin y que normalmente incluye la siguiente
informacin:
La identidad de la sustancia analizada, incluyendo en su caso, de especiacin (por ejemplo, "el
arsnico total",metil-mercurio).
El intervalo de concentraciones cubierto por la validacin (por ejemplo, "0-50 ppm")
Una especificacin de la gama de las matrices del material de prueba cubierto por la validacin (por
ejemplo,"marisco", productos lcteos, etc.).
La aplicacin prevista y de sus requisitos de incertidumbre crticos. (ejemplo: anlisis de residuos de
plaguicidas en frutas ctricas de acuerdo al reglamento sanitario de alimentos).
En este sentido, la prueba de aplicabilidad, consiste en el mbito de aplicacin del mtodo declarado
por el responsable de la validacin, una vez concluida esta.
En aquellos casos que se trate de un mtodo normalizado u oficializado, esta declaracin se realiza de
acuerdo a los antecedentes bibliogrficos o normativos del mtodo.
GUA TCNICA N 1
49
V: INCERTIDUMBRE
La incertidumbre de una medicin es el parmetro asociado al resultado, es decir, caracteriza la
dispersin de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al mesurando.
En este sentido, es importante que para un mtodo validado o verificado por el laboratorio, se realice
la determinacin de las diferentes fuentes o componentes de la incertidumbre de la medicin
presentes:
a) Muestreo
b) Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, etc.
c) Sesgos Instrumentales: Las debidas a las caractersticas de los equipos utilizados para realizar las
medidas tales como: deriva, resolucin, magnitudes de influencia. Ejemplo: temperatura
d) Pureza de Reactivos: materiales de referencia, preparacin de estndares.
e) Analista: Las debidas a la serie de mediciones: variaciones en observaciones repetidas bajo
condiciones aparentemente iguales. Ejemplo: paralelaje
f) Condiciones de medicin: Las debidas al certificado de calibracin: en l se establecen las
correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un valor de k determinado, en las condiciones
de calibracin. Ejemplo: material volumtrico, etc.
g) Condiciones de medicin: temperatura, humedad, etc.
h) Otras: Mtodo (por ejemplo al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo las constantes), pesada,
alcuota, efectos computacionales, etc.
Generalmente para el anlisis de las fuentes de incertidumbre se utiliza el diagrama de espina de
pescado u otro tipo de diseo esquemtico que permita con facilidad identificar las fuentes de
incertidumbre presentes durante el proceso analtico. Ejemplo:
GUA TCNICA N 1
50
Para este fin el laboratorio deber realizar una evaluacin de las incertidumbres tipo A y B que
estn presentes en el mtodo:
Evaluacin de incertidumbre tipo A: Evaluacin de un componente por un anlisis estadstico de los
valores de mediciones obtenidos en condiciones de medicin definidas. Ejemplo: realizar varias
mediciones en condiciones de repetibilidad.
Evaluacin de incertidumbre tipo B: Evaluacin de un componente incertidumbre de la medicin
realizada por otros medios distinto a los del tipo A. Ejemplos: La evaluacin basada en la informacin,
obtenidos a partir de un certificado de calibracin, obtenidos a partir de los lmites deducirse a travs
de personal la experiencia, etc.
En general, la incertidumbre esta dada por los errores sistemticos y aleatorios presentes en el ensayo
analtico.
GUA TCNICA N 1
51
GUA TCNICA N 1
52
GUA TCNICA N 1
53
VI: ANEXOS
ANEXO N 1:
PLAN DE VALIDACION
N:_____
1) Alcance de la validacin:
Mtodo:
Analito:
Matrices:
Requerimientos del mtodo:
Tipo: Validacin retrospectiva
Validacin prospectiva
Verificacin
Procedimiento de validacin:
2) Diseo experimental:
[Sealar Matrices de las muestras:, Testigos reactivos, Blanco matriz, Material de
referencia y/o Material de referencia certificado, Muestras fortificadas y niveles de
fortificacin.
Indicar las prueba(s) y parmetro(s) de validacin a evaluar, nmero de anlisis
requeridos segn prueba(s) y criterios de aceptabilidad para cada parmetro de
validacin
Sealar analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analtica(s) y Fecha(s)
programadas]
pgina x de y
GUA TCNICA N 1
54
Firma
Fecha Elaboracin
Nombre:
Cargo:
Pgina x de y
GUA TCNICA N 1
55
ANEXO N 2:
N Validacin:__________
Soluciones estndares y/o patrones involucrados: (Nombre, marca, modelo, nmero de identificacin,
concentraciones, etc.)
Material de Referencia: (Nombre, marca, cdigo de identificacin, valores asignadas, unidades, etc.)
Material de Referencia Certificado: (Nombre, marca, Cd. identificacin, N certificado, valores asignadas, unidades,
trazabilidad , etc.)
pgina x de y
GUA TCNICA N 1
56
PARMETROS DE VALIDACIN
Pruebas realizadas:
Selectividad
Linealidad
Exactitud: Veracidad
Robustez
Otros:
Sensibilidad
Precisin
Lmites
Tipo de calibracin:
Calibracin externa
Calibracin en matriz
Ecuacin recta:
Valor obtenido
Intervalos de confianza :
ICm mx.:
min.:
ICLo mx.:
min.:
Criterio de Aceptabilidad
Rango Lineal:
Coeficiente de Correlacin ():
Comentarios:
Sensibilidad
Descripcin : (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Valor obtenido
Criterio de Aceptabilidad
pendiente, m :
Concentracin caracterstica:
Comentarios:
pgina x de y
GUA TCNICA N 1
57
Limites:
Descripcin
Criterio de Aceptabilidad
SELECTIVIDAD
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Valor obtenido (unidades)
Longitud de onda (mx.)
Longitud de onda (em)/ (ex)
Masa monitoreada
Transicion(es) monitoreda (s)
% Falsos positivos
% Falsos negativos
Interferencia(s) Conocida(s):
Criterio de Aceptabilidad
Correccin(es) a Interferencias:
Comentarios:
EXACTITUD
Precisin
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Precisin en condiciones de Repetibilidad
Nivel/concentracin (unidades)
Criterio de Aceptabilidad
SD r
% CV r
Comentarios:
pgina x de y
GUA TCNICA N 1
58
Comentarios:
Criterio de Aceptabilidad
Veracidad
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Valor obtenido (unidades)
Criterio de Aceptabilidad
Lectura obtenida, X
Sesgo, s:
t-Student, t:
Comentarios:
Reproducibilidad
Nivel/concentracin (unidades)
%R
tobs
Criterio(s) de Aceptabilidad
Comentarios:
pgina x de y
GUA TCNICA N 1
59
ROBUSTEZ
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
A,a
B,b
(X-x)
Variables
D.d
C,c
Resultados
w
E,e
F,f
G,g
S sz
Criterio de Aceptabilidad
A,a
B,b
C,c
D.d
E,e
F,f
G,g
APLICABILIDAD
(Declaracin del campo de aplicacin del mtodo: analito, rango de trabajo, unidades, matrices y advertencias acerca de la interferencia
conocida en las cuales se ha demostrado la validacin).
ANEXOS
(Anexar al presente informe los documentos necesarios para respaldar la informacin, los registros o reportes entregados por el equipo y copia
de la planillas de clculos generadas en el proceso analtico):
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Revisado por:
Firma
Fecha
Validacin:
Nombre:
Aceptada
Cargo:
Rechazada
OBSERVACIONES
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------pgina x de y
GUA TCNICA N 1
60
ANEXO N 3:
/2
80%
90%
95%
98%
99%
0.10
0.05
0.025
0,01
0,0015
90%
95%
97.5%
99%
99,5%
0.10
0.05
0.025
0,01
0,0015
3.078
1.886
1.638
1.533
1.476
1.440
1.415
1.397
1.383
1.372
1.363
1.356
1.350
1.345
1.341
1.337
1.333
1.330
1.328
1.325
1.323
1.321
1.319
1.318
1.316
1.315
1.314
1.313
1.311
1.310
1.303
1.296
1.289
1.282
6.314
2.920
2.353
2.132
2.015
1.943
1.895
1.860
1.833
1.812
1.796
1.782
1.771
1.761
1.753
1.746
1.740
1.734
1.729
1.725
1.721
1.717
1.714
1.711
1.708
1.706
1.703
1.701
1.699
1.697
1.684
1.671
1.658
1.645
12.706
4.303
3.182
2.776
2.571
2.447
2.365
2.306
2.262
2.228
2.201
2.179
2.160
2.145
2.131
2.120
2.110
2.101
2.093
2.086
2.080
2.074
2.069
2.064
2.060
2.056
2.052
2.048
2.045
2.042
2.021
2.000
1.980
1.960
31.821
6.965
4.541
3.747
3.365
3.143
2.998
2.896
2.821
2.764
2.718
2.681
2.650
2.624
2.602
2.583
2.567
2.552
2.539
2.528
2.518
2.508
2.500
2.492
2.485
2.479
2.473
2.467
2.462
2.457
2.423
2.390
2.358
2.326
63.657
9.925
5.841
4.604
4.032
3.707
3.499
3.355
3.250
3.169
3.106
3.055
3.012
2.977
2.947
2.921
2.898
2.878
2.861
2.845
2.831
2.819
2.807
2.797
2.787
2.779
2.771
2.763
2.756
2.750
2.704
2.660
2.617
2.576
v
1 cola
v
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
40
60
120
GUA TCNICA N 1
61
ANEXO N 4:
TABLA F
F DISTRIBUCIN (= 0,05)
Grados de libertad del numerador
F crtico
10
20
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316 241.88193
2
18.51276 19.00003 19.16419 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474 19.39588
10.12796
9.55208
9.27662
9.11717
9.01343
8.94067
8.88673
8.84523
8.81232
8.78549
7.70865
6.94428
6.59139
6.38823
6.25607
6.16313
6.09421
6.04103
5.99880
5.96435
6.60788
5.78615
5.40945
5.19216
5.05034
4.95029
4.87586
4.81833
4.77246
4.73506
5.98737
5.14325
4.75706
4.53369
4.38737
4.28386
4.20667
4.14681
4.09901
4.05996
5.59146
4.73742
4.34683
4.12031
3.97152
3.86598
3.78705
3.72572
3.67667
3.63653
5.31764
4.45897
4.06618
3.83785
3.68750
3.58058
3.50046
3.43810
3.38812
3.34717
5.11736
4.25649
3.86254
3.63309
3.48166
3.37376
3.29274
3.22959
3.17890
3.13727
10
4.96459
4.10282
3.70827
3.47805
3.32584
3.21718
3.13547
3.07166
3.02038
2.97824
11
4.84434
3.98231
3.58743
3.35669
3.20388
3.09461
3.01233
2.94798
2.89622
2.85362
12
4.74722
3.88529
3.49030
3.25916
3.10587
2.99612
2.91335
2.84857
2.79638
2.75339
13
4.66719
3.80557
3.41053
3.17912
3.02543
2.91527
2.83210
2.76691
2.71436
2.67102
14
4.60011
3.73889
3.34389
3.11225
2.95825
2.84773
2.76420
2.69867
2.64579
2.60216
15
4.54307
3.68232
3.28738
3.05557
2.90130
2.79046
2.70663
2.64080
2.58763
2.54371
16
4.49400
3.63372
3.23887
3.00692
2.85241
2.74131
2.65720
2.59109
2.53767
2.49351
17
4.45132
3.59154
3.19677
2.96471
2.81000
2.69866
2.61430
2.54796
2.49429
2.44992
18
4.41386
3.55456
3.15991
2.92775
2.77285
2.66130
2.57672
2.51016
2.45628
2.41170
19
4.38075
3.52189
3.12735
2.89511
2.74006
2.62832
2.54354
2.47677
2.42270
2.37793
20
4.35125
3.49283
3.09839
2.86608
2.71089
2.59898
2.51401
2.44707
2.39282
2.34787
21
4.32479
3.46679
3.07247
2.84010
2.68478
2.57271
2.48758
2.42046
2.36605
2.32095
22
4.30094
3.44336
3.04912
2.81671
2.66127
2.54906
2.46377
2.39650
2.34193
2.29669
23
4.27934
3.42213
3.02800
2.79554
2.64
2.52766
2.44223
2.37481
2.32011
2.27472
24
4.25968
3.40283
3.00879
2.77629
2.62065
2.50819
2.42263
2.35508
2.30024
2.25474
25
4.24170
3.38520
2.99124
2.75871
2.60299
2.49041
2.40473
2.33706
2.28210
2.23648
26
4.22520
3.36901
2.97516
2.74260
2.58679
2.47411
2.38831
2.32053
2.26545
2.21972
27
4.21001
3.35413
2.96035
2.72777
2.57189
2.45911
2.37321
2.30531
2.25013
2.20430
28
4.19598
3.34039
2.94668
2.71407
2.55812
2.44526
2.35926
2.29127
2.23598
2.19004
29
4.18297
3.32766
2.93403
2.70140
2.54538
2.43244
2.34634
2.27825
2.22288
2.17685
30
4.17089
3.31583
2.92228
2.68963
2.53355
2.42052
2.33435
2.26616
2.21070
2.16458
GUA TCNICA N 1
62
ANEXO N 4:
TABLA DE % DE RECUPERACION
ANALITO
UNIDAD
100
100%
98 102
10
10%
98 102
1%
97 - 103
0,1
0,10%
95 105
0,01
100 ppm
90 107
0,001
10 ppm
80 110
0,0001
1 ppm
80 110
0,00001
100 ppb
80 110
0,000001
10 ppb
60 115
0,0000001
1 ppb
40 120
GUA TCNICA N 1
63
ANEXO N 5:
TABLA DE HORWITZ
CONCENTRACIN
REPETIBILIDAD
CV%r
REPRODUCIBILIDAD INTERNA
CV%R
1 ppt
1 / 1012
1,00E-12
64,0
85,3
10 ppt
10 / 1012 1,00E-11
45,3
60,3
100 ppt
32,0
42,7
1 ppb
1 / 109
1,00E-09
22,6
30,2
10 ppb
10 / 109
1,00E-08
16,0
21,3
100 ppb
11,3
15,1
1 ppm
1 / 106
1,00E-06
8,00
10,7
10 ppm
10 / 106
1,00E-05
5,66
7,54
100 ppm
4,00
5,33
2,83
3,77
1%
1 / 102
1,00E-02
2,00
2,67
10%
10 / 102
1,00E-01
1,41
1,89
GUA TCNICA N 1
64
65
VI: BIBLIOGRAFA
1. Aguirre L, et al. Validacin de mtodos analticos, Asociacin Espaola de Farmacuticos de
Industria, Barcelona, 2001, parte II
9. M. Thompson, S.L.R. Ellison and R. Wood. Harmonized Guidelines For SingleLaboratory Validation Of Methods Of Analysis Pure Appl. Chem., 74, (5) 835 855
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11. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/CITAC Guide CG4.
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12. Validacin de Mtodos de anlisis qumicos Procedimiento NMKL No. 4 (1996). Versin
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GUA TCNICA N 1
66
_____________________________________________________________________
GUA TCNICA N 1
67
Comit Editor: Boris Duffau, Fabiola Rojas, Isabel Guerrero, Luis Roa, Luis Rodrguez, Marcelo Soto, Marisol Aguilera,
Soraya Sandoval.
Coordinacin Edicin: Soraya Sandoval