TRABAJO FIN DE CARRERA

CONTROL BIOLGICO DE Fusarium

oxysporum f. sp. melonis RAZA 1.2 CON
ANTAGONISTAS.

ALUMNA: RAQUEL SOBRINO RUBIO.

DIRECTORES DEL PROYECTO:

- M LUISA SORIANO MARTN
- ANDRS PORRAS PIEDRA

FECHA DE PRESENTACIN: MAYO 2005.



2
IMPORTANCIA ECONMICA DEL
CULTIVO DEL MELN
PRODUCCIN EN
ESPAA DE 1 MILLN
DE TONELADAS

SUPERFICIE:
-75% CULTIVOS AL
AIRE LIBRE
-25% CULTIVOS
PROTEGIDOS

EN CLM90% EN
CIUDAD REAL

3
INTRODUCCIN A LA FUSARIOSIS
VASCULAR DEL MELN
condiciones de desarrollo ~20 C.
primeros trabajos sobre el estado sanitario
de los melonares de Levante y Murcia en
1976.
en 1985 se describe la micosis en cultivos
bajo plstico en Almera.
4
DIFICULTAD DE CONTROL DE LA
FUSARIOSIS VASCULAR
enfermedad muy virulenta.

reduccin de la produccin hasta un
90% .

5
INTRODUCCIN AL CONTROL
BIOLGICO
VENTAJAS

respetuoso con el medio
ambiente

no existen problemas de
intoxicaciones

no crea resistencia

eliminacin casi completa
de la utilizacin de
productos fitosanitarios
INCONVENIENTES

ignorancia sobre su
utilizacin

falta de apoyo econmico

falta de personal
especializado

enemigos naturales
susceptibles a productos
fitosanitarios

6
INTRODUCCIN A LOS
MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS
1. ocurre con frecuencia en la naturaleza.

2. interaccin continua entre patgenos
potenciales y sus antagonistas.
-equilibrio dinmico en la superficie del suelo-

3. microorganismos antagonistas:
- BACTERIAS: Bacillus y Pseudomonas
- HONGOS: Trichoderma y Micorrizas
Arbusculares
7
MECANISMOS DE ACCIN DE LOS
ANTAGONISTAS
Competencia: debe existir escasez de un elemento. La
competencia ms comn es por nutrientes, oxgeno o espacio.

Interaccin directa con el patgeno:
-Parasitismo: un microorganismo parasita a otro.

- Predacin: el antagonista se alimenta de materia orgnica
entre la cual ocasionalmente se encuentra el patgeno.

Antibiosis y lisis: inhibicin del crecimiento de un
organismo por la accin de una sustancia producida por otro
organismo.
8
OBJETIVOS
1. ESTUDIAR EL POSIBLE ANTAGONISMO FRENTE A
Fom MEDIANTE ENFRENTAMIENTO DUAL IN VITRO

2. DETERMINAR LA EFICACIA DE LOS ORGANISMOS
SELECCIONADOS EN EL CONTROL BIOLGICO DE
Fom RAZA 1.2 EN PLNTULAS DE MELN

3. DETERMINAR LA EFICACIA DE LA COLONIZACIN DE
LAS RACES DE LAS PLNTULAS DE MELN CON
MICORRIZAS VESCULO-ARBUSCULARES EN EL
CONTROL BIOLGICO DE Fom.
MATERIALES
Y
MTODOS
10
ANTAGONISTAS UTILIZADOS EN EL
CONTROL BIOLGICO

Trichoderma harzianum
Aspergillus A5, Aspergillus A8, Aspergillus
terreus, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus
Penicillum sp
Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens
Bacillus subtilis

Fusarium oxysporum no patognicos
Glomus mosseae, Glomus intraradices, Glomus
claroideum

11
MATERIAL VEGETAL Y
PATGENO

SEMILLAS DE MELN DEL CULTIVAR
AMARILLO CANARIO F1 HBRIDO.

Fusarium oxysporum f. sp. melonis
RAZA 1.2 AISLADO CR 6801
12
PRODUCCIN DE INCULO DEL
PATGENO
REPICADO DE Fom EN
PDA.

- repicado del patgeno en
placas de petri con PDA.

- estufa: 252 C, 7 das.

REPICADO DE Fom EN
CPD.

-explante en matraz
erlenmeyer.
-agitador orbital (120
rpm), 25-27C, 16 horas
luz, 6 das.
-filtrado del hongo.
-cuantificacin de la
densidad del inculo.
-ajuste de la concentracin
de inculo.

13
CULTIVO DUAL IN VITRO
CULTIVO DUAL consiste en el enfrentamiento
del patgeno y el antagonista en una placa de
petri, analizando el crecimiento de ambos que se
compara con el crecimiento individual de cada
uno de ellos.

SEPARACIN:
- 7 cm (HONGOS)
- 5 cm (BACTERIAS)

ENSAYO: 3 PLACAS DE PETRI, 4 REPETICIONES
TESTIGOS DE PATGENO
TESTIGOS DE ANTAGONISTA

14
CULTIVO DUAL DE Fom Raza 1.2
CON Trichoderma harzianum
pequea cantidad del preparado de T.
harzianum con pinzas esterilizadas en
una placa de petri con PDA.
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom y T. harzianum.
placa de petri en estufa (27C).
mediciones del dimetro de las colonias
cada 48 horas.
15
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Aspergillus A5, Aspergillus A8 y
Penicillum sp.

repicado de los hongos de la placa original
en PDA.
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom con Aspergillus y
Penicillum.
placa de petri en estufa (27C).
mediciones del dimetro de las colonias
cada 48 horas.
16
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2
CON Aspergillus terreus, A. flavus y A.
ochraceus.
recuperacin de los hongos
liofilizados.
enfrentamiento de explantes de 5
mm de dimetro de Fom y
Aspergillus.
placa de petri en estufa (27C).
mediciones del dimetro de las
colonias cada 48 horas.
17
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2 CON
Pseudomonas fluorescens y
Pseudomonas putida.
1. recuperacin de las bacterias liofilizadas.
2. ensayo en: PDA y AGAR NUTRITIVO
3. enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom y Pseudomonas en Agar
Nutritivo (separacin de 5 cm).
4. placa de petri en estufa (27C)
5. mediciones del dimetro de las colonias cada
48 horas
18
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2
CON Bacillus subtilis.
ENSAYO EN PDA

- ENFRENTAMIENTO DE
EXPLANTES DE 5 mm DE
DIMETRO DE Fom Y Bacillus
subtilis EN PDA (SEPARACIN
DE 5 CM).

- PLACA DE PETRI EN ESTUFA
(27C)

- MEDICIONES DEL DIMETRO
DE LAS COLONIAS CADA 48
HORAS.


ENSAYO CONTENIENDO EXUDADO DE
Bacillus subtilis.

- ENSAYO CON EXUDADOS DE Bacillus
subtilis.
- 5 EXPLANTES DE 5 mm.
- MATRAZ ERLENMEYER CON CPD.
- AGITADOR ORBITAL (120 rpm, 7 DAS,
TOTAL OSCURIDAD, TEMPERATURA
AMBIENTE).
- COMPROBACIN DEL CRECIMIENTO.
- SE AADE AGAR.
- EXPLANTE DE Fom.
- COMPROBACIN DEL DIMETRO DE LA
COLONIA DE FOM CADA 48 HORAS.


19
CULTIVO DUAL DE Fom RAZA 1.2
CON Fo NO PATOGNICO
repicado de los hongos de la placa original
en PDA
enfrentamiento de explantes de 5 mm de
dimetro de Fom con Fo NO PATOGNICO.
placa de petri en estufa (27C)
mediciones del dimetro de las colonias
cada 48 horas

CONTROL BIOLGICO
IN VIVO
21
PRODUCCIN DE Trichoderma
harzianum
DETERMINACIN DE LA
DENSIDAD DE INCULO DEL
PREPARADO COMERCIAL
MTODO DE LAS
DILUCIONES

- PDA CON NYSTANINA AL 1%.
- DILUCIN DEL PREPARADO
COMERCIAL EN 9 ml DE AGUA.
- DILUCIONES EN 6 VIALES.
- PLACAS DE PETRI EN ESTUFA (27C)
- OBSERVACIN DE PLACAS CADA 12
HORAS.




22
PRODUCCIN DE Aspergillus A5
repicado del hongo en PDA en placa de petri con
PDA (7 das,25-27C, oscuridad)

repicado del hongo en CPD
- 5 explantes de 5mm de dimetro en matraz de
CPD
- agitador orbital 120 rpm en cmara de
crecimiento (6 das, 25-27C, 16 horas de luz)

filtrado del hongo

cuantificacin de la densidad de inculo

ajuste de la concentracin de inculo

23
GERMINACIN DE SEMILLAS DE
MELN
germinacin en placas de petri
- capa de vermiculita
- disco papel secante esterilizado
- semillas
- disco de papel secante esterilizado

cmara de crecimiento (3 das, 25-
27C, 16 horas luz)

plantacin en vasos de plstico
perforados en la base o bandejas de
alvolos

Etiquetan y enumeran con el
antagonista utilizado.

cmara de crecimiento (12 das)

24
APLICACIN DE LOS ANTAGONISTAS
AL SUBSTRATO
CADA ENSAYO:

- 40 plntulas (4 repeticiones de 10 plntulas cada
una)
- 10 plntulas testigos antagonistas (control +)
- 10 plntulas testigo con inculo del patgeno
(control -)
- 10 plntulas testigo sin tratar (control )

SUBTRATO ESTRIL Y SUBTRATO NO ESTRIL
25
SUBSTRATO
El substrato estril se utiliza para observar el
comportamiento de los microorganismos
antagonistas y Fom sin que se encuentre
sometido a la accin de otros microorganismos
que se puedan hallar en el substrato (bacterias,
hongos, etc.).

Los ensayos en substrato no estril se realizan
para observar el comportamiento de los
microorganismos antagonistas y Fom en las
condiciones en las que se encontraran las
plntulas de meln en el invernadero.
26
TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
Trichoderma harzianum
Ensayos:
a) dosis 55 gr/kg de
substrato
b) dosis 27.5 gr/kg de
substrato
Mezclar de forma
homognea
Vasos de plstico
perforados
Bandejas de alvolos
Semilla germinada de
meln
Cmara de crecimiento
27
TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
Aspergillus A5
Suspensin condica
concentracin 10
7

conidias/ml
En 100 ml de
substrato se aaden
10 ml de suspensin
condica
Mezcla homognea
Semilla germinada de
meln
Cmara de
crecimiento
28
TRATAMIENTO DEL SUBSTRATO CON
MICORRIZAS
En 150 ml de
substrato se aade
una cucharilla de
caf rasa del
preparado
micorrzico
Semilla de meln
germinada
Cmara de
crecimiento
29
INOCULACIN DE LAS PLNTULAS DE
MELN CON EL PATGENO

Suspensin de 5 x 10
5
conidias/ml
de Fom Raza 1.2

Se aaden 10 ml de suspensin a
cada vaso que contiene las plntulas
de meln.

Cmara de crecimiento
30
REAISLAMIENTO DEL
PATGENO EN PDA.
REAISLAMIENTO
siembra en PDA de
fragmentos de raz,
cuello y tallo
(desinfestados) para
comprobar si el
patgeno ha sido
capaz de colonizar el
sistema vascular de
las plantas tratadas
con antagonistas e
inoculadas con Fom
31
CLCULO DEL PORCENTAJE DE
MICORRIZACIN DE LAS RACES DE LAS
PLNTULAS DE MELN TRATADAS CON
MICORRIZAS ARBUSCULARES.
A los 30 das del tratamiento.
3 plantas por ensayo
Lavado de races
Fragmentos de 2-3 cm
Decoloracin de races con KOH al
10%, temperatura ambiente
Lavado y acidificacin con CLH
0.1N durante 30 minutos.
Tincin con Azul Tripn (4 horas)
Intervalos de 15 min, lavado con
agua
Colocacin de fragmentos en un
porta-objetos de forma paralela

Con el microscopio se realizan
observaciones verticales en el
porta-objetos tomando como
referencia una distancia
constante de 0.2 mm, y se
anotan en 100 intersecciones si
estn o no micorrizadas.
32
EVALUACIN DE LA INCIDENCIA Y
SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD
ESCALA DE SEVERIDAD

0 0% PLANTA SANA

1 0-10% SNTOMAS LEVES

2 10-50% SNTOMAS
SEVEROS

3 50-75% SNTOMAS MUY
SEVEROS

4 >75% PLANTA MUERTA

RESULTADOS
34
1. RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO
DUAL IN VITRO
Finalizacin del ensayo:

- Unin fsica entre las colonias de
antagonista y patgeno
- Halo de separacin constante
durante varias mediciones

35
RESULTADO DEL ENFRENTAMIENTO
DUAL IN VITRO
Halo de inhibicin entre el patgeno y
Aspergillus A5
36
DETERMINACIN DE LA DENSIDAD DE
INCULO DEL PREPARADO COMERCIAL
DE Trichoderma harzianum
conteo a las 48 horas de
realizarse las diluciones
- incontables
- placas dilucin -6
contables

resultado total 16.6 x 10
7

u.f.c en el paquete original
de Trichoderma harzianum
37
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO

0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESPUS DE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Trichoderma harzianum Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad
tras infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando
como antagonista Trichoderma
harzianum dosis 55 g/kg substrato
estril.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Trichoderma harzianum Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
55 g/Kg substrato no estril.
38
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO

0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Trichoderma harzianum Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando
como antagonista Trichoderma harzianum
dosis 55 g/kg substrato estril
(transplante).
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Trichoderma harzianum Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
27.5 g/kg substrato estril.
39
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO

0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESPUES DE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Trichoderma harzianum Tesigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores medios
del ensayo utilizando como antagonista
Trichoderma harzianum dosis 27.5 g/Kg
substrato no estril.
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Trichoderma harzianum dosis
27.5 g/Kg substrato estril, transplante.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Trichoderma harzianum Testigo Fom
40
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO

0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Aspergillus A-5 Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno
(testigo control -) y comparacin con los
valores medios del ensayo utilizando como
antagonista Aspergillus A-5.
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Glomus mosseae Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Glomus mosseae.
41
RESULTADO DEL CONTROL BIOLGICO
IN VIVO

0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Glomus intraradices Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como
antagonista Glomus intraradices
0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Glomus claroideum Testigo Fom
Curva de progreso de la enfermedad tras
infectar las plantas con el patgeno (testigo
control -) y comparacin con los valores
medios del ensayo utilizando como antagonista
Glomus claroideum.
42
RESULTADO DEL REAISLAMIENTO
DEL PATGENO EN PDA
En todas las pruebas de aislamiento se dio positivo
en cuanto a infestacin de las plantas por Fusarium
oxysporum f. sp. Melonis.
Reaislamiento del patgeno en PDA de
plantas tratadas con Glomus intraradices
Reaislamiento del patgeno de planta tratada
con Trichoderma harzianum utilizando la
dosis recomendada (substrato no estril)
43
REAISLAMIENTO DEL
PATGENO EN PDA

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
R C TB TM TA
55 gr/kg (SE) 55 gr/kg (SNE) 27,5 gr/kr (SE) 27,5 gr/kg (SNE)
Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes
de plantas tratadas con distintas dosis de
Trichoderma harzianum, en substrato estril (SE)
y no estril (SNE), procedentes de explantes de
raz (R), cuello (C), tallo bajo (TB), tallo medio
(TM) y tallo alto (TA).
44
REAISLAMIENTO DEL
PATGENO EN PDA

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
R C TB TM TA
Glomus mosseae Glomus intraradices Glomus claroideum
Porcentajes de reaislamiento de Fom en explantes de
plantas tratadas con Micorrizas Arbusculares, en sustrato
estril (SE), procedentes de explantes de raz (R), cuello
(C), tallo bajo (TB), tallo medio (TM) y tallo alto (TA).
45


3. RESULTADO DEL CLCULO DEL PORCENTAJE
DE MICORRIZACIN DE LAS RACES DE LAS
PLNTULAS DE MELN TRATADAS CON M.A.


Los porcentajes de raz
micorrizada obtenidos
son los siguientes:

- Glomus intraradices:
1012 %
- Glomus mosseae:
1041 %
- Glomus claroideum:
1023 %
Resultado del clculo del porcentaje
de micorrizacin de las races de las
plntulas de meln tratadas con
micorrizas.

0
5
10
15
20
P
O
R
C
E
N
T
A
J
E

D
E

M
I
C
O
R
R
I
Z
A
C
I

N
Glomus mosseae Glomus intraradices Glomus claroideum
46
RESULTADO DEL CLCULO DEL PORCENTAJE DE
MICORRIZACIN DE LAS RACES DE LAS
PLNTULAS DE MELN TRATADAS CON M.A.

Observacin de la micorriza por el microscopio,
donde se aprecian vesculas dentro de la raz.
47
4. DISCUSIN DE LOS RESULTADOS
Comparativa de las diferentes curvas de progreso de
la enfermedad de los ensayos realizados

0
1
2
3
4
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
N DE DAS DESDE LA INOCULACIN

N
D
I
C
E

D
E

S
E
V
E
R
I
D
A
D
Trichoderma harzianum 55 g/kg Substrato estril
Trichoderma harzianum 55 g/kg Substrato no estril
Trichoderma harzianum 55g/kg de substrato( transplante)
Trichoderma harzianum 27,5 g/kg Substrato estril
Trichoderma harzianum 27,5g/kg de substrato no estril
Trichoderma harzianum 27,5 g/kg Substrato estril (transplante)
Aspergillus spp. Substrato estril
Glomus mosseae Substrato estril
Glomus intraradices Substrato estril
Glomus Claroideum Substrato estril
Testigos de Fusarium oxysporum f. sp. melonis ( substrato estril)
48
DISCUSIN DE LOS RESULTADOS
En los diferentes ensayos realizados, se ha
podido observar que las plntulas de meln
tratadas con Trichoderma harzianum (55 gr/kg
substrato estril) y Glomus claroideum, han
conseguido retardar el proceso de infeccin del
patgeno Fom raza 1.2 en 8 das, siendo la
media de los dems ensayos de 5,8 das.

Se ha comprobado de igual forma que tras el
reaislamiento del patgeno en PDA en todos los
ensayos realizados, ste se ha desplazado de
forma sistmica por toda la plntula produciendo
la muerte.
49
5. RESULTADO DEL ANLISIS
ESTADSTICO

ANOVA Table: En los ensayos realizados
no hubo diferencias significativas entre las
variables, con un 95% de nivel de
confianza.

MULTIPLE RANGE TESTS: En los ensayos
realizados no hubo diferencias
significativas entre los pares de datos, con
un 95% de nivel de confianza.
50
CONCLUSIONES
Los microorganismos que han resultado demostrar
su eficacia antagonista ante el patgeno Fusarium
oxysporum f. sp. melonis raza 1.2 en el control
biolgico in vitro tras realizarse los experimentos
han sido: Trichoderma harzianum y Aspergillus A-
5.


En los ensayos realizados, se ha comprobado que
la inoculacin con Trichoderma harzianum
(empleando la dosis de 55 gr/kg como 27.5 gr/kg)
estimul el crecimiento de las plntulas de meln.

51
CONCLUSIONES
Ningn hongo o bacteria que se ha utilizado en
este proyecto ha dado como resultado un control
total de Fusarium oxysporum f. sp. melonis, si
bien se ha demostrado que los hongos
Trichoderma harzianum (dosis 55 gr/Kg de
substrato estril) y Glomus claroideum ha
retardado la aparicin de los sntomas del hongo
patgeno sobre las plntulas que se han tratado.

Los porcentajes de micorrizacin de las races de
las plntulas de meln tratadas con Micorrizas
Arbusculares (MA) han sido bajos, alrededor de
un 10 %, debido a esto su eficacia como
microorganismo antagonista no ha sido efectivo
FINAL
PRESENTACIN