TINCIN DE GRAM

UNIVERSIDAD NACIONAL
DEL SANTA
MICROBIOLOGIA
DOCENTE: ETERIO ALVA MUOZ
ALUMNO: SALDAA OLGUN MARLON

MICROBIOLOGIA
1 Tincin de Gram
PRCTICA N1

INTRODUCCION
Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa, definida
por el tamao, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma
redondeada denominadas cocos, en forma cilndrica, denominadas bacilos y una
tercera morfologa como son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos.
A su vez cada categora puede subclasificarse con base a diferentes arreglos.
Estas caractersticas pueden determinarse examinando muestras al microscopio. Las
clulas no teidas son prcticamente transparentes, pero pueden observarse al
microscopio de luz haciendo preparaciones entre lmina y laminilla o con
microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro.
Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teir las bacterias para
facilitar su visualizacin. Si se tie una muestra del cultivo extendida y fijada en una
lmina portaobjeto con un colorante dado, las clulas adquirirn el color del colorante
aadido y podr observarse la forma, tamao y el arreglo de las mismas. Este tipo de
coloracin se conoce con el nombre de coloracin simple.
Para obtener mayor informacin sobre la morfologa y composicin qumica de las
bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de varios
reactivos y stas pueden diferenciarse con base al color que retienen. Ej. Tincin de
Gram y Tincin de Ziehl Neelsen.
OBJETIVOS
1. Comprender la base terica y qumica de los procedimientos de tincin diferencial.
2. Conocer la base qumica de la tincin de Gram.
3. El procedimiento para diferenciar entre dos grupos principales de bacterias:
Grampositivas y Gram-negativas.
PRINCIPIO
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que se
aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tincin
primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a todas las clulas.
Con el objetivo de establecer un contraste de color, el segundo reactivo usado es un
agente decolorante, el cual puede decolorar la clula completa o solo parte de ella. El

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reactivo final, el colorante de contraste, le da a las clulas decoloradas un color que
contrasta con el del colorante primario. El colorante de contraste no puede ser
absorbido por clulas que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos
de clulas o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin
del colorante que es absorbido.
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la tincin
de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo
divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-
positivas. Esto es esencial para la clasificacin y diferenciacin de microorganismos.
La reaccin a la tincin de Gram est basada en la diferencia en la
composicin qumica de la pared celular bacteriana. Las bacterias
Grampositivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o murena, mientras que
esta capa es ms fina en las Gram-negativas y est rodeada por una bicapa lipdica
externa. El Peptidoglicano es un polisacrido formado por dos subunidades
qumicas, N-acetilglucosamina y cido Nacetilmurmico.

MATERIALES
MATERIAL BIOLGICO Y REACTIVOS:

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Cultivos: cultivos de 24 horas en agar nutritivo en tubo inclinado de
Escherichia coli, Micrococcus
luteus, Bacillus megaterium yRhodospirillum rubrum.
Reactivos: Cristal violeta, Yodo de Gram, Alcohol Etlico 95%, Safranina.
MATERIAL NO BIOLGICO:
Mechero de alcohol, asa de siembra, cubeta de tincin, portaobjetos, papel de
absorcin, papel de lentes, aceite de inmersin, y microscopio.
PROCEDIMIENTO
1. Obtenga 5 portaobjetos limpios.
2. Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos y, en el quinto portaobjetos
prepare un frotis de una mezcla de Micrococcus luteusy Eschericha coli. Para
preparar los frotis se sigue el siguiente procedimiento:
a. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio.
Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra,
ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua,
que es suficiente.
b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones aspticas, una
pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de
agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin
homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Nota: Si la
muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos
primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el
portaobjetos.
c. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando
el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha
precaucin de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden
deformarse o romperse.
d. Para preparar el frotis de la mezcla Eschericia coli-Micrococcus luteus,
coloque una gota de agua en el portaobjetos, y luego transfiriendo cada
organismo separadamente a la gota de agua usando un asa de siembra
esterilizada y enfriada. Mezcle ambos microorganismos haciendo movimientos
circulares con el asa.

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3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor.
4. Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que acte durante 1
minuto.
5. Lave suavemente con agua.
6. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar durante 1
minuto.
7. Lave suavemente con agua.
8. Decolore con alcohol etlico al 95%. Nota: no sobredecolore, agregue el
alcohol gota a gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.
9. Lave suavemente con agua.
10. Agregue la safranina para la tincin de contraste.
11. Lave suavemente con agua.
12. Seque la preparacin.
13. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de aceite.

RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1. Mencione 2 maneras de cmo se realiza la fijacin de la muestra.
2. Explique el fundamento de la coloracin de Gram.
3. Explique la funcin del lugol y en qu favorece a la coloracin.
4. Si usted pudiera elegir entre alcohol y alcohol-acetona cul elegira?
5. Qu otros colorantes de contraste se podra utilizar.
6. Porque la necesidad de utilizar el objetivo de inmersin.
7. Porqu en algunos procedimientos varan los tiempos de exposicin a colorantes.


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BIBLIOGRAFIA

Gua prctica: Introduccin al control de calidad de la leche cruda. 2003.
Universidad de Zulia. Facultad de Ciencias Veterinarias. Ctedra de ciencia y
tecnologa de la leche. Maracaibo. Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/materialdeapoyoparapruebasde
plataforma_1693.pdf