cavtruco & Enzimas: cinética e inhibicién Los enzimas son proteinas especializadas en la catalisis de las reacciones bioldgicas. Se encuentran entre las mas notables de las biomoléculas conocidas debido a su extraordinaria es- pecificidad y a su poder catalitico, que es mucho mayor que la de los catalizadores hechos por el hombre. Gran parte de Ja historia de la bioquimica es la historia de la investigacién de los enzimas. El nombre enzima («en la levadura») no se empleé hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biolégicos intervenian en la fermentaci6n del aziicar para formar alcohol (de aqui el nombre inicial de «fermentos»). La primera teoria general sobre la catalisis quimica, publicada por J. J. Berzelius en 1835, incluia un ejemplo de lo que ahora se conoce como enzima, Ja diastasa de la malta, y sefialaba que la hidrélisis del almi- dén se cataliza por la diastasa con mas eficacia que por el cido sulfirico. Aunque Luis Pasteur reconocié que la fermentacién es ca- talizada por enzimas, postulé en 1860 que éstos se hallaban ee ligados de modo inextricable con la estructura y Ia vida de las Cristales de quimotripsina bovina células de la levadura. Constituy6, por ello, un logro impor- tante en la historia de la investigacién enzimatica que, en 1897, E. Biichner consiguiera extraer los enzimas que catalizan la fermentacién alcohdlica de las células de levadura. Este hecho demostraba claramente que estos importantes enzimas, que catalizan una ruta metabélica principial productora de energia, pueden actuar independientemente de la estructura celular. Hasta muchos afios después, sin embargo, no fue ais- lado por vez primera un enzima en forma cristalina; ello lo consiguié J. B. Sumner, en 1926, con la ureasa, aislada de extractos de la alubia Cannavalia enzyformis. Sumner demostr6 que los cristales se hallaban constituidos por proteina y Ileg6 a la conclusi6n, contraria a la opinién que prevalecia por aquel entonces, de que los enzimas son proteinas. Sus puntos de vista no fueron aceptados inmediatamente, sin embargo, y hasta el petiodo comprendido entre 1930 y 1936, durante el cual Northrop aislé la pepsina cristalizada, la tripsina y la quimotripsina (fig. 8-1), no quedé bien establecida la natu- raleza proteica de los enzimas.-En la actualidad se han identi- ficado cerca de 2000 enzimas diferentes. Muchos de ellos se han aislado en forma pura y homogénea, y alrededor de unos M. Kunite 189PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS 200 se han podido cristalizar. Aunque se han identificadd la mayor parte de los enzimas relacionados con el metabolismo basico corriente de la célula quedan por resolver muchos pro- blemas importantes, entre ellos el control genético de la sin- tesis enzimatica, los mecanismos moleculares mediante los que se regula la actividad enzimatica y el papel de las formas miltiples de algunos enzimas en el desarrollo y en la diferen- ciacién, Pero sobre todo, todavia no se conoce en términos moleculares, cémo catalizan los enzimas Jas reacciones qui- micas con tal eficacia, precisién y especificidad. En este capitulo y el siguiente no se hard ningtin intento para catalogar y describir el gran néimero de enzimas dife- rentes conocidos hasta la fecha; se examinaran mas bien las propiedades y caracteristicas comunes a la mayor parte de los enzimas. Los enzimas especificos que participan en diversos ciclos metabélicos se estudiaran, mas detalladamente en capi- tulos sucesivos. Nomenclatura y clasificacién de los enzimas Muchos enzimas han sido designados afiadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, de la molécula sobre la cual el enzima ejerce su accién catalitica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrélisis de la urea con produccién de amoniaco y CO, la arginasa cataliza la hidrélisis de la arginina a ornitina y urea, y la fosfatasa cataliza la hidrélisis de los ésteres fos- foricos, Esta nomenclatura, sin embargo, no siempre ha resul- tado practica, lo cual ha ocasionado que muchos enzimas hayan recibido nombres que quimicamente son poco informa- tivos; por ejemplo, la pepsina, Ia tripsina, y la catalasa, Por dicha razén, y porque el niimero de enzimas que se descubren esté aumentando rapidamente, se ha adoptado una clasifica~ cién sistematica de los enzimas segan recomendacién de una comisién internacional de enzimas. E] nuevo sistema divide a los enzimas en seis clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases, de acuerdo con el tipo de reac- cién catalizada (tabla 8-1). Cada enzima es designado por un nombre recomendado, generalmente corto y apropiado para st uso habitual; por un nombre sistemético, que identifica la raccién que cataliza, y por un numero de clasificacién, que se emplea cuando se precisa la identificacién inequivoca del enzima, tal como ocurre en las revistas internacionales de in- vestigacién, en los restimenes y en los indices. Se da como ejemplo, el enzima que cataliza la reaccién ATP + creatina = ADP + fosfocreatina El nombre recomendado de este enzima, el que se emplea normalmente, es creatin-quinasa y el nombre sistematico, que se basa en la reacci6n catalizada, es ATP: creatin-fosfotrans- ferasa. Su niimero de clasificaci6n es EC 2.7.3.2, en donde EC significa, abreviadamente, Comisi6n de Enzimas; la pri- mera cifra (2) representa el nombre de la clase (transferasas), la segunda cifra (7) representa a la subclase (fosfotransfera- sas), la tercera cifra (3) la sub-subclase (fosfotransferasas con un grupo nitrégeno como aceptor) y la cuarta cifra (2) designa a la creatin-quinasa (véase tabla 8-1). En este libro utilizare- mos los nombres recomendados de los enzimas, tal como se 190 ‘Trbta 8-1. Clasificacién internacio- nal de los enzimas (denominaciones de las clases, mimeros de cédigo y tipos de reacciones catalizadas) 1. Oxido-reductasas (Reacciones de 6xido-reduccién) 1 Actdan sobre YoH—OH \ 1.2 Actéan sobre & =O \ 1.3 Actéan sobre c=CH— A 1 Actian sobre oH —NH, 15 Actéan sobre YoH—NH— 1.6 Acttan sobre NADH; NADPH 2. Transferasas (Transferencia de grupos funcio- nales) 2.1 Grupos de un atomo de carbono 2.2. Grupos aldehidicos 0 ceténicos 23 Grupos acilos 24 Grupos glucosilo 2.7 Grupos fosfato 2.8 Grupos que contienen azufre 3, Hidrolasas Reacciones de hidrélisis) 3.1 Bsteres 32 Enlaces glucosidicos 34 Enlaces peptidicos 35 Otros enlaces C_N 3.6 Anhidridos de acido 4. Liasas : (Adicién a Jos dobles enlaces) Vee” 41 Yomcl 42 Sc A cas 5. Isomerasas (Reacciones de isomerizacién) 5.1 Racemasas 6. Ligasas (Formacién de enlaces con escisién del ATP) 61.C-O 62 C-S 63 C-N 64 C-CTapia 8-2. Algunos de los enzimas que contienen iones metélicos 0 los necesitan como cofactores. Za Alcobol-deshidrogenasa Anhidrasa-carbénica Carboxipeptidasa Mg* Fosfohidrolasas Fosfotransferasas Mn* Arginasa Fosfotransferasas Fe o Fe Citocromos Peroxidasa Catalasa Ferredoxina Cu (Cu) ‘Tirosinasa Citocromo-oxidasa Ke Piruvato-quinasa (también necesita Mg") ‘Nav ATPasa de la membrana plas- matica (necesita también K* y Mg”) Capitulo 8 Enzimas: cinética ¢ inhibicion hallan catalogados en la edicién de Enzyme Nomenclature, 1973 (véase Bibliografia), salvo unas pocas excepciones. Cofactores enzimaticos La actividad de algunos enzimas depende solamente de su estructura como proteinas, mientras que otros necesitan, ade- mas uno o mas componentes no proteicos, llamados cofac- tores. El cofactor puede ser un ion metalico, o bien una mo- Iécula organica llamada coenzima; algunos enzimas necesitan de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor, mientras que muchas proteinas enzimaticas pierden la actividad por calefaccién. El complejo enzima-cofactor cata- liticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteina restante, que por si misma es inactiva cataliticamente, se designa con el nombre de apoenzima, Ta tabla 8-2 retine algunos enzimas que precisan de iones metélicos como cofactores. En tales enzimas el ion metélico puede actuar como: 1) centro catalitico primario; 2) como grupo-puente para reunir el sustrato y el enzima, formando un complejo de coordinacién; 0 3) como agente estabilizante de la conformacién de la proteina enzimatica en su forma cataliticamente activa. Los enzimas que precisan de iones me- talicos se Ilaman a veces metaloenzimas; en algunos de ellos, el componente metélico, por si solo, ya posee una actividad catalitica primaria, muy incrementada a su vez por la proteina enzimatica; por ejemplo, la catalasa, es un enzima ferro- porfirinico que cataliza la descomposicién muy rapida del peréxido de hidrégeno, en agua y oxigeno; las simples sales de hierro también catalizan esta reaccién, pero a velocidad mucho menor. La’ tabla 8-3 redne los principales coenzimas conocidos y losAipos de reacciones enzimaticas en las que participan. Cada ye de los coenzimas catalogados contiene, como parte de su structura, una molécula de alguna de las vitaminas; éstas son sustancias organicas que, en cantidades minimas (trazas), son vitales para la funcién de todas las células, y deben figu- rar en la dieta de algunas especies. Las vitaminas y sus formas coenzimaticas seran objeto de estudio en el capitulo 13 (pa- gina 341), Los coenzimas actiian, por lo general, como trans- ‘Tapa 8-3, Coenzimas de reacciones de transferencia de grupos. Coenzima Entidad teansferida Nicotinamida-adenina-dinuclestido Fosfato de nicotinamida-adenina-dinu- clestido Atomos de hidrégeno (electrones) Flavin-mononuclestido Atomos de hidrégeno (electrones) Flavin-adenina-dinuclestido Atomos de hidrégeno (electrones) Atomos de hidrégeno (electrones) Coenzima Q. Atomos de hidrégeno (electrones) Pirofosfato de tiamina Aldehidos Coenzima A Grupos acilo Lipoamida Grupos acilo Coenzimas cobamidicos Grupos alquilo Biocitina Didxido de carbono Fosfato de piridoxal Coenzimas tetrahidrofélicos Grupos amino Grupos metilo, metileno, formilo 0 formimino 191PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS portadores intermediarios de grupos funcionales, de atomos especificos o de electrones, los cuales son transferidos en la reaccién enzimatica global. Cuando el coenzima se halla unido intimamente a la molécula del enzima recibe, normalmente, el nombre de grupo prostético; por ejemplo, el grupo biocitina de la acetil-CoA-carboxilasa, que se halla incorporado cova- Ientemente en la cadena polipeptidica (pag. 351). Sin embargo, en algunos casos el coenzima esta unido débilmente y actia, esencialmente, como uno de los sustratos especificos de aquel enzima, Cinética quimica Antes de proceder a examinar la catélisis enzimatica de las reacciones, deben esbozarse algunas relaciones y términos em- pleados para la medicién y expresién de las velocidades de las teacciones quimicas, Las reacciones quimicas pueden clasifi- carse basandose en el niimero de moléculas que en total deben reaccionar pata formar los productos de la reaccién. Asi ten- dremos reacciones monomoleculares, bimoleculares y trimo- leculares, en las que reaccionan una, dos o tres moléculas, respectivamente, Las reacciones quimicas pueden clasificarse también sobre Ficura 8-2 una base cinética, por el orden de reaccién. Tendremos, de _—_Representacién gréfica del curso de una este modo, reacciones de orden cero, de primer orden, de se- _reaceién de primer orden. El tiempo medio gundo orden y de tercer orden, segtin como resulte influida _{(74).e+ ¢/ necesario para que se consuma la velocidad de reaccién por la concentracién de los reaccio- _reaccionante nantes bajo un conjunto de condiciones determinado. Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad exactamente proporcional a la concentra- cién de un reaccionante (fig. 8-2). El ejemplo mas sencillo es cuando la velocidad de la reaccién Pendiente de la tangente —aAL dt A—>P es exactamente proporcional a la concentracién de A. En este caso la velocidad de reaccién en cualquier tiempo ¢ viene dada por la ecuacién de primer orden ty —a[A] wat 7 MAT en la que [A] es la concentracién molar de A y —d[A]/dt es la velocidad a que disminuye la concentracién de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad 0 velocidad de reaccién especifica. Las constan- tes de velocidad de primer orden poseen las dimensiones del reciproco del tiempo habitualmente s-, La forma integrada de esta ecuacién, que es mas util para Ja realizacién de cAlculos cinéticos, es tog [A] —_#t [A] en la que [As] es la concentracién de A al tiempo cero, y [A] es la concentracién al tiempo t. En las reacciones de primer orden, el tiempo mitad (2) de la reaccién viene dado por 0,693 ha =e 192Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion relacién que se deduce facilmente. Obsérvese que en las reac ciones de primer orden, el tiempo mitad es independiente de la concentracién inicial del sustrato. Reacciones de segundo orden son aquéllas cuya velocidad es proporcional al producto de la concentracién de dos reac- cionantes o a la segunda potencia de uno de los reaccionantes. El ejemplo mas sencillo es la reaccién A+B—>P La velocidad de esta reaccién que puede ser designada como —(d[A]/dt), —(4[B]/dt) 0 +(d[P]/dt), es proporcional al producto de las concentraciones de A y de B, y viene dada por la ecuacién de velocidad de segundo orden HAL = aca) en la que k es la constante de velocidad de segundo orden. Si la ‘reaccién tiene la forma 2A—>P y su velocidad es proporcional al producto de la concentracién de las dos moléculas reaccionantes, la ecuacién de velocidad de segundo ‘orden es aa] = K{AJIA) = Kia? Las constantes de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen las dimensiones 1/[concentraci6n x tiempo], 0 M+ s+, La forma integrada de la expresién de segundo orden es 2,303 log IBoLAL *~ifAel = TBD 18 TAB] en donde [Aq] y [By] son las concentraciones iniciales y [A] y [B] las concentraciones en el tiempo t. En las reacciones de segundo orden, cuyas concentraciones de los reaccionantes son iguales, el tiempo mitad es igual a 1/Cok, en donde Cy es la concentracién inicial de los reaccio- nantes y k la constante de velocidad de segundo orden. Es importante observar que una reaccién de segundo orden, tal como A+B—>P puede parecer, en ciertas condiciones, una reaccién de primer orden. Por ejemplo, si la concentracién de B es muy elevada, y la de A muy baja, esta reaccién podria parecer como, de primer orden, ya que su velocidad seria casi proporcional a la concentracién de uno sélo de los reactivos; reacciones de seudoprimer orden © de primer orden aparente. Las reacciones de tercer orden, que son relativamente esca- sas, son aquéllas cuya velocidad es proporcional al producto de tres términos de concentracién. Algunas reacciones qui- micas son independientes de la concentracién de cualquier reactivo; son las llamadas reacciones de orden cero. Muchas 193PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CHLULAS reacciones catalizadas son de orden cero con respecto a los reactantes. Cuando es éste el caso, la velocidad de reaccién depende de la concentracién del catalizador o de algin otro factor distinto a la concentracién de las especies moleculares que experimentan la reaccién. Las velocidades de reaccién no es preciso que sean necesariamente de primer orden puro o de segundo orden puro; en ciertas condiciones se observan con frecuencia ordenes de reaccién mixtos. Energia libre de activacién y efectos de los catalizadores Una reaccién quimica, tal como A —> P, tiene lugar porque cierta fraccién de la poblacién de moléculas A, en cualquier instante dado, posee la suficiente energia como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transicién, en el que es muy elevada la probabilidad de que se establezca 0 se rom- pa un enlace. quimico para formar el producto P. Este estado de transicién reside en la cima de la barrera de energia que separa a los reaccionantes y a los productos (fig. 8-3). La velocidad de una reaccién quimica dada es proporcional a la concentracién de estas especies caracteristicas del estado de transicion. La energia libre de activacién AG? (el simbolo + se emplea para representar el proceso de activacién) es la cantidad de energia necesaria para llevar todas las moléculas de 1 mol de sustancia a una temperatura determinada, al estado de transici6n, en la cima de la barrera de activacién. Hay dos métodos generales, mediante los cuales, puede acelerarse la velocidad de una reaccién quimica. Uno de ellos es la elevacién de la temperatura, ya que provoca un incre- Ficura 83 rama de energia para una reaccién quimica, no catalizada y catalizada. Estado de transicion Bergin libre de activacién de la reaccién inversa (a0 catalizada) Energia libre de activacion de la reaccién inversa (catalizada) Energia libre de activacién de Ta reaccion directa: (no catalizada) Energia libre ——> Estado inicial Cambio! lobal de Energia libre al ike i de activacién : dela reaccién catalizada Estado final Curso de la reaccién ——> 194‘Tata 8-4. Energia libre de activacién AG* calculada para Ja descomposicién del peréxido de hidrégeno a 20°C. La catalasa acelera la velocidad de Ja reaccion mas de 10° veces. aG* Condiciones keal mo! Sin catalizar 18 Catalizada con platino coloidal 13 Catalizada por catalasa 7 Figura 8-4 Efecto de la concentracién de! susteato sobre la velocidad de una reaccién catalizada enziméticamente. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion mento del movimiento térmico y de la energia, aumenta el niimero de moléculas capaces de alcanzar el estado de tran- sicién, y acelera, de este modo, la velocidad de las reacciones quimicas. En muchas reacciones la velocidad de reaccién se duplica, aproximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura. La velocidad de una reaccién qui- mica puede verse incrementada también por la adicién de un catalizador; éste se combina con los reaccionan- tes de modo transitorio y se produce un estado de transicién de menor energia de activacién que el correspondiente a la reaccién no catalizada. Asi los catalizadores aceleran las reac- ciones quimicas porque disminuyen la energia de activacién (fig. 8-3). Cuando se forman los productos de la reaccién se regenera el catalizador libre. La tabla 8-4 muestra la energia de activacién para la descomposicién del peréxido de hidré- geno, en ausencia o en presencia de un catalizador. Cinética de las reacciones catalizadas por los enzimas. Ecuacién de Michaelis-Menten Los principios generales de la cinética de las reacciones qui- micas son aplicables a las reacciones catalizadas por los en- zimas, pero éstas muestran también un rasgo caracteristico, que no se observa en las reacciones no enzimaticas: la satu- racién con el sustrato. En la figura 8-4 vemos el efecto de la concentracién del sustrato sobre la velocidad de la reacci6n catalizada por un enzima A —+» P. A una concentracién de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccién vp es casi proporcional a la concentracién del sustrato y la reaccién, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracién de sus- trato aumenta, Ja velocidad inicial de la reaccién disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentra- cién de sustrato; en esta zona el orden de reaccién es mixto. Con un aumento posterior de la concentracién del sustrato, la velocidad de la reaccién Ilega a ser esencialmente indepen- diente de la concentracién de sustrato y se aproxima asinté- ticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reaccién es esencialmente de or- den cero con respecto al sustrato, y se dice entonces que el enzima se halla saturado con su sustrato. Todos los enzimas muestran el efecto de saturacién, pero varian ampliamente con respecto a la concentracién de sustrato que se necesita para que se manifieste. El efecto de saturacién condujo a algunos Ku [Sustrato] 195,