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Manual de Laboratorio para El Analisis Del Semen PDF
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Expresin del resultado del recuento
El resultado final se da con dos cifras significativas: si es menor de 10 se da el nmero entero con
un decimal; si es igual o mayor de 10 slo se da el nmero entero.
El manual de la OMS establece el valor conocido como lmite inferior de referencia para la
concentracin y para el contaje total de espermatozoides como sigue.
o Nmero total: 39 millones de espermatozoides / eyaculado. (33-46).
o Concentracin: 15 millones de espermatozoides / ml (12-16).
Ejemplo para la valoracin del recuento:
o Supongamos que en la primera valoracin en el microscopio a 400x, entre porta y
cubre 22x22, y 10 l de semen, se observan 170 espermatozoides.
o Tendremos que realizar una dilucin al 1/20. En la cmara de Neubauer improved
contamos 205 spz en la 1 subcmara y en la 2 253 spz, la diferencia mxima
permitida para la suma (458) es 42, inferior a la obtenida (48); el recuento no es
vlido.
o Habremos de preparar otro par de diluciones al 1/20 y volver a contar en Neubauer.
Ahora en la 1 subcmara tenemos 215 spz y en la 2 232 spz, la diferencia permitida
para el total (447) es 41, por tanto, es vlido el recuento.
o Supongamos que hemos necesitado contar 2 filas de la rejilla 5 en la 1 subcmara y 3
filas de la rejilla 5 en la 2 subcmara; un total de 5 filas. Ahora tendremos que aplicar
la frmula C = (N spz/n filas) x (1/20 l) x Factor dilucin.
Estudio bsico del espermiograma
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MTODO 400X
Porta + cubre 22x22 Neubauer improved
MUESTRA 10 l semen
50 l semen + 950 l dil. Weigman
1
Dil.
2
Dil.
3
Dilucin
4
Dilucin
RECUENTO 170 spz/campo
1 1 Subcmara 205
2 Subcmara 253
Suma 458
Diferencia 48
Valoracin No vlido
2 1 Subcmara 215
2 Subcmara 232
Suma 447
Diferencia 17
Valoracin Vlido
Clculo C = (447/5)x(1/20)x20
= 89 millones spz / ml
4.1.1. Criptozoospermias y azoospermias
El nuevo manual de la OMS dedica una especial atencin al anlisis de la concentracin
espermtica cuando el nmero de espermatozoides es extremadamente bajo.
o Se conoce como Criptozoospermia cuando no hay espermatozoides en el eyaculado
pero s son observados tras centrifugacin.
o Y Azoospermia cuando hay ausencia de espermatozoides, incluso tras usar un mtodo
de anlisis validado.
Hay que ser especialmente cuidadoso a la hora de discriminar entre criptozoospermia y
azoospermia ya que la orientacin teraputica cambia radicalmente.
o Una muestra con criptozoospermia suele ser vlida para realizar la tcnica de
reproduccin asistida ICSI.
o Sin embargo, la nica posibilidad de poder realizar esa tcnica en un paciente con
azoospermia es recurrir a una biopsia de testculo. Tras tratamiento de la pieza
biopsiada se estudia la existencia o no de espermatozoides, que tras ser aislados nos
servirn para nuestra tcnica de ICSI.
En teora slo seran candidatas a biopsia de testculo y posterior ICSI las azoospermias
obstructivas. Sin embargo la popularizacin de la tcnica de biopsia de testculo ha demostrado
que en la mayora de azoospermias secretoras existen algunos focos de tbulos seminferos con
espermatognesis funcional y por tanto estos pacientes son tratados como si fuera una
azoospermia obstructiva.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
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En las azoospermias con volumen seminal muy bajo hay que descartar la existencia de una
eyaculacin retrgrada. En este caso los espermatozoides eyaculados en lugar de seguir la va
habitual son vertidos a la vejiga a travs del orificio uretrovesical. Es importante conocerlo
porque la recuperacin de esos espermatozoides posibilita la realizacin de tcnicas de
reproduccin asistida.
La forma de tratar la muestra va a depender de:
o Si slo necesitamos saber si hay o no espermatozoides.
o Si tienen o no movilidad.
o Si la concentracin exacta es requerida.
Si slo necesitamos saber si hay o no espermatozoides
o Cuando el nmero de espermatozoides por campo sea menor de 4 (a 400x), desde un
punto de vista clnico es suficiente informar: concentracin <2 millones / ml.
o Cuando no se observen espermatozoides se ha de centrifugar la muestra:
o 1 ml de semen, 15 minutos a 500g de Fuerza Centrfuga Relativa (FCR). Esta
ltima se calcula as: FCR = 1,118 x 10
-5
x R x V
2
. Siendo R = Radio (en cm),
V = Velocidad (en revoluciones por minuto).
o Decantar el sobrenadante.
o Resuspender el sedimento en 50 l.
o Poner 10 l en porta y poner cubre 22x22.
o Observar a 200x todo el porta (484 campos).
o Si se observan espermatozoides catalogar como criptozoospermia.
o Al no centrifugar toda la muestra este no es un mtodo de cuantificacin. No se
excluye que pueda haber espermatozoides en el resto de la muestra.
Si tienen o no movilidad
A veces es importante saber si adems los espermatozoides son mviles. Por ejemplo si los
necesitamos para hacer una ICSI, en la cual slo trabajamos con espermatozoides mviles. Al
igual que en el caso anterior:
o Cuando el nmero de espermatozoides por campo sea menor de 4 (a 400x), desde un
punto de vista clnico es suficiente informar: concentracin <2 millones / ml.
o Cuando no se observen espermatozoides, en este caso no se pueden centrifugar
porque podra alterar la movilidad.
o Se pone 40 l en porta y se coloca un cubre 24x50.
o Hay que observar a 200 aumentos todo el porta (unos 1200 campos).
Estudio bsico del espermiograma
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Si la concentracin exacta es requerida
Podemos usar dos mtodos de trabajo:
o Cmara Neubauer, mtodo ya descrito. Doble dilucin con Weigman a y contaje.
o Si se cuentan <200 spz / subcmara:
Se ha de expresar: Resultado + Error del n spz asociado (>5%)
El error asociado se podr calcular mediante la frmula:
(
)
o Si se observan >0 y <25 spz / subcmara:
Si suponemos un error mximo admisible del 20%, sera necesario contar al
menos 25 espermatozoides, lo que supondran 27777 espermatozoides por
mililitro, y esa sera la sensibilidad del mtodo.
Se ha de expresar: El nmero de espermatozoides es demasiado bajo para
poder precisar la concentracin, ya que esta es menor que la sensibilidad del
mtodo empleado, que es de 27777 spz/ ml. Se informa por tanto que la
concentracin es menor de 27777 spz/ ml.
o Si se observan 0 espermatozoides:
El intervalo de confianza del 95% del valor 0 es 0 y 3,7, quiere esto decir que el
95% de las veces que contemos 0 el valor estar comprendido entre 0 y 3,7. El
error asociado a un contaje de 3,7 es el 52%. La concentracin de
espermatozoides cuando se cuentan 3,7 espermatozoides por el mtodo ya
descrito es 4100 spz/ ml.
Y se ha de expresar: No se observa ningn espermatozoide en la evaluacin
realizada. Sin embargo el nmero de espermatozoides medidos (0) lleva
asociado a un error de contaje alto, del 52% y un intervalo de confianza al 95%
entre 0 y 3,7. Significa esto que si la muestra es analizada 100 veces, 95 veces
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encontraremos valores comprendidos entre 0 y 3,7 espermatozoides. Por este
motivo aunque no hayamos observado ningn espermatozoide slo podemos
asegurar con una probabilidad del 95% que la concentracin es menor de
4100 spz/ ml (concentracin correspondiente a 3,7 spz).
o Mtodo de fluorescencia, en cmara Leja
La cmara Leja es desechable, est dividida en dos subcmaras, cada una de las cuales tiene
100 micras de profundidad y un volumen de 25000 nl.
Procedimiento
o Mezclar bien la muestra.
o Preparar dos alcuotas: 1 p. semen + 1 p. dilucin del fluorocromo Hoeschst 33342 en
formol.
o Llenar cada cmara del portaobjetos Leja con 25 l de las diluciones replicadas, una
rplica por cada cmara.
o Guardar la cmara horizontalmente durante 10-15 minutos en la oscuridad a
temperatura ambiente, en cmara hmeda.
o Examinar con ptica de fluorescencia a 250x.
o Contar al menos 200 spz en cada rplica.
o Anotar el nmero de espermatozoides y campos evaluados.
Clculo:
o Si se cuentan <200 spz / subcmara, se ha de expresar: Resultado + Error (>5%)
(
)
o Si se observan >0 y <25 spz / cmara:
Si suponemos un error mximo admisible del 20%, sera necesario contar al
menos 25 espermatozoides, lo que supondran 1000 espermatozoides por
mililitro, y esa sera la sensibilidad del mtodo.
Se expresar: El nmero de espermatozoides es demasiado bajo para poder
precisar la concentracin, ya que esta es menor que la sensibilidad del mtodo
Estudio bsico del espermiograma
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empleado, que es de 1000 spz/ ml. Se informa por tanto que la concentracin es
menor de 1000 spz/ ml.
o Si se observan 0 espermatozoides:
Y se expresar: No se observa ningn espermatozoide en la evaluacin
realizada. Sin embargo el nmero de espermatozoides medidos (0) lleva
asociado un error de contaje alto, del 52% y un intervalo de confianza al 95%
entre 0 y 3,7. Significa esto que si la muestra es analizada 100 veces, 95 veces
encontraremos valores comprendidos entre 0 y 3,7 espermatozoides. Por este
motivo aunque no hayamos observado ningn espermatozoide slo podemos
asegurar con una probabilidad del 95% que la concentracin es menor de 150
spz/ ml (concentracin correspondiente a 3,7 spz).
Morfologa 4.2
La clasificacin de normalidad de la OMS se basa en considerar un espermatozoide normal al
integrante de una subpoblacin de espermatozoides potencialmente fertilizadores
seleccionados naturalmente en el moco cervical.
Procedimiento para la morfologa
o Se ha de realizar por duplicado.
o Elegir dos portaobjetos y limpiarlos vigorosamente con papel por ambos lados.
Identificarlos.
o Hacer la extensin: con otro porta hacer un ngulo de unos 45 y tocando la gota
arrastrar en el sentido que marcan las flechas de la imagen. Hacerlo a una velocidad
tal que se tarde aproximadamente un segundo en hacer el arrastre de la gota sobre el
porta. Ilustracin 8A.
o Si la muestra es de baja concentracin (<2 millones / ml.):
o Centrifugar a 600g durante 10 minutos.
o Posteriormente resuspender el pellet.
o Depositar de 5-10 l de muestra bien homogenizada en el extremo del
portaobjetos.
o Se hace la extensin de igual manera que en la Ilustracin 8A.
o Se debe hacer constar en el informe en caso de haber centrifugado la muestra,
que esta manipulacin puede afectar a los resultados de la morfologa.
Es importante seguir las instrucciones precisas ya que un volumen de muestra
mayor producira una extensin con los espermatozoides menos separados
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dificultando la medida, y un ngulo superior a 45 producira una extensin ms
fina, al igual que si se aumenta la velocidad de la extensin.
o Si la muestra es viscosa se ha de tratar la muestra segn uno de los siguientes
mtodos:
o Diluir una alcuota de muestra de semen con igual volumen de solucin de
bromelina, incubar a 37C durante 10 minutos.
o O bien diluir una alcuota de entre 0,2-0,5 ml en 10 ml de solucin salina, como
PBS. Centrifugar a 800g durante 10 minutos. Obtener el pellet y resuspender en
unos 20-40 l.
o Despus del tratamiento, hacer una extensin usando una pipeta pasteur, tal y
como se aprecia en la ilustracin 8B.
Ilustracin 8. Tcnica para realizar una extensin de semen. A) En muestras de
viscosidad normal, se utiliza un porta a 45 para el arrastre de una gota en un
segundo ; B) En muestras viscosas, previamente tratadas, se emplea una pipeta
pasteur
o Secar al aire las extensiones. Se ha de ser consciente de los inconvenientes de este
paso:
o Se produce una deshidratacin menor que si la fijacin hubiera sido en hmedo.
o Se produce la expansin de las cabezas de los espermatozoides inmaduros.
o Se produce la prdida de la gota citoplasmtica osmticamente sensible.
o Proceder a alguno de los siguientes mtodos de tincin:
o Papanicolaou.
o Shorr.
o Diff-Quik. Muy fcil de usar y muy usada hoy en da:
- Solucin de fijacin: 15 segundos en solucin de Triarilmetano en Metanol o
1 hora en Metanol al 95%.
- Solucin de tincin 1, Xanthene acidfilo: 10 segundos.
- Solucin de tincin 2, Thiazine basfilo: 2-5 segundos.
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- Agua: 10-15 veces.
- Dejar secar.
o Observar al microscopio a 1000 aumentos.
o Se deben contar al menos 200 spz/porta.
Interpretacin de la morfologa
Un espermatozoide debe cumplir los siguientes criterios estrictos (Kruger) en cada una de sus
partes para considerarse normal. Ilustracin 9.
o Cabeza:
o Forma oval.
o Longitud 3,7-4,7 micras.
o Anchura 2,5-3,2 micras.
o Relacin longitud/anchura 1,3-1,8.
o Acrosmica 40-70% de la cabeza.
o Pieza intermedia:
o Anchura <1 micra.
o Longitud 1 y cabeza.
o Unin axial a la cabeza.
o Gotas de restos citoplasmticos <1/3 de la cabeza.
o Flagelo:
o Recto o no presentar angulaciones bruscas que sugieran rotura.
o Longitud 45 micras.
o Restos citoplasmticos:
o El rea de los restos citoplamsticos debe ser menor a 1/3 de la cabeza.
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Ilustracin 9. Clasificacin de los defectos morfolgicos de los espermatozoides
o Defectos especiales:
o Flagelos sueltos.
o Cabezas sueltas.
o Sndrome de globozoospermia: todos los flagelos carecen de acrosoma. Los
espermatozoides son incapaces de fertilizar ovocitos in vivo, debi a la
imposibilidad de penetrar a travs de sus envolturas. Como alternativa se
propone realizar la ICSI, microinyeccin intracitoplasmtica de espermatozides, y
usando inductores de la activacin tales como ionforos del calcio.
Los flagelos y cabezas sueltas no se cuentan (ilustracin 6B), al igual que en la
concentracin, sin embargo las cabezas sin acrosoma s estaran dentro de las
anormalidades de la cabeza. No obstante, la OMS hace una apreciacin sobre los
defectos especiales, y es que si estas anomalas son muy abundantes si se cuentan e
informan, en el caso de la globozoospermia habra que destacar este hecho, de tal
forma que no pase desapercibido para el clnico.
http://bit.ly/ThJ9p0
Aqu se puede descargar el 5 manual de la OMS (pginas 73-95: atlas de espermatozoides) y un
material didctico sobre Morfologa espermtica.
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Valoracin de la morfologa
Como en tcnicas anteriores, una vez obtenidos los resultados hay que evaluarlos utilizando la
tabla del intervalo de confianza del 95% para diferencias de dos porcentajes. Si el error es
mayor, no ser necesario repetir las dos preparaciones como en el caso de la concentracin,
pero s que se tendr que repetir el contaje de ambas.
El quinto manual de la OMS establece un valor para el lmite inferior de referencia para la
morfologa espermtica del 4%.
Vitalidad 4.3
El manual de la OMS sugiere que el test de vitalidad debe hacerse de forma rutinaria en todas las
muestras y considera que es obligatorio cuando la movilidad progresiva es menor del 40%.
Fundamento de las tcnicas para la vitalidad
El estudio de vitalidad lo podemos realizar usando diferentes tcnicas:
o Con colorantes supravitales: Eosina y Eosina/Nigrosina.
Se basa en que los colorantes no pueden atravesar una membrana plasmtica
estructuralmente intacta, de tal forma que un espermatozoide vivo ser aquel cuyo
ncleo no est teido de rojo; y en el caso de que la membrana est estructuralmente
daada ser atravesada por los colorantes, por lo que un espermatozoide muerto ser
aquel cuyo ncleo se tia de rojo.
o Test hipoosmticos.
Se fundamenta en estudiar la funcionalidad de la membrana plasmtica cuando est
situada en el medio hipoosmolar. Cuando la membrana est funcionalmente activa no
permite la salida de sustancias osmticamente activas y compensa el desequilibrio
osmtico captando agua, por lo que la membrana del espermatozoide se hincha y el
flagelo se riza. Se considera pues que un espermatozoide con la membrana hinchada
es un espermatozoide funcionalmente activo y por tanto vivo; sin embargo, si la
membrana no est funcionalmente activa permitir la salida de sustancias
osmticamente activas y no se hinchar, en este caso un espermatozoide se considera
no funcional.
Diversos estudios (Jeyendrn, 1984; Ramirez, 1992) han demostrado que no existe un alto grado
de correlacin entre test colorantes y test hipoosmticos ya que miden efectos caractersticos
diferentes de la membrana plasmtica. Por una parte los colorantes nos estaran midiendo el
estado estructural de la membrana plasmtica y el test hipoosmtico el estado funcional. Es por
eso que el resultado del test de colorantes siempre ha de ser superior al test hipoosmtico: un
espermatozoiode vivo, no teido con el colorante, podr tener el test hipoosmtico positivo o
negativo, ser funcional o no; pero un espermatozoide muerto debe tener el test hiposomtico
negativo siempre.
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4.3.1. Test de los colorantes supravitales
Tcnica de la Eosina
o Solucin de Eosina:
Eosina Y .......................... 0,67 g
ClNa ................................ 0,9 g
Agua ............................... 100 ml
Disolver la Eosina y ClNa en agua purificada y calentada.
o Procedimiento de la Eosina (hacer por duplicado):
o Mezclar 5 l de semen con 5 l de la solucin de eosina, en un portaobjetos.
o Cubrir con un cubreobjetos 22x22.
o Dejar la preparacin 30 segundos en reposo.
o Observar en microscopio de contraste de fases a 400 aumentos. Contar al menos
200 spz/porta.
Tcnica de la Eosina/Nigrosina
o Solucin Eosina/Nigrosina:
Nigrosina ........................ 10 g
Solucin Eosina ............... 100 ml
Mezclar la Nigrosina con la solucin Eosina, hervir, filtrar, enfriar y guardar en bote de
vidrio.
o Procedimiento de la Eosina/Nigrosina (hacer por duplicado):
o Se mezcla en un porta 50 l de semen y 50 de solucin Eosina/Nigrosina. Se
mezclan las dos gotas y se esperan 30 segundos.
o Se toma por capilaridad la dilucin de la muestra preparada y se hace una
extensin en un nuevo portaobjetos.
o Secar las muestras y observar las extensiones a 1000 aumentos. Contar al menos
200 spz/extensin.
o El test de de la Eosina/Nigrosina tiene dos ventajas:
o Permite un mejor contraste de la imagen, por lo que facilita la visualizacin de la
muestra.
o Al usarse una extensin fijada permite guardar y reevaluar la muestra.
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Interpretacin
Diferenciar un espermatozoide vivo de uno muerto es
bastante fcil con estas tcnicas:
o Los espermatozoides teidos corresponden a los
muertos.
o Los no teidos corresponde a los vivos. Si slo se tie
la zona del cuello o la cabeza tiene una ligera
coloracin rosa, se considera que el espermatozoide
est vivo.
Ilustracin 10. Ejemplo del test de vitalidad con Eosina/Nigrosina. A) Espermatozoide muerto,
teido; B) Espermatozoide vivo, ligeramente teido; C) Espermatozoide vivo, sin teir
4.3.2. Test hipoosmticos
Tcnica
o Solucin hipoosmtica: Citrato sdico y fructosa en agua.
o Procedimiento (por duplicado):
o Dispensar en un tubo 1 ml de la solucin hipoosmtica y 0,1 ml de semen. Se
mezclan y se dejan 30 minutos en estufa a 37C.
o Depositar una gota de la preparacin entre porta y cubreobjetos.
o Observar en microscopio de contraste de fases a 400 aumentos. Contar al menos
200 spz/preparacin.
Interpretacin
La identificacin al microscopio es relativamente fcil (ilustracin 11):
o Se considera negativo cuando no hay hinchamiento de la membrana, con lo que el
flagelo queda intacto.
o Si el test es positivo, espermatozoides viables, hay hinchamiento de la membrana y el
flagelo se altera adoptando distintas formas en funcin del grado de hinchamiento.
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Ilustracin 11. Ejemplo del test de vitalidad con Sol. Hiposmtica. El Hos(-) est intacto,
muerto; los Hos (+) que tienen el flagelo encogido en distinto grado por hinchamiento,
estn vivos
Valoracin de los resultados de ambos test de vitalidad
Al igual que en el recuento, se ha de evaluar el resultado de la vitalidad mediante la grfica o
tabla del intervalo de confianza del 95% para diferencias entre dos porcentajes. Si el error es
mayor se deber preparar y contar dos nuevas preparaciones.
El lmite inferior de referencia que marca el nuevo manual de la OMS es del 58%.
La vitalidad puede servirnos como evaluacin de los resultados de movilidad. Esto es as porque
el tanto por ciento de espermatozoides viables siempre debe ser igual o superior al de
espermatozoides mviles. Por ejemplo:
o Si el resultado de la vitalidad es del 40%, no podemos admitir como vlida una
movilidad del 50%, porque para ello habra que asumir que el 10% de los
espermatozoides muertos se mueven.
o En cambio si por ejemplo el test de vitalidad es del 40% y el de movilidad del 35% ser
correcto, ya que esto supone que un 5% de espermatozoides vivos no se mueven,
algo absolutamente coherente.
La vitalidad tambin puede servir para descartar problemas en la obtencin de la muestra. Si el
100% de los espermatozoides son inmviles se han de valorar los siguientes supuestos:
o Que haya habido problemas de obtencin de la muestra, por el uso de detergentes o
espermicidas. Descartar el que se haya usado un preservativo en la recogida.
o Que se trate de un transporte inadecuado de la muestra, bien por la temperatura o
por el tiempo.
o Que sea un Sndrome de Kartagener: en este caso habra un 100% de
espermatozoides inmviles pero con resultados de vitalidad aceptables. La ausencia
de la protena Dinena incapacitara la movilidad de los espermatozoides.
Estudio bsico del espermiograma
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Tambin se debe valorar clnicamente los casos de movilidad baja con resultados de vitalidad
aceptables:
o Podra deberse a una Polispermia. Una elevada concentracin espermtica podra
provocar una baja movilidad debido a un agotamiento del sustrato fructosa,
importante como fuente de energa para la movilidad.
o Otras causas: estructurales, dficit enzimticos, etc.
Si se obtiene una vitalidad y movilidad bajas.
o Podra deberse a un dao celular por peroxidacin de lpidos de membrana,
fenmeno que es potenciado por la presencia de leucocitos o por el envejecimiento
de muestras.
El estudio de la vitalidad puede tener una utilidad teraputica, como es el caso de la tcnica ICSI.
Esta tcnica consiste en microinyectar un espermatozoide vivo dentro de un ovocito. En el caso
de que todos los espermatozoides sean inmviles, se podr realizar un test hipoosmtico y
seleccionar un espermatozoide hinchado que sera viable. Con una micropipeta se aspirara y se
inyectara dentro del ovocito. Todo esto utilizando microscopio invertido con el equipo de
micromanipulacin adecuado.
Anticuerpos antiespermatozoides 4.4
Los anticuerpos antiespermatozoide son anticuerpos generados frente a antgenos especficos
del espermatozoide. Estos antgenos no estn presentes en la vida fetal en el momento del
imprinting inmunolgico ya que la espermatognesis no se activa hasta la pubertad. Esto hace
al espermatozoide una estructura desde el punto de vista antignico extraa. Adems los
antgenos expresados sobre los espermatozoides maduros difieren en ms de un 50% de los
expresados por las espermatogonias.
Los anticuerpos antiespermatozoide tendrn relevancia clnica si estn adheridos a la membrana
plasmtica ya que alteran su fisiologa y su funcionalidad. Los antgenos presentes en plasma
seminal actan de camisa de proteccin inmunolgica. Pero en caso de una patologa sera una
posibilidad de estimulacin autoinmune de la cual el espermatozoide sera la vctima inocente.
No es igual que estn unidos en el flagelo que en la cabeza. Aqu la capacidad fecundante se
puede ver ms alterada.
Mecanismos de defensa de la autoinmunidad:
o En los tbulos seminferos, las clulas de Sertoli se unen entre ellas a travs de unas
50 a 60 uniones, formando una barrera de defensa conocida como Barrera
Hematotesticular.
o Esta barrera asla el comportamiento adluminal donde se encuentra el
espermatozoide del compartimento basal y del contacto con clulas
inmunocompetentes del torrente sanguneo, evitando as el reconocimiento
inmunolgico del espermatozoide.
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o Adems la barrera deja pasar pequeas cantidades de antgenos espermticos al
torrente, lo que estimulara los linfocitos T supresores, induciendo un estado de
tolerancia inmunolgica.
o En la Rete Testis ser la reducida vascularizacin la que contribuya a la
inmunosupresin de los espermatozoides.
o La inmunosupresin a nivel epididimario estar producida por la presencia de un
elevado nmero de linfocitos T supresores y por la produccin de sustancias de
cubierta inmunosupresoras que actan a diferentes niveles.
o Por otra parte diversas sustancias producidas por la prstata y las vesculas seminales
actan como inmunosupresores.
Estas barreas y mecanismos de defensa a nivel tisular y de la va seminal pueden ser alterados
poniendo en contacto con el sistema inmunocompetente las estructuras del espermatozoide y
las sustancias inmunognicas del plasma seminal, producindose una autovacunacin
antiespermatozoide.
Varias patologas androlgicas pueden causar alteraciones de la barrera:
o Traumas.
o Intervenciones quirrgicas.
o Necrosis, torsiones testiculares.
o Neoplasias.
o Varicoceles
o Criptorquidias.
o Infecciones recidivantes del tracto genitourinario.
o Obstrucciones.
Una vez rota la barrera los anticuerpos producidos pueden tomar contacto con los
espermatozoides alterando su funcionalidad.
El Manual sobre Anlisis de semen de la OMS sigue manteniendo en su quinta edicin la
obligatoriedad de realizar el estudio de anticuerpos antiespermatozoides en todos los
seminogramas. Adems, es particularmente importante cuando encontramos aglutinaciones o
movilidad baja, lo cual no quiere decir que siempre que haya aglutinaciones se corresponda con
la presencia de anticuerpos antiespermatozoide.
Se considera que existe un factor inmunolgico cuando ms del 50% de los espermatozoides
mviles de un eyaculado tienen adheridos anticuerpos antiespermatozoide.
En casos positivos se estudiarn: los isotipos presentes, la intensidad de respuesta y la
localizacin del anticuerpo.
Hay que tener en cuenta que los niveles de respuesta inmune fluctan, por lo que es interesante
el seguimiento de los niveles de anticuerpos antiespermatozoide en el factor masculino
inmunolgico. Sin embargo, encontrar anticuerpos no implica necesariamente el factor
Estudio bsico del espermiograma
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inmunolgico. Para ello hay que demostrar que existe una alteracin funcional mediante
pruebas funcionales.
En un eyaculado con anticuerpos antiespermatozoide generalmente hay anticuerpos de los
isotipos inmunoglobulinas G o inmunoglobulinas A. Los anticuerpos inmunoglobulinas M no
suelen encontrarse debido a su gran tamao. Cuando se encuentran inmunoglobulinas A lo
normal es que estn acompaadas por inmunoglobulinas G, siendo las inmunoglobulinas A las
que tienen una mayor importancia clnica. Habitualmente se suelen usar tcnicas que detectan
los anticuerpos inmunoglobulinas G como cribaje poblacional y en caso positivo se debe estudiar
la presencia de anticuerpos inmunoglobulinas A.
La importancia clnica de los anticuerpos antiespermatozoide depender tambin de su
localizacin a lo largo de la membrana plasmtica.
o La alteracin funcional ms grave se produce cuando se fijan a nivel de la cabeza o de
la pieza intermedia, alterndose los procesos de capacitacin espermtica.
o Cuando se fijan en el flagelo se producirn alteraciones de la movilidad.
o Por ltimo, no tienen ninguna relevancia clnica y por tanto no deben ser
considerados los anticuerpos adheridos a la punta del flagelo.
Fundamento de las tcnicas para anticuerpos antiespermatozooides
Las tcnicas para la deteccin de anticuerpos antiespermatozoide se basan en una reaccin de
aglutinacin de los anticuerpos con esferas recubiertas de anticuerpos antiinmunoglobulinas. Se
basan en medir el % de espermatozoides mviles que tienen adheridos anticuerpos y por tanto
esferas en su superficie.
Permiten caracterizar los isotipos presentes as como cuantificar la respuesta inmunolgica. Sin
embargo el hecho de medir solamente sobre espermatozoides mviles, hace que en casos de
Astenozoospermia elevada y Necrozoospermia no tengan ninguna utilidad y por tanto sean
intiles para detectar un factor inmunolgico masculino.
Las tcnicas ms usadas son:
o Test Inmunobead o IB test.
o Reaccin mixta de antiinmunoglobulinas o MAR test.
Las dos tcnicas pueden ser utilizadas como:
o Test directos que nos permiten la deteccin de anticuerpos antiespermatozoide
adheridos a espermatozoides, o
o Test indirectos para la deteccin de anticuerpos antiespermatozoide en fluidos como
lquido seminal, suero, fluido cervical.
Vamos a desarrollar los test directos por ser los de primera eleccin, y con mayor detalle los
M.A.R. test directos por ser los ms implantados.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
74
o IB TEST DIRECTO
o Utiliza semen lavado.
o Emplea una matriz de poliacrilamida.
o Nos permite detectar IgG e IgA tanto de origen secretor como no secretor.
o Nos dar ms informacin que el Mar test al no interferir el lquido seminal.
En esta tcnica los anticuerpos antiespermatozoide se pondrn en evidencia en caso de
existir porque se unirn a ellos antiinmunoglobulinas G o A fijados a las esferas de
poliacrilamida y por tanto se observan los espermatozoides mviles con las esferas
adheridas.
o M.A.R. TEST DIRECTO
o Se emplea semen completo.
o Es un test rpido, fcil y sensible.
o Permite detectar los isotipos IgG e IgA de origen secretor.
o Nos da menos informacin que el test inmunobead al no haberse eliminado el
lquido seminal.
Para identificar la presencia de anticuerpos fijados en espermatozoides se aadirn esferas
de ltex a las que se une Inmunoglobulinas, del isotipo G o A. Posteriormente se aadirn
anticuerpos antiinmunoglobulinas, frente a los del isotipo G o A. Si hay anticuerpos
antiespermatozoide fijados, formarn un complejo de unin con stos y con las esferas de
ltex unidas a inmunoglobulinas. Por lo tanto el espermatozoide fijar bolitas de ltex slo si
tiene anticuerpos adheridos.
Procedimiento del M.A.R. test directo
En portaobjetos y por duplicado poner.
o 3,5 l de semen completo y 3,5 l de esferas revestidas con IgG (o IgA humana).
o Mezclar.
o Aadir 3,5 l de antisuero frente a IgG (o IgA humana).
o Mezclar y cubrir con cubre 22x22.
o Mantener 3 minutos en cmara hmeda.
o Realizar la observacin microscpica a 400x utilizando contraste de fases. Contar al
menos 200 espermatozoides en cada portaobjetos.
o Realizar la observacin en cmara hmeda:
o 1 medida, a los 3 minutos. Si el 100% de los espermatozoides mviles presentan
esferas unidas no hacer ms observaciones.
Estudio bsico del espermiograma
75
o 2 medida, a los 10 minutos. Valorar el porcentaje de los espermatozoides
mviles con esferas unidas. Si los espermatozoides se hubieran vuelto inmviles
a los 10 minutos considerar como vlida la medida a los 3 minutos.
Interpretacin del M.A.R. test directo
o Se considera un espermatozoide positivo, con anticuerpos en su superficie, si es mvil
y tiene esferas adheridas.
o Si no hay anticuerpos en las membranas de los espermatozoides mviles, stos
nadarn libremente entre las partculas.
o Anotar el lugar de unin: cabeza, parte intermedia o flagelo.
o Ignorar si las esferas estn unidas en la punta del flagelo.
o Calcular el porcentaje de cada preparacin.
Como en todas las tcnicas se debe realizar la evaluacin de resultados mediante el clculo
del intervalo de confianza del 95% para diferencias de dos porcentajes. Si el error es mayor
se debe prepara y contar dos nuevas preparaciones de la muestra.
Valores normales del M.A.R. test directo
El nuevo manual sigue sin dar unos valores normales, entendiendo por ellos unos realizados
estudiando una poblacin de varones frtiles. Aunque se mantiene el valor de consenso del
50% como valor indicativo. Esto es as porque hay estudios que demuestran que la
penetracin de espermatozoides en moco cervical y fertilizacin in vivo tiende a no
correlacionar cuando los valores de anticuerpos antiespermatozoides son iguales o
superiores a 50%.
Otras clulas 4.5
Adems de espermatozoides, el eyaculado contiene otras clulas:
o Clulas epiteliales.
o Clulas redondas, una terminologa que agrupa a leucocitos y clulas de la
espermatognesis. Un nmero alto de estas clulas puede ser indicativo de procesos
inflamatorios o alguna patologa o alteracin a nivel testicular.
Como procedimiento estndar se debera hacer de forma rutinaria el contaje de clulas
redondas. Si el nmero supera la concentracin de un milln por mililitro debera investigarse la
presencia de leucocitos por alguno de los mtodos establecidos.
Para calcular la concentracin de estas clulas podramos recurrir al mtodo ya visto, doble
dilucin y medida en cmara de Neubauer improved. Se hara a la par que se realiza el contaje
de los espermatozoides para la medida de la concentracin espermtica. Sin embargo este
mtodo no es muy apropiado, ya que salvo que haya una alta concentracin de clulas redondas
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
76
las diluciones empleadas suelen ser demasiado altas como para poder realizar una medida
fiable, que recordemos pasa por contar al menos 400 elementos para obtener un error que no
supere el 5%.
Por tanto, la forma ms adecuada para calcular la concentracin de clulas redondas es usando
las extensiones teidas para la realizacin de la morfologa espermtica. A la vez que se hace la
morfologa se anotar el nmero de clulas redondas visualizadas y se aplicar la siguiente
frmula:
o Si se cuentan menos de 400 clulas redondas el error es superior al 5%, y aparte del
resultado hay que informar el error asociado al n de espermatozoides contados.
o Si se cuentan menos de 25 clulas redondas, el error es superior al 20%, que
recordemos se consideraba el error mximo permitido para poder dar un resultado
respetable. Por lo tanto, el resultado se debera acompaar con el comentario de que
el nmero de clulas redondas contadas es demasiado pequeo para poder asegurar
esa concentracin.
Ejemplo
o Supongamos que en una de las preparaciones Diff-Quik, a la vez que vamos contando
la morfologa, contamos 16 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En la
otra preparacin, contamos 19 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En
total habremos contado 35 clulas redondas por 400 espermazotoides.
o Para un contaje de 35 clulas la diferencia mxima permitida es de unos 10, en
nuestro caso es 3. Luego el resultado ser apto. Si no lo fuera tendramos que
recontar de nuevo las dos preparaciones.
o Aplicando estos datos a la frmula ya conocida, obtendremos una cifra de
7,79 millones/ ml. El resultado no debe tener ms de dos cifras significativas, por lo
tanto informaremos 7,8 millones de clulas redondas / ml.
o Pero no hemos contado 400 clulas redondas sino 35, con lo que el error ser mayor
del 5% y deberemos informarlo, el error ser del 17%.
o El informe final ser millones clulas redondas / ml, con un error del 13%.
o Se ha de tener en cuenta que al superar el milln por mililitro debe ser investigada la
presencia de leucocitos por alguno de los mtodos vlidos, como el test de la
peroxidasa.
Estudio bsico del espermiograma
77
EXTENSIN EN PORTA Y TINCIN DIFF-QUIK. 1000X
RECUENTO Clulas Redondas Espermatozoides
1 preparacin 16 200
2 preparacin 19 200
Suma 35 400
Diferencia 3
Valoracin APTO
Clculo C= (C spz x N Clulas Redondas)/400
C = (89 x 35)/400
C = 7,8 millones Clulas Redondas/ ml
Error
%SE = 100 (N/N)
%SE = 100 (35/35) = 17%
4.5.1. Leucocitos
Los leucocitos, principalmente polimorfonucleares, estn presentes en la mayora de eyaculados.
Un nmero alto se asocia con posible infeccin y pobre calidad espermtica. El posible dao que
producen en espermatozoides depende del nmero de leucocitos y de la relacin entre el
nmero de leucocitos y espermatozoides. Los leucocitos producen un ataque oxidativo
alterando la movilidad de los espermatozoides y la integridad del DNA.
Procedimientos
o Tincin de Papanicolaou: se pueden diferenciar los leucocitos de las clulas de la
espermatognesis, espermatidas y espermatocitos. Pero la diferenciacin no
siempre es fcil, adems la mayora de laboratorios no disponen de esta tcnica de
tincin que es mucho ms compleja que el diff quik.
o Tincin con anticuerpos frente a antgenos CD 45 de los leucocitos.
o Test de la Peroxidasa. Es la usada mayoritariamente.
Test de la Peroxidasa
o Fundamento
Las peroxidasas del leucocito polimorfonuclear reaccionan con el agua oxigenada de la
solucin de trabajo desprendiendo oxgeno que reacciona a su vez con la
ortotoluidina, oxidndola y haciendo que adquiera el tono marrn.
o Limitaciones
o No se tien leucocitos polimorfonucleares que estn activados y hayan liberado
sus grndulos de peroxidasa.
o No se tien linfocitos, macrfagos o monocitos ya que no contienen grnulos de
peroxidasa.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
78
o Tcnica
o Hay que preparar cuatro soluciones:
1 NH
4
Cl ................................ 250 g/ L
2 Na
2
EDTA ........................... 50 g/ L en PBS
3 Orto-toluidina ................... 0,25 mg/ ml
4 H
2
O
2
................................. 30%
o Con estas cuatro soluciones se prepara la Solucin de trabajo:
1 ml de la Solucin 1
1 ml de la Solucin 2
9 ml de la Solucin 3
1 gota de la Solucin 4
o A 0,9 ml de la Solucin de trabajo se aade 0,1 ml de semen. Realizar por
duplicado.
o Agitar 2 minutos.
o Dejar 20-30 minutos a temperatura ambiente.
o Agitar y proceder al recuento.
El recuento se hace en cmara de Neubauer, de forma similar a la concentracin
espermtica. Al menos hay que contar 200 clulas peroxidasa positivas en cada subcmara,
para lo cual se contarn el nmero de rejillas completas necesarias. Despus se evaluarn los
resultados mediante grfica del intervalo de confianza al 95% para diferencia entre dos
contajes. Por ltimo se calcular la concentracin segn la frmula:
El resultado se dar con dos cifras significativas, por ejemplo si obtenemos 2,74 lo
redondearemos a 2,8.Si se cuentan menos de 400 clulas el error ser superior al 5% y junto
al resultado habr que informar el error asociado al nmero de clulas contadas.
Para calcular la sensibilidad del mtodo, suponiendo un error mximo admisible del 20%, la
sensibilidad sera 138888 PMN / ml
Si se observa algn leucocito pero menos de 25, se expresar: El nmero de leucocitos es
demasiado bajo para poder precisar la concentracin, ya que sta es menor que la
sensibilidad del mtodo, que es de 138888 PMN/ ml. Se informa por tanto que la
concentracin es menor de 138888 PMN/ ml.
Estudio bsico del espermiograma
79
Ejemplo
o Supongamos que al realizar por duplicado el contaje obtenemos en una subcmara
completa 102 leucocitos en las 9 rejillas, y en la segunda 119 leucocitos tambin en
las 9 rejillas.
o Al haber contado 221 leucocitos deberamos obtener una diferencia mxima de unos
29, en nuestro caso la diferencia es de 17, por lo tanto nuestros resultados sern
vlidos.
o Al aplicar la frmula obtenemos 1,23, e informaremos slo dos cifras significativas:
1,2 millones leucocitos/ ml.
o Puesto que hemos contado <400 leucocitos se ha de informar el error, que sera 7%,
as el informe sera: C (leucocitos) = 1,7 millones / ml (error 7%).
NEUBAUER IMPROVED 400X
MUESTRA 0,1 ml semen +
0,9 ml Sol Peroxidasa
0,1 ml semen +
0,9 ml Sol Peroxidasa
RECUENTO
LEUCOCITOS
1 PREPARACIN 2 PREPARACIN
1 Subcmara 102
2 Subcmara 119
Suma 221
Diferencia 17
Valoracin Apto
Clculo C = (N PMN/ N rejillas) x (1/100) x Factor Dil
C = (221/18) x (1/100) x 10
C = 1,2 millones PMN / ml
Error
%SE = 100 (N/N)
%SE = 100 (221/221) = 7%
o Valores de referencia
El manual no establece unos valores de referencia con la poblacin de estudio de este
manual, es decir, en parejas que han quedado gestantes en el plazo de un ao o
menos. Mientras no existan estudios, se mantiene el valor de referencia de 1 milln
de leucocitos por mililitro.
4.5.2. Clulas de la espermatognesis inmaduras
Generalmente en semen se encuentran: espermtides redondas, espermatocitos, y raramente
espermatogonias. Un recuento alto de este tipo de clulas indicara desrdenes en la
espermatognesis.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
80
Procedimientos
o Tincin de Papanicolau. Las espermtides y espermatocitos se pueden diferenciar de
los leucocitos mediante la tincin de Papanicolau en funcin de la coloracin
adquirida, forma y tamao del ncleo. Sin embargo, cuando los leucocitos degeneran
en procesos inflamatorios resulta difcil diferenciarlos mediante esta tcnica. Imagen,
o Test de la peroxidasa.
o Test de anticuerpos frente a antgenos CD 45 de los leucocitos.
Estas dos ltimas tcnicas son una aproximacin, ya que habra que asumir que las
clulas que no son leucocitos polimormonucleares son clulas germinales.
o Tinciones especficas del acrosoma (con lectinas o anticuerpos especficos). Tien el
acrosoma que comienza a desarrollarse en las espermtides.
El tamao nuclear tambin ayuda a la identificacin:
o Espermatogonia-8 micras
o Espermatocito-10 micras
o Espermtida-5 micras.
Sin embargo, esto slo sirve de referencia porque la degeneracin o los periodos de divisin
afectan estos tamaos.
http://bit.ly/ThJ9p0
Aqu se puede descargar el 5 manual de la OMS (pginas 97-99: atlas de clulas).
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
81
Captulo 5
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
Caracteres funcionales de los espermatozoides 5.1
5.1.1. Prueba de interaccin moco cervical-esperma
Estas pruebas permiten apreciar la aptitud de los espermatozoides para migrar en el moco y
adems, son esenciales en la evaluacin de la calidad funcional de los espermatozoides. La
prueba de Hhner es un examen solicitado sistemtica y precozmente en el estudio de la
subfertilidad de la pareja.
A) Prueba de Hhner o prueba poscoital
Se trata de una prueba simple, no invasiva y barata. Aporta informacin sobre la calidad del
moco cervical consecuencia de la secrecin de estrgenos y de la calidad del movimiento
flagelar de los espermatozoides. Las anomalas en la interaccin moco-esperma son
responsables del 5 al 15% de los casos de infertilidad.
Se hace en el perodo preovulatorio. Para un ciclo de 28 das, se recomienda practicarla al
decimotercer da. Los pacientes tienen que tener una relacin sexual de 2 a 18 horas antes del
examen. La paciente no tiene que hacer la limpieza ntima antes de ir al laboratorio. La primera
etapa de este examen consiste en apreciar la calidad del moco cervical por el estudio de su
volumen, su viscosidad, su filancia, su cristalizacin y su celularidad.
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
82
El estudio de estos parmetros permite establecer un ndice, el ndice de Insler (Insler score).
o Si el ndice de Insler es superior a 10, el moco es de buena calidad, de tipo ovular.
o Si es inferior a 10, el moco no es de tipo ovular.
La prueba es considerada como:
o Positiva si existen ms de 10 espermatozoides mviles por campo con un aumento de
400.
o Si la prueba es negativa (<10 spz/campo), puede tratarse o de un moco inadecuado o
de una patologa espermtica (disquinesia flagelar).
o En caso de negatividad de la prueba por problema del moco, debe repetirse
cuando mejore, o despus de tratamiento antibitico si haba infeccin o, lo ms
frecuentemente, despus de tratamiento estrognico.
o Si la prueba es negativa y el moco es de buena calidad, se solicita una prueba de
penetracin cruzada in vitro.
B) Prueba de penetracin cruzada in vitro
Exige diferentes materiales biolgicos: moco cervical de la mujer, esperma del marido, esperma
testigo y moco testigo. Consiste en poner en contacto el moco de la mujer con el esperma de su
pareja, los espermatozoides del paciente con un moco testigo y el moco de la paciente con el
esperma testigo. Esta prueba tambin se realiza lo ms prximo posible a la ovulacin. Evala la
calidad y la cantidad de espermatozoides que ha penetrado en los diferentes mocos. La
interpretacin de esta prueba es a veces difcil cuando existe participacin del moco y de los
espermatozoides, en los defectos de migracin.
Permite ver si se trata de un problema de moco o un problema de espermatozoides.
o Si los espermatozoides probados no penetran ni en el moco de su pareja, ni en el
moco testigo, mientras que el esperma testigo s penetra en el moco testigo, se trata
de un problema espermtico.
o Si al contrario, el esperma probado penetra en el moco testigo y no en el moco
probado y el esperma testigo no penetra tampoco en el moco probado, se trata de un
problema de moco.
5.1.2. Anlisis del movimiento de los espermatozoides asistido por ordenador
(C.A.S.A.)
El objetivo es poner de manifiesto las anomalas del movimiento difcilmente visibles en la
observacin microscpica simple. Se puede solicitar el caso de prueba de Hhner y prueba de
penetracin cruzada negativas por causa espermtica, en caso de sospecha de anomala del
movimiento en el espermiograma (como por ejemplo presencia de
espermatozoides de migracin deslizante).
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
83
Un espermatozoide presenta habitualmente un movimiento sinusoidal y su trayecto se
caracterizada por bastantes parmetros (Ilustracin 12):
o Amplitud del giro lateral de la cabeza respeto a la pieza intermedia (ALH);
o Velocidad de progresin lineal en m/s (VSL): velocidad media del desplazamiento
segn una lnea recta trazada entre la primera y la ltima posicin detectada de la
cabeza;
o Velocidad curvilnea en m/s (VCL): velocidad media del desplazamiento de la cabeza
a lo largo de su trayectoria real, tal como se ve en dos dimensiones en el microscopio;
o Velocidad segn el trayecto medio en m/s (VAP): velocidad media de
desplazamiento de la cabeza siguiendo el trayecto medio;
o Linealidad del trayecto igual a la relacin VSL/VCL.
o Media del desplazamiento angular (grados), MAD. La media de los valores del ngulo
de giro instantneo de la cabeza de los espermatozoides a lo largo de su trayectoria
curvilnea.
Ilustracin 12. Parmetros de la trayectoria del espermatozoide, medidos por ordenador.
ALH: amplitud del giro lateral de la cabeza respeto a la pieza intermedia.
MAD: media del desplazamiento angular.
VAP: velocidad segn el trayecto medio. VCL: velocidad curvilnea.
VSL: velocidad de progresin lineal.
Aqu se puede ver un vdeo demostrativo del anlisis del movimiento asistido por ordenador:
http://www.micropticsl.com/esp/productos/analisis_esperma_sca_video03.html
5.1.3. Estudio de la reaccin acrosmica
Este examen se practica en muy pocos laboratorios. Los espermatozoides capacitados tienen
que ser capaces de efectuar la reaccin acrosmica con el fin de penetrar en los ovocitos. Parece
bien demostrado que el resultado de la fecundacin in vitro (FIV) est correlacionado con la tasa
de reaccin acrosmica y que un fracaso de FIV puede ser debido a la ausencia de reaccin
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
84
acrosmica. As, una tasa de reaccin acrosmica inducida inferior o igual al 5% sera predictiva
de una tasa dbil de fecundacin.
Este examen se solicita en el caso de presencia en el espermiocitograma de un porcentaje
importante de anomalas del acrosoma o despus de un fracaso de la FIV.
5.1.4. Prueba de fecundidad heteroespecfica
Permite estudiar, por una parte, la interaccin entre las membranas ovocitarias y la membrana
del espermatozoide y por otra parte, la aptitud de los espermatozoides para desarticular su
ncleo despus de su penetracin en un citoplasma ovocitario. Se hace con ovocitos de hmster
depelucidados, ya que la pelcida es una barrera interespecies. Es de realizacin delicada y slo
se hace en algunos laboratorios de Biologa de la Reproduccin.
Se valoran las cabezas expandidas por ser indicativas de que el ncleo del espermatozide, que
estaba muy contrado en el momento de entrar en el ovocito, ha conseguido entrar en l, ha
desaparecido la membrana nuclear del espermatozoide, se ha descondensado la cromatina y
expandido el ncleo dentro del ovocito. La prueba es positiva si se observa la presencia de una o
ms cabezas expandidas en ms del 10% de los ovocitos.
Cuando el porcentaje es nulo, las probabilidades de conseguir embriones en FIV convencional
son muy dbiles; en estos casos est indicada la inyeccin intracitoplsmica de espermatozoides.
Concretamente cuando se quiere realizar una inseminacin artificial y en el espermiograma se
han hallado numerosas anomalas de la cabeza de los espermatozoides (anomalas del
acrosoma, base disminuida) y la prueba de fecundidad heteroespecfica ha sido negativa, se
evita un fracaso de fijacin en la FIV convencional y se realiza en su lugar la prueba ICSI.
5.1.5. Pruebas para explorar la calidad del ncleo espermtico
El fenmeno de condensacin o compactacin del ncleo se desarrolla en la maduracin del
espermatozoide, al final de la espermiognesis y durante el trnsito epididimario. El estado de
condensacin y estabilidad del ncleo puede ser apreciado por diferentes mtodos. En el
eyaculado humano, los espermatozoides forman una poblacin muy heterognea que presenta
niveles diferentes de madurez nuclear.
La coloracin por el azul de anilina permite evaluar el grado de condensacin de la cromatina.
Desde hace poco tiempo, hay pruebas que estudian el grado de fragmentacin del ADN de los
espermatozoides. Ciertos equipos consideran que estas pruebas tienen un valor pronstico con
respecto a los resultados de la asistencia mdica a la procreacin.
5.1.6. Estudio por microcopia electrnica de los espermatozoides
Permite confirmar las anomalas constitucionales de los espermatozoides, como es el caso de las
disquinesias flagelares. Confirma, por ejemplo, las anomalas del axomena de los
espermatozoides (ausencia de brazos de dineina, ausencia de los tbulos centrales, anomalas
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
85
de la vaina fibrosa...) o las ausencias de capa posacrosmica. Este examen se efecta en
laboratorios especializados equipados con un microscopio electrnico.
Bioqumica seminal 5.2
5.2.1. Eleccin de los marcadores bioqumicos
La eleccin de los marcadores bioqumicos se basa, no en su papel o inters
fisiolgico, sino nicamente en que sea producido especficamente mediante una de las
glndulas anexas o una zona muy determinada del tracto genital masculino. Permiten realizar
una verdadera cartografa anatmica del aparato genital.
Es posible, en efecto, localizar una afeccin del tracto genital en funcin de la disminucin de un
determinado marcador, teniendo en cuenta que:
o Cada glndula posee su marcador especfico. Tabla 7.
o Si una glndula est afectada, hay disminucin de la concentracin de su marcador.
o Esta disminucin no es compensada porque no hay mecanismos de regulacin
homeostsica, como para la glucemia.
o Si hay obstruccin al nivel del tracto, las secreciones de las glndulas situadas ms
arriba no se pueden evacuar y se observar una disminucin del marcador
correspondiente.
Las indicaciones ms frecuentes de la bioqumica seminal son:
o Una azoospermia;
o Una oligozoospermia;
o Un volumen pequeo;
o Una infeccin genital;
o Una disminucin de la movilidad (< al 20%);
o Otros: viscosidad anormal, preparacin de esperma para FIV o ICS.
PRSTATA EPIDDIMO
VESCULAS
SEMINALES
o Citrato
o Zinc
o Fosfatasa cida
o -1,4 Glucosidasa neutra
o L-Carnitina
o Fructosa
Tabla 7. Origen glandular de los parmetros bioqumicos del plasma seminal
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
86
5.2.2. Determinacin de marcadores bioqumicos
A) Obtencin del plasma seminal
Despus de analizar el semen se toma una alcuota de la muestra que nos quede y se procede a
la centrifugacin: durante 10 minutos a 1000g de Fuerza Centrfuga Relativa (FCR = 1,118 x 10
-5
x
R [cm] x V
2
[rpm]). Posteriormente se decanta el plasma seminal del sobrenadante y se conserva
congelado a -20C hasta su procesamiento.
B) Pretratamiento del plasma seminal
Es largo y meticuloso.
o Para la determinacin de la L-carnitina hay dos posibilidades: o se realiza previamente
la desproteinizacin con cido perclrico, seguida de una neutralizacin, o bien se
realiza una desproteinizacin por paso a travs de membrana de filtracin
MilliporeTM, que elimina las protenas del plasma seminal.
o Para la determinacin de la fructosa y el citrato se realiza una desproteinizacin
seguida de una neutralizacin.
o La determinacin del zinc, de las fosfatasas cidas, de la-1,4 glucosidasa se realiza
directamente en el plasma seminal o despus de simple dilucin en NaCl 0,15 M.
C) Tcnica UV a 340nm
La cuantificacin de los tres sustratos, carnitina, fructosa y citrato, se basa en el mismo principio
cuando se realiza a 340 nm. El parmetro a determinar es el primer sustrato de una cascada de
reacciones enzimticas a 37 C, es pues el parmetro limitante. La ltima reaccin es la reaccin
indicadora, que acaba en la formacin o el consumo de NADH
2
o a NADPH
2
, que se mide por la
variacin a punto final de la absorbancia por espectrofotometra UV a 340 nm. La deteccin se
desarrolla en 2 tiempos:
o Se incuba en primer lugar el plasma seminal con el reactivo 1 que contiene el tampn
de reaccin, los sustratos anexos necesarios y las diferentes enzimas de la cascada,
excepto la primera enzima.
o Luego se aade el reactivo 2, reactivo desencadenante, conteniendo la primera
enzima que inicia la cascada de reacciones. Se efecta la medida al final de la
reaccin, cuando se agota el sustrato inicial.
o L-Carnitina. El reactivo desencadenante es la carnitina acetil transferasa.
Ilustracin 13.
o Fructosa. El estuche comercial utilizado est concebido para analizar al mismo
tiempo la fructosa y la glucosa. El esperma contiene poca glucosa, pero sin
embargo hay que eliminar esta interferencia. Ilustracin 14.
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
87
- Con ese fin, el primer reactivo contiene la hexocinasa y la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa que realiza la totalidad de la cascada enzimtica de la
glucosa, mientras slo la fructosa es transformada en fructosa-6-fosfato.
- La primera medida efectuada tiene en cuenta la formacin de NADH2 debida
especficamente a la presencia de glucosa.
- Luego la fosfoglucosa isomerasa, contenida en el segundo reactivo, da lugar
a la continuacin de la determinacin especfica de la fructosa.
As, por diferencia entre las dos medidas de absorbancia, se consigue la
cuantificacin de la fructosa.
o Citrato. La tcnica es parecida a la de la carnitina, con un reactivo que activa la
citrato liasa. Ilustracin 15.
Ilustracin13. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la L-carnitina en plasma
seminal
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
88
Ilustracin14. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la fructosa en el plasma
seminal
Ilustracin15. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin del citrato en el plasma
seminal
D) Tcnicas colorimtricas
o L-Carnitina. Se mide la formacin de CoASH despus de la accin de la carnitina acetil
transferasa sobre el acetil CoA y sobre la L-carnitina de la muestra. El CoASH formado
reacciona con el DTNB para formar el anin 5-tio-2-nitrobenzoato amarillo que
absorbe a 405 nm.
o Fructosa: en condiciones de calor y acidez la fructosa reacciona con el indolo
formando un complejo coloreado que absorbe a 470 nm.
o Zinc. El zinc forma con el 5-Br-PAPS un complejo coloreado el cual se mide a punto
final a 560 nm.
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
89
o Fosfatasa cida. Un sustrato especfico, el -naftilfosfato, es hidrolizado a 37C,
acabando en la formacin de un compuesto azico coloreado. Es un mtodo cintico
colorimtrico: se mide el aumento medio de densidad ptica por minuto a 405 nm
durante 3 minutos (mtodo de Hillmann modificado).
o -1,4 Glucosidasa neutra. La actividad enzimtica es medida por hidrlisis a pH 6,8 y a
37C del p-nitrofenilglucopiransido en p-nitrofenol, que al aadirle carbonato sdico
se trasforma en un producto amarillo medible por su absorbancia a 405 nm. Para que
la medida de esta isoenzima sea especfica, se utilizan dos inhibidores:
o El dodecilsulfato de sodio, SDS, que inhibe la actividad de la isoenzima
-glucosidasa cida prosttica.
o La castanospermina, alcaloide que inhibe todas las actividades hidrolsicas del
esperma y permite realizar un blanco de muestra.
La actividad de la-1,4-glucosidasa neutra es fcil de medir, rpida, sensible y especfica. Las
determinaciones de L-carnitina, fructosa, citrato y fosfatasa cida estn comercializadas y son
automatizables.
5.2.3. Expresin de los resultados
Los valores normales de los marcadores seminales varan de un laboratorio a otro, en funcin de
las tcnicas utilizadas. Cada laboratorio tiene que establecer sus propios valores usuales. Tienen
que ser establecidos a partir de esperma procedente de sujetos que ya hayan procreado. Los
resultados se expresan en concentracin o en cantidad por eyaculado.
Estudios complementarios en sangre 5.3
5.3.1. Cariotipo y anomalas cromosmicas
En el estudio del genotipo se pueden encontrar anomalas causantes de la infertilidad masculina,
por ejemplo:
o El sndrome de Klinefelter (47,XXY)
o El doble Y(47,XYY)
o Sndrome de los hombres XXES
o Anomala en la estructura de los cromosomas
5.3.2. Determinaciones hormonales
Un estudio hormonal es indispensable ante una azoospermia, una oligospermia o ante una
degradacin de los parmetros del esperma. Se ha de investigar un origen secretorio de los
trastornos de la espermatognesis cuando se ha observado un hipogonadismo o una
hiperprolactinemia reveladora de un adenoma hipofisario.
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
90
En consecuencia, el estudio hormonal comprende las determinaciones de FSH, LH, testosterona
y prolactina. En caso de ginecomastia, se aade la cuantificacin de los estrgenos. El recurso a
una consulta de endocrinologa es necesario en caso de alteracin compleja del balance
hormonal.
MUESTRA PARMETRO MTODO
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EVALUACIN INICIAL MACROSCPICA
Licuefaccin
o Visual
o Si no lica:
o Bromelina
o PBS
o Jeringa
Viscosidad
o Pipeta
o Varilla
Apariencia o Visual
Volumen
o Pesada
o Recipiente graduado
pH o Tiras reactivas pH (6-10)
EVALUACIN INICIAL MICROSCPICA
o Microscopio contraste de fases, pletina 37C
o Porta y cubreobjetos:
l muestra Cubreobjetos
10
6,5
11
22x22
18z18
21x26
Agregacin 100X
Aglutinacin 100X
Cel no espermticas 100X
Movilidad
o Montar porta-cubre y esperar 1
o Visualizar a 5 mm del borde
o Contaje: 200X o 400X
1 Porta:
5 campos
200 spz
2 Porta:
5 campos
200 spz
Suma con IC = 95%
% Progresivos, % No Progresivos, % Inmviles
Estimacin del
Recuento
200x:
>404
64-400
<64
400x:
>101
16-100
<16
DILUCIN Weigman
1/20
1/5
1/2
Tabla 8. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudios de fertilidad:
Espermiograma
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
91
MUESTRA PARMETRO MTODO
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ESTUDIO BSICO
Recuento
o Neubauer improved
o 400x
o Contar rejilla/s: 5, 4, 6
o Filas completas
1 Subcmara:
200 spz
2 Subcmara:
200 spz
N = Suma spz con IC = 95%
C = (N/n filas) x (1/20) x Dil
Cripto y azoospermias
RECUENTO APROXIMADO: Porta y cubre
< 4 spz/campo <2 mill/ ml
0 spz/campo: contar todo el porta
- 10 l sedimento (1 ml, 15, 500g)
- 40 l si movilidad.
Criptozoospermia
RECUENTO EXACTO:
o Micr. Contraste Fases
o 400x
o Neubauer improved
o Dilucin Weigman
o Contar cmara total
o C= N x (1/1800) x2=spz/ ml
o %SE= 100 (N/N)
o Micr. Fluorescencia
o 250x
o Cmara Leja
o Dilucin Hoeschst
o Contar cmara total
o C= N x (1/50000)x2=spz/ ml
o %SE= 100 (N/N)
N C %SE N C %SE
<400 Frmula Frmula
(>5)
<400 Frmula Frmula
(>5)
25-0 27777=S 20 25-0 1000=S 20
0 4100 52 0 150 52
Tabla 8 continuacin. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudios de
fertilidad: Espermiograma
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
92
MUESTRA PARMETRO MTODO
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ESTUDIO BSICO
Morfologa
o 2 portas
o Arrastre de 1 gota con porta 45 / 1
o Si <2mill/ ml: 5-10 l sedimento (10600g)
o Si viscoso: Dil Bromelina (1/2) o PBS (1/20). Extender
con pipeta
o Secado al aire
o Tincin: Papanicolaou, Shorr o Diff-Quik
o Microscopio 1000x
1 Porta:
200 spz
2 Porta:
200 spz
Suma con IC = 95%
Segn criterio Kruger
% Normales, % Anormales
Vitalidad
Obligatorio si PR<40%
COLORANTE SUPRAVITAL T.HIPOOSMTICO
Sol. Eosina
Sol.Eosina/Nigrosina
Sol. Hiposmtica
Porta-cubre
: semen+Eosina
400x M Contr Fas
Vivos: blancos
Muertos: rosas
Porta: extensin
: semen+Eo/Nig
1000x
Vivos: blancos
Muertos: rosas
Porta-cubre
1/10: semen+Sol
400x M Contr Fas
Vivo: flag hinch
Muerto: intacto
(200spz/porta) x 2
Suma IC=95%
% Vivos, % Muertos
Ab
Antiesper-
matozoide
IB TEST DIRECTO MAR TEST DIRECTO
Semen lavado
Esferas de poliacrilamida
Anti-IgG o Anti-IgA
Semen completo
Esferas de ltex
Anti-IgG o Anti-IgA
Porta-cubre
400x Micros Contraste Fases
(200spz/porta) x 2
Suma IC=95%
3 y 10: % spz mviles + esferas
Tabla 8 continuacin. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudios de
fertilidad: Espermiograma
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
93
MUESTRA PARMETRO MTODO
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ESTUDIO BSICO
Otras
Clulas
CLULAS
REDONDAS cr
LEUCOCITOS
CLULAS
ESPERMATOG
o Tinc. Eosina/Nigr o Test Peroxidasa o Tincin
Papanicolau
o Test
Peroxidasa
o Test Ab
frente CD45
o Tincin
acrosoma
Porta: extensin
: semen+Eo/Nig
1000x
(200spz/porta).2
C cr Suma IC=95%
C=C spz x C cr/400
Neubauer imprvd
1/10: semen+D Perox
400x M Contr Fases
Rejillas completas
C=(N/rejilla).(1/100).10
N<400, %SE>5%
N=25-0, C=S=138888
SEGUNDA INTENCIN
FUNCIONA-
LIDAD DEL
ESPERMA-
TOZOIDE
Moco cervical y esperma:
o Prueba de Hhner o Penetracin cruzada in vitro
Anlisis del movimiento asistido por ordenador C.A.S.A.
Reaccin acrosmica
Prueba de fecundidad heteroespecfica
Exploracin de la calidad del ncleo espermtico
Microscopia electrnica de los espermatozoides
BIOQUMICA:
o Centrifugar (10, 1000g)Separar plasma seminal
o Si Congelacin (<-20C)Descongelacin
Fructosa
o Desproteinizacin y Neutralizacin
Cintica Enzimtica 340 nm Colorimetra 470 nm
L-Carnitina
o Desproteinizacin (HCl) y Neutralizacin o
o Desproteinizacin con Millipore TM
Cintica Enzimtica 340 nm Colorimetra 405 nm
-1,4-
Glucosidasa
Cintica colorimtrica 405 nm
Zinc Colorimetra 560 nm
Fosfatasa
cida
Cintica colorimtrica 405 nm
Citrato
Desproteinizacin y Neutralizacin
Cintica Enzimtica 340 nm
S
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OTROS:
o Gentica
o Hormonas
Tabla 8 continuacin. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudios de
fertilidad: Espermiograma
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
94
Captulo 6
Estudio del semen en vasectomas y
vasovasostomas
Semen de postvasectoma 6.1
6.1.1. Anlisis en fresco
Se recomienda que el laboratorio analice las muestras de semen lo antes posible con un lmite
mximo de 4 horas desde la eyaculacin.
La muestra se homogeneizar mediante agitacin suave y se situar una alcuota de 10 l entre
portaobjetos y cubreobjetos de 22 x 22 mm y se examinarn no menos de 20-30 campos con un
microscopio en contraste de fases.
Si se detecta la presencia de espermatozoides mviles, se especificar la concentracin y el
grado de movilidad siguiendo las recomendaciones del Manual de Anlisis Bsico de Semen de la
ESHRE o de la OMS. Si se detecta exclusivamente la presencia de espermatozoides inmviles,
bastar con mencionarlo en el informe.
Estudio del semen en vasectomas y vasovasostomas
95
6.1.2. Anlisis sedimento
Si en el anlisis en fresco no se observan espermatozoides se transferir toda la muestra de
semen a un tubo de base cnica y se centrifugar a 1000 g de FCR durante 10-15 minutos.
FCR = 1,118 x 10
-5
x R [cm] x V
2
[rpm]
Se separar el sobrenadante y se homogeneizar mecnicamente el sedimento en 100 l del
mismo plasma seminal y se estudia de igual manera a la descrita cuando se analiza el semen
fresco, sealando la presencia o ausencia de espermatozoides y su movilidad. Los distintos
grados de movilidad no se podrn evaluar despus del centrifugado, slo si son mviles o
inmviles.
Recomendaciones: En el caso de observar abundantes clulas o leucocitos en el sedimento, se
debe sealar su presencia, indicando que pueden enmascarar la visualizacin de los
espermatozoides y solicitar una nueva muestra para confirmar el resultado.
Cuando una muestra de semen contiene espermatozoides siempre existe un riesgo de no
observarlos. Cada vez que se analiza al microscopio un cubreobjetos de arriba a abajo, se
observan aproximadamente unos 40 campos. Realizando esta operacin 10 veces (10 l en cada
porta, hasta los 100 l de todo el sedimento), se analizan 400 campos. Cuando se examinan
400 campos, se valora un volumen total de unos 1.600 nl (4 x 400, puesto que un campo
microscpico corresponde a 4 nl), por ejemplo 1/62 del volumen total del sedimento de 100 ml
(100.000 nl). Si hay >188 espermatozoides en el sedimento obtenido tras la centrifugacin, el
riesgo de no encontrar espermatozoides es <5%. Sin embargo, con concentraciones ms bajas, la
probabilidad de no encontrar espermatozoides es >5%. Por esto, si no se encuentra ningn
espermatozoide despus de examinar un volumen total de 1.600 nl, se puede afirmar que los
100 L de sedimento, y por tanto la muestra completa, contienen < 188 espermatozoides.
6.1.3. Expresin de los resultados
o Anlisis en fresco: Presencia o ausencia de espermatozoides. Si se observan:
concentracin, porcentaje de espermatozoides mviles y porcentaje de
espermatozoides inmviles.
o Anlisis muestra centrifugada: Presencia o ausencia de espermatozoides. Si se
observan especificar porcentaje de espermatozoides mviles y porcentaje de
espermatozoides inmviles.
Recomendaciones: en el caso de detectar abundantes espermatozoides inmviles y sobre todo
mviles y una vez verificada la fecha de la vasectoma, es aconsejable contactar con el clnico
para informarle del hecho.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
96
Semen de prevasovasostoma 6.2
Un anlisis de semen preintervencin es recomendable, ya sea para comprobar la ausencia de
espermatozoides, como para obtener el volumen de semen de muestra inicial preoperatorio, ya
que un bajo volumen del semen, indicara adems la necesidad de la realizacin de una ecografa
antes de la intervencin para localizar obstrucciones adicionales del tracto urogenital. La
recomendacin de obtencin de muestra y posterior anlisis es igual que el anlisis de semen
posvasectoma junto con la medicin del volumen del eyaculado.
Semen posvasovasostoma 6.3
A los seis meses de la intervencin se determinarn los parmetros bsicos seminales. En
funcin de los resultados, puede ser conveniente realizar determinaciones de fructosa, cido
ctrico y maltasa (glucosidasa neutra) para valorar las secreciones de la vescula seminal,
prstata y epiddimo.
6.3.1. Resultados del semen pre y posvasovasostoma
En el anlisis prevasovasostoma, se adopta el formato de resultados del anlisis de semen
posvasectomas ya descrito y en cuanto al anlisis de semen posvasovasostoma el informe que
el laboratorio tenga establecido.
Estudio del semen en vasectomas y vasovasostomas
97
MUESTRA PARMETRO MTODO
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POSTVASECTOMA
Volumen
o Pesada
o Recipiente graduado
Recuento
En Fresco:
o Semen 10 l
o Porta y cubre 22 x 22 mm
o Microscopio contraste de fases 400x
o 20-30 campos
Si 0 spz:
o Todo el semen en tubo cnico
o 1000g, 15
o Sedimento en 100 l
o (10 l + porta-cubre (22x22))x10 veces
o Micr. contraste de fases 400x
o 40 campos
Si se observan
spz:
o Movilidad
o Recuento como
Criptozoospermia
Si 0 spz:
o No se observan spz
o C<188 spz/E, %SE>5
Si se observan spz:
o Movilidad
o Se observan spz
PREVASOVASOSTOMA
Volumen
o Pesada
o Recipiente graduado
Recuento
o Todo el semen en tubo cnico
o 1000g, 15
o Sedimento en 100 l
o (10 l + porta-cubre (22x22))x10 veces
o Micr. contraste de fases 400x
o 40 campos
o Si 0 spz: No se observan spz, C <188 spz/Eyaculado, %SE>5
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POSVASOVASOSTOMA
o Evaluacin inicial macroscpica
o Evaluacin inicial microscpica
o Estudio bsico
o (Estudios de segunda intencin: Bioqumica seminal)
Tabla 9. Procedimiento de laboratorio para el anlisis del semen en intervenciones quirrgicas
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
98
Captulo 7
Capacitacin del semen
Campo de aplicacin 7.1
Los laboratorios clnicos, en respuesta a la creciente necesidad, deben ofrecer en su cartera de
servicios tcnicas de preparacin de semen para reproduccin asistida. El campo de aplicacin
de esta tcnica es, segn la Ley 14/2006, de 26 de mayo, sobre tcnicas de reproduccin
humana asistida:
o Diagnstico, en el estudio bsico de la pareja estril.
o Tratamiento, preparacin del semen para la tcnica de reproduccin asistida de
eleccin.
o Seleccin de espermatozoides para pruebas funcionales.
Es muy importante tener en cuenta que las tcnicas de capacitacin espermtica no son en s
mismas pruebas diagnsticas, sino que forman parte de los mtodos de tratamiento del semen.
Cuando los parmetros seminales son normales el recuento de espermatozoides mviles tras la
preparacin seminal (REM) no aporta informacin adicional al estudio de la pareja estril
(recomendacin de la Sociedad Espaola de Reproduccin, Sociedad Espaola de Androloga y
Asociacin para el Estudio de la Biologa de la Reproduccin). Sin embargo el REM se ha
convertido en un referente de gran utilidad para sentar la indicacin de IIU, de FIV o ICSI, ya que
el valor pronstico que aporta un seminograma anormal es insuficiente.
Capacitacin del semen
99
Es difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar
inseminaciones intrautero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Algunos autores proponen
que cada centro establezca su punto de corte en funcin de los datos clnicos y de laboratorio de
cada centro. En general se considera de buen pronstico un REM por encima de 5 millones de
espermatozoides mviles recuperados por mililitro.
Objetivos de las tcnicas de preparacin de semen 7.2
Es conocido que durante la maduracin en el epiddimo los espermatozoides incorporan
diferentes glicoproteinas y pptidos que inhiben la capacitacin (actuaran como factores
descapacitantes). Este estado de descapacitacion se mantiene tras la eyaculacin debido a estas
incorporaciones y a la presencia de otros factores decapacitantes en el plasma seminal.
Adems, el plasma seminal puede contener agentes infecciosos que deben eliminarse antes de
cualquier tcnica de reproduccin asistida, ya que son susceptibles de provocar infecciones en la
mujer y contaminar los cultivos de ovocitos y embriones. Exposiciones prolongadas (ms de
2 horas) de los espermatozoides al plasma seminal pueden provocar una prdida de la capacidad
fecundante y ejercer un efecto negativo sobre su movilidad. As la separacin de los
espermatozoides del plasma seminal debe realizarse lo ms rpido y eficazmente posible.
Por lo tanto los objetivos de las tcnicas de preparacin de semen sern:
o Separar los espermatozoides del plasma seminal que contiene sustancias
decapacitantes, prostaglandinas y linfoquinas.
o Retirar los espermatozoides muertos, leucocitos, clulas redondas y agentes
infecciosos.
o Aportar un medio de cultivo que contenga molculas captadoras de esteroles
(albmina) y una composicin inica que apoye la homeostasis del espermatozoide y
facilite las seales de transduccin (calcio, bicarbonato).
La finalidad ltima de este proceso es seleccionar los espermatozoides mviles y mejorar la
calidad de los mismos (porque disminuye la liberacin de linfoquinas y reduce la formacin de
radicales libres), y ser un requisito previo para cualquier tcnica de reproduccin asistida. El
adecuado procesamiento de la muestra va a influir en la capacidad fecundante del
espermatozoide, tanto in vivo como in vitro y ser fundamental para el xito de la reproduccin
asistida.
Tipo de muestra 7.3
7.3.1. Semen fresco
La muestra de semen debe recogerse siguiendo las indicaciones del captulo de Preanaltica.
Pasados 30 minutos de la eyaculacin separar una alcuota de semen para su valoracin
siguiendo las recomendaciones de la ESHRE y la OMS.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
100
7.3.2. Semen congelado
En aquellas situaciones en las que no se puede emplear semen fresco se puede recurrir a semen
congelado. Existen dos tipos de muestras de semen criopreservadas:
o Semen criopreservado antes de iniciar terapias que pueden comprometer la
capacidad reproductora del paciente, cuando exista dificultad para conseguir
coordinar el momento de la inseminacin con la recogida del semen, parejas
serodiscordantes, etc.
o Semen de donante. En determinadas circunstancias como son oligozoospermias
severas, ausencia de espermatozoides en testculo, enfermedades hereditarias en las
que el varn es el portador y mujeres sin pareja masculina.
Los mtodos de descongelacin ms utilizados son: la descongelacin lenta (a T ambiente:
10-20C/min) y la rpida (a 37C-400 C/ min.); actualmente est demostrado que el mtodo de
descongelacin ms efectivo es mantener la muestra durante 2-3 minutos en un bao de agua a
37C y posteriormente incubarla durante 5a T ambiente.
La muestra de semen criopreservada contiene un agente crioprotector que debe ser retirado
antes de utilizarla para cualquier tcnica de reproduccin asistida.
o Decantar el contenido de las pajuelas en un tubo estril.
o Diluir (aproximadamente a 1/5) en medio de lavado. La dilucin debe ser un proceso
lento para evitar el choque osmtico. Se aaden lentamente, homogeneizando,
durante al menos 10 minutos (gota a gota) 4,5 ml de medio de lavado, para que se
produzca el equilibrio osmtico sin dao para el espermatozoide.
o Procesar igual que el semen fresco, preferiblemente por gradientes de densidad.
Una vez descongelado el semen y antes de procesarlo debe evaluarse la concentracin y el
grado de movilidad de los espermatozoides.
Evaluacin de la criopreservacin
o Descongelar la pajuela transfirindola a un bao de agua a 37C durante 2-3 minutos
y dejar a T ambiente durante 5 minutos.
o Desinfectar el exterior de la pajuela de modo que pueda abrirse sin riesgo de
contaminacin. Limpiar el extremo de la pajuela donde est la zona de aire con una
solucin estril de hipoclorito, aclarar con agua destilada y secar con una gasa estril.
Cortar este extremo, insertar la pajuela en un tubo, y, entonces, cortar el otro
extremo (justo por debajo del filtro) para que el contenido de la pajuela se vierta en el
tubo. Los extremos de la pajuela deben cortarse con un instrumento estril, por
ejemplo, tijeras de sutura.
o Evaluar cuantitativa y cualitativamente la movilidad espermtica y determinar la
concentracin total de espermatozoides, siguiendo las recomendaciones de la OMS.
Capacitacin del semen
101
La eficiencia de la criopreservacin de semen puede evaluarse de diferentes maneras:
o Calculando el factor de criosupervivencia (CSF):
o Calculando el nmero total de espermatozoides con movilidad progresiva en la
pajuela post-descongelacin: mediante la evaluacin de la concentracin espermtica
y la movilidad progresiva por pajuela (teniendo en cuenta el volumen de la pajuela).
Se considera una eficiencia de criopreservacin ptima un valor de CSF50% junto con
una movilidad total de 30% con 25% de movilidad progresiva.
El nmero de espermatozoides mviles requerido por pajuela depende de la intencin de uso
que quiera darse a la misma, desde inseminacin artificial (IA) a fecundacin in vitro con
inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides (FIV-ICSI).
o Criopreservacin en pacientes oncolgicos: como la calidad de las muestras de semen
de pacientes que van a seguir tratamientos oncolgicos suele ser baja, la mejor
opcin teraputica es la FIV-ICSI. En este caso, pajuelas que contengan pocos
espermatozoides mviles son a menudo suficientes para dar lugar a tasas adecuadas
de fecundacin mediante esta tcnica; en estos casos, es conveniente congelar slo
un pequeo nmero de espermatozoides por pajuela (ej. 40.000) para as maximizar
el nmero de intentos de ciclos por muestra criopreservada.
o Donantes de semen: Aunque es una situacin que queda fuera del alcance de este
documento queremos resear que, respecto a los donantes, debe conseguirse un
nmero mnimo de espermatozoides con movilidad progresiva post-descongelacin
para cada donante para decidir si la congelacin es factible.
o Para inseminacin intrauterina (IUI): Pajuelas que contengan menos de 4 millones de
espermatozoides mviles (mnimo generalmente aceptado) pueden ser usadas para
IUI pues este proceso implica la eliminacin de plasma seminal y medio de
congelacin y la concentracin de los espermatozoides antes de la inseminacin. Sin
embargo, se ha demostrado que el nmero mnimo de espermatozoides necesario
para la realizacin de IUI con semen de donante es de 1,5 millones.
o Para fecundacin in vitro (FIV-ICSI): El nmero de espermatozoides mviles por
pajuela de semen de donante no se correlaciona ni con la tasa de fecundacin ni con
la de embarazos en FIV, lo que refleja la ptima seleccin de los espermatozoides
criopreservados.
Materiales y medios necesarios 7.4
o Los medios de cultivo han de atemperarse antes de su uso y tener la certificacin CE.
o Todos los materiales empleados as como los medios de cultivo deben ser estriles y
manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar.
o Los medios de cultivo deben tener una osmolalidad entre 280-300 mOsm/kg.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
102
o El pH debe mantenerse en un rango entre 7.2-7.4, para ello es necesario utilizar
medios tamponados. Los tampones ms utilizados son: HEPES, fosfato o bicarbonato.
Los medios tamponados con bicarbonato necesitan una atmsfera rica en CO2 y una
temperatura de 37C para que se mantenga el equilibrio inico, por lo que tienen que
usarse en estufa con temperatura y CO2 controlados.
o Adems, los medios deben tener una concentracin de calcio, bicarbonato y protenas
especfica para que los espermatozoides adquieran la capacidad de fecundar.
Los medios para la preparacin de semen son de dos tipos:
o Medios para preparacin de gradientes.
Los ms usados contienen una suspensin coloidal de partculas de slice unidas de
forma covalente a molculas de silano y se preparan en solucin isotnica.
o Medios de lavado y cultivo.
Se recomienda utilizar medios que no requieran CO2, porque la mayor parte del
proceso se realiza en atmsfera aire. Los medios especficos para semen suelen estar
tamponados con HEPES y pueden usarse en atmsfera area. Contienen protenas,
mayoritariamente albmina que acta como captadora y transportadora de
molculas, as como la concentracin de sales necesaria para la homeostasis del
espermatozoide y en la mayora de los casos gentamicina como agente
bacteriosttico.
Finalmente sealar que han sido mltiples los intentos de realizar una mejora in vitro de los
espermatozoides mediante la adicin de distintos compuestos al medio de cultivo. De ellos
destacar el uso de inhibidores de la fosfodiesterasa (pentoxifilina, teofilina, cafena, etc.) para
estimular la motilidad espermtica. La inhibicin de la fosfodiesterasa provoca un aumento de la
concentracin de adenosin monofosfato cclico (cAMP). El aumento de cAMP, mediador
intracelular, regula reacciones intracelulares que activan el metabolismo del espermatozoide
mejorando parmetros de movilidad. Muchas son las publicaciones sobre el efecto de la
pentoxifilina mientras unos autores encuentran una mejora de la motilidad al incubar la muestra
seminal con pentoxifilina otros no observan diferencia alguna de ah que no se haya implantado
como rutina en la prctica clnica del laboratorio.
Mtodos de preparacin del semen 7.5
Los mtodos incluyen desde la simple dilucin y centrifugacin hasta tcnicas ms complicadas.
o Dilucin y lavado del semen. Los mtodos que utilizan solo lavado, deberan
abandonarse y emplear tcnicas ms seguras de preparacin de espermatozoides
o Migracin: el movimiento del espermatozoide es un requisito esencial
o Gradientes de densidad: separan los espermatozoides en funcin de su punto
isopcnico.
o Adherencia-Filtracin: combinan la movilidad de los espermatozoides con la
adherencia a las matrices de filtracin (lana de vidrio, sefadex).
Capacitacin del semen
103
o Mtodos avanzados: anticuerpos monoclonales, tecnologa de microesferas
(anexina V magnetic-activated cell sorting), electroforesis, cido hialurnico,
dextrano Estos mtodos en realidad slo se desarrollan para investigacin.
De todos los mtodos, los que realmente tienen utilidad clnica son los de migracin y gradientes
de densidad.
7.5.1. Mtodo de lavado
Es el ms sencillo. No conlleva una mejora de la calidad seminal simplemente una
capacitacin y concentracin.
Procedimiento
o Depositar la muestra seminal en un tubo y aadir medio de cultivo en proporcin
1:5 o 1:10 para retirar la mayor parte del plasma seminal.
o Homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 minutos.
o Retirar el sobrenadante y aadir 0,5 ml de medio de cultivo.
o Incubar 20-30 minutos.
7.5.2. Migracin
Est basado en la capacidad de desplazamiento de los espermatozoides mviles. Es el ms
fisiolgico de todos los procedimientos. Requiere muestra con buenos parmetros seminales y la
muestra se recupera muy limpia.
Swim-up
El semen licuado se deposita sobre un medio de cultivo y los espermatozoides con buena
movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo a travs del moco
cervical. Dentro de esta categora existen dos formas principales Swim Up directo y Swim Up
convencional.
Swim Up directo
El proceso consta de varias fases (Ilustracin 16A):
o Colocar aproximadamente 250 l de semen licuado en el fondo de un tubo no cnico
(para aumentar la superficie de contacto). Utilizar tantos tubos como sea necesario
para mejorar la recuperacin de los espermatozoides.
o Depositar sobre el semen 500 l de medio de cultivo resbalando por las paredes del
tubo, con cuidado de que no se mezcle con el semen.
o Dejar en un incubador a 37C formando un ngulo de 45, para aumentar la interfase,
durante un tiempo entre 30-60 minutos dependiendo de la calidad del semen. No
ms tiempo para evitar la contaminacin con plasma seminal.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
104
o Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300l de medio de cultivo, con cuidado
de no aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el
ngulo del tubo). Si hay ms de un tubo de una misma muestra se unifica todo el
aspirado en un nico tubo.
o Si el volumen obtenido es mayor de 500l, valorar el grado de movilidad y la
concentracin de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de
300-500l para inseminar.
Swim Up convencional
Se basa en el mismo principio pero requiere un primer paso de lavado.
o Aadir medio de lavado en una proporcin v/v, homogeneizar.
o Centrifugar durante 10 minutos a 500g. Se recomienda una centrfuga de cabezal fijo
para que el botn celular tenga una amplia superficie de contacto con el medio de
cultivo.
o Retirar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el botn celular.
o Aadir resbalando lentamente por las paredes del tubo 500 l de medio de lavado.
Continuar el proceso desde el punto 3 del mtodo anterior.
El inconveniente de estos mtodos es que los espermatozoides inmaduros y el resto de las
clulas permanecen en contacto durante todo el proceso con los espermatozoides maduros y
pueden producir efectos adversos sobre estos. Adems muchos de los espermatozoides
mviles pueden quedar atrapados en el fondo del sedimento y no alcanzar nunca el medio
de cultivo. La ventaja respecto del mtodo anterior es que disminuye la contaminacin con el
plasma seminal.
Para mejorar la tasa de recuperacin de espermatozoides mviles se puede fraccionar la
muestra en varios tubos, procesarlos siguiendo el protocolo y unificar el aspirado de cada
tubo en un nico tubo. Se debe valorar y si es necesario, se centrifugar y resuspender en
un volumen entre 300-500 l de medio de cultivo para inseminar.
Swim-down
Este procedimiento es similar al Swim-up, pero en este caso se coloca primero el medio de
cultivo y despus se deja resbalar el semen por la pared del tubo para que quede arriba. Se
incuba a 37C / 5% CO
2
y se descarta el sobrenadante, ya que en este caso los
espermatozoides ms aptos van a nadar hacia la parte de abajo, donde est el medio de
cultivo. Ilustracin 16B.
7.5.3. Gradientes de densidad
Su fundamento se halla en la seleccin de los espermatozoides que pueden vencer la dificultad
que presentan los gradientes de densidad y llegar hasta el fondo del tubo, adems de actuar
como filtro para plasma seminal, clulas redondas, detritus y aquellos espermatozoides con
Capacitacin del semen
105
movilidad no progresiva. Los gradientes de densidad disgregan las partculas en funcin de su
densidad de flotacin. Los diferentes componentes se separan hasta alcanzar una posicin en la
que su densidad sea igual a la de su entorno (situacin de flotabilidad neutra), donde ya no se
desplaza ms.
o Los espermatozoides maduros son clulas compactadas y alcanzan el gradiente de
mayor densidad (el fondo del tubo).
o El plasma seminal permanece flotando sobre el gradiente de menor densidad y las
clulas.
o Los espermatozoides inmaduros y muertos se sitan en la interfase entre los dos
gradientes.
Es menos fisiolgico que el mtodo de Swim-up y se utiliza fundamentalmente para smenes
con parmetros bajos y smenes criopreservados.
Los gradientes de densidad utilizados actualmente parten de una suspensin coloidal de
partculas de slice unidas de forma covalente a molculas de silano, se utilizan de forma
discontinua en soluciones isotnicas a una concentracin de 90% y 45% o tambin de 80% y 40%
y pueden adquirirse ya preparados. Se recomienda utilizar volmenes de 0,5-1ml de cada
gradiente de concentracin.
Procedimiento (Ilustracin 16C)
o Se preparan los tubos que sean necesarios por muestra teniendo en cuenta que no se
debe depositar ms de 1,5 ml de semen por tubo.
o Dispensar 0,5 ml del gradiente de 40% en un tubo cnico, a continuacin con una
jeringa de 1 ml conectada a una aguja larga de carga, depositar 0,5 ml del gradiente
de 80% en el fondo del tubo (cono), muy despacio para que el gradiente de 40% suba
y queden bien definidas las dos capas.
o Decantar el semen licuado, resbalando por las paredes de los tubos, con cuidado de
no romper la interfase. El semen debe quedar encima del gradiente de 40%.
o Centrifugar a 300g durante 20 minutos.
o Aspirar las distintas capas con una pipeta pasteur en la zona del menisco para evitar
alterar las interfases y las posibles contaminaciones, hasta alcanzar claramente el
gradiente de 80%, donde se encuentra el sedimento con los espermatozoides
maduros. Repetir el proceso con todos los tubos de la misma muestra.
o Cambiar de pipeta, al aspirar el/los sedimentos. Transferir a un nico tubo nuevo
(para evitar contaminaciones) con 1-2ml de medio de lavado, homogeneizar y
centrifugar a 500g durante 10 min.
o Retirar todo el sobrenadante, con cuidado de no aspirar el botn celular.
o Resuspender en 300-500l de medio de cultivo.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
106
o Evaluar la muestra capacitada (nmero de espermatozoides mviles por mililitro) y
dejar en el incubador a 37C hasta el momento de su utilizacin.
Ilustracin16. Esquemas grficos de los principales mtodos de capacitacin para
recuperacin de espermatozoides mviles. A) Migracin por Swim-up directo: semen (en
blanco), medio (en gris oscuro). B) Migracin por Swim-down: semen (en blanco), medio (en
gris oscuro). C) Centrifugacin en gradientes de densidad: semen (en blanco), medio ms
denso (en gris oscuro), medio menos denso (en gris claro)
7.5.4. Mtodo de filtrado
Esta tcnica se basa en el hecho de que los espermatozoides muertos o con importantes
disrupciones de membrana presentan una clara tendencia a la absorcin a determinados
materiales (fibra de vidrio, partculas de vidrio, etc.). Aprovechando esto pueden construirse
columnas de lana de vidrio que permitan filtrar a los espermatozoides obtenindose la fraccin
de clulas viables. Se realiza mediante una malla de fibra de vidrio en porciones de 15-20mg que
situamos en el interior de una jeringa de insulina hasta la divisin 0,06ml. A continuacin
lavamos el filtro con 2-3ml de medio para eliminar las partculas de fibra de vidrio que pudieran
estar libres y procedemos a filtrar aproximadamente 500l del semen en fresco o previamente
lavado. Despus del filtrado lavaremos el filtro de nuevo con 200-300l de medio de cultivo para
liberar los espermatozoides de buena calidad que pudieran quedar en el. Sin embargo se ha
indicado que las columnas de lana de vidrio podran daar las membranas de la cabeza de los
espermatozoides y de pequeas contaminaciones de fragmentos de fibra de vidrio.
Capacitacin del semen
107
Valoracin de los resultados 7.6
Una vez terminada la tcnica hay que calcular el porcentaje de espermatozoides con movilidad
progresiva y realizar el recuento de los mismos.
Los resultados se obtienen multiplicando el tanto por ciento de espermatozoides con movilidad
progresiva, por los millones de espermatozoides recuperados y por el volumen final. Se
expresar como millones de espermatozoides recuperados con movilidad progresiva. Si el semen
se va a utilizar para inseminacin artificial se informar como millones inseminados y se
calcularn multiplicando por el volumen inseminado. En caso de utilizar parte del volumen
eyaculado, los resultados deben expresarse en funcin del volumen utilizado, y multiplicarse por
el factor de correccin.
La relacin del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el nmero de
espermatozoides mviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperacin y se calcula
con la siguiente frmula:
Porcentaje de recuperacin = [(VF x CF x REM) / (VU x CI x IEM)] x 100
VF= volumen final
CF= concentracin final de espermatozoides
REM= tasa de espermatozoides con movilidad progresiva recuperados
VU= volumen semen utilizado
CI= concentracin inicial de espermatozoides
IEM=tasa de espermatozoides con movilidad progresiva en el eyaculado
Para el correcto desarrollo de este proceso se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:
o Utilizar siempre material estril.
o Deben utilizarse pipetas Pasteur en lugar de agujas para aspirar espermatozoides.
o La preparacin del semen debe comenzar no ms tarde de 30 minutos de la
eyaculacin, ya que la capacidad de fecundar el ovocito puede verse afectada.
o Aspirar siempre las diferentes fases en la zona de contacto con el tubo, donde se
forma el menisco, para no alterarlas. No mezclar plasma seminal con los
espermatozoides recuperados, puede impedir la capacitacin.
o Si el semen preparado va ser utilizado para inseminacin artificial, deber usarse lo
antes posible.
o Diluir muy lentamente el semen descongelado.
o Centrifugar siempre a los g recomendados.
o FCR = 1,118 x 10
-5
x R [cm] x V
2
[rpm]
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
108
Conclusiones 7.7
El papel de los parmetros seminales como factor pronstico en la fertilidad masculina est
actualmente sometido a debate. Se ha propuesto el test de recuperacin de espermatozoides
mviles (REM) en el estudio de la pareja estril como prueba para distinguir qu parejas se
beneficiarn de la inseminacin artificial y cules no, porque incluye la concentracin, la
movilidad as como los efectos del procesamiento de los espermatozoides.
Es difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar
inseminaciones intratero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Los niveles umbral en los
distintos trabajos oscilan desde 0,8 a 5 millones. No se ha podido identificar un umbral ptimo
de REM que permita aconsejar a las parejas. Se requieren estudios adicionales para evaluar la
capacidad predictiva del REM en los estudios de fertilidad. Algunos autores proponen que cada
centro establezca su punto de corte en funcin de datos clnicos y de laboratorio de cada centro.
De las tcnicas de capacitacin anteriormente descritas las ms utilizadas en los laboratorios por
su simplicidad y eficacia son el Swim-up y los gradientes de densidad. Aunque no existe
evidencia cientfica para recomendar una tcnica de preparacin de semen, las ventajas de cada
uno de estos mtodos se recogen en la tabla 10.
MTODOS DE MIGRACIN
(SWIM-UP)
MTODO DE CENTRIFUGACIN
(GRADIENTES)
o Proceso fisiolgico.
o La muestra capacitada queda ms limpia.
o Es independiente del volumen del eyaculado.
o Mayor capacidad de recuperacin.
o Buenos resultados con muestras pobres o
congeladas.
o Menor tiempo para su realizacin.
Tabla 10. Ventajas de los mtodos de capacitacin ms empleados
Una revisin Cochrane (Boomsma, Heineman, Cohlen & Farquhar, 2007) sobre las diferentes
tcnicas de preparacin de semen concluye:
o En cuanto a resultados clnicos (tasa de embarazo/tasa de recin nacidos vivos), no
hay evidencia cientfica suficiente para recomendar una tcnica de preparacin de
semen, al considerar resultados de los ensayos cuasialeatorios, la tcnica de
gradientes de densidad puede parecer mejor, pero necesita confirmarse con ensayos
clnicos aleatorios.
o Respecto a los parmetros seminales tras la preparacin de semen, la tcnica de
gradientes parece mejor en cuanto a concentracin de espermatozoides y a tasa de
recuperacin de espermatozoides mviles, mientras que la tcnica de Swim up
recupera los espermatozoides con mejor movilidad, y en cuanto a la morfologa no se
encontraron preferencias. En trminos generales la tcnica de gradientes puede
parecer superior, aunque debe confirmarse con ensayos clnicos de calidad.
Capacitacin del semen
109
MUESTRA PARMETRO MTODO
S
e
m
e
n
c
r
i
o
p
r
e
s
e
r
v
a
d
o
(
-
1
9
6
C
)
e
n
p
a
j
u
e
l
a
Pretra-
tamiento
o Descongelacin
2-3, 37C
5, 10C-20C
o Retirada del agente crioprotector
Desinfeccin de pajuela y trasvase a tubo
1/5: semen/medio lavado, 10!
o Evaluacin de Eficiencia
C
PR
= (%PR x C) / 100
S
e
m
e
n
r
e
c
i
e
n
t
e
(
3
0
x
i
m
o
)
e
n
c
o
n
t
e
n
e
d
o
r
d
e
p
l
s
t
i
c
o
o
v
i
d
r
i
o
.
Lavado
o 1/5 o 1/10: semen/medio cultivo
o Homogenizar, centrifugar: 500g, 10
o Sedimento + 0,5 ml medio cultivo
o 37C 20-30
Migracin
Swim-up
Swim-down
Directo Convencional
Reparto en n tubos:
(250l semen)abajo
(500l medio)arriba
Lavado:
1/1: semen/medio
Centrifg: 500g, 10
Sed+500l medio
Reparto en n tubos:
(500l medio)abajo
(250l semen)arriba
Incubacin:
37C, 45 inclinado
30-60
Incubacin:
37C, 45 inclinado
30-60
Incubacin:
37C, 45 inclinado
30-60
Recuperacin:
Vn: (capa d arriba)x n
Si Vn>500l
Morfolg, Recuento
Recuperacin:
Coger capa d arriba
Si Vn>500l
Morfolg, Recuento
Recuperacin:
Vn: (capa d abajo)x n
Si Vn>500l
Morfolg, Recuento
Centrifugacin:
500g, 10
Centrifugacin:
500g, 10
Centrifugacin:
500g, 10
Sed+300-500l medio
37C
Sed+300-500l med
37C
Sed+300-500l med
37C
Tabla 11. Procedimiento de laboratorio para la capacitacin del semen
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
110
MUESTRA PARMETRO
MTODO
S
e
m
e
n
d
e
s
c
o
n
g
e
l
a
d
o
e
n
t
u
b
o
Gradientes
de densidad
o Reparto en n tubos:
1. 0,5-1 ml medio 40%-45% (intermedio)
2. 0,5-1 ml medio 80%-90% (abajo)
3. 1,5 ml semen (arriba)
o Centrifugacin en gradientes: 300g, 20
o Recuperacin: (sedimento) x n + 1,2 ml medio
o Centrifugacin: 500g, 10
o Sedimento + 300-500 l medio
o Movilidad y recuento
o 37C
S
e
m
e
n
r
e
c
i
e
t
e
Filtracin
o Lavado: jeringa con filtro + 2-3 ml medio
o Filtrado: jeringa con filtro + 500 l semen
o Recuperacin: jeringa con filtro + 2-3 ml medio
Eficiencia de
la
capacitacin
Porcentaje de recuperacin =
[(VF x CF x REM)/(VU x CI x IEM) ]x 100
Tabla 11 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la capacitacin del semen
Spz: espermatozoides. CSF: factor de criosupervivencia. PR: mviles progresivos. Vn: volumen
total de los n tubos. VF=volumen final. CF=concentracin final de espermatozoides. REM= tasa de
espermatozoides con movilidad progresiva recuperados. VU=volumen semen utilizado.
CI=concentracin inicial de espermatozoides. IEM=tasa de espermatozoides con movilidad
progresiva en el eyaculado
Informe del laboratorio
111
Captulo 8
Informe del laboratorio
Digirido a: es responsabilidad del clnico y no del laboratorio el comunicar los resultados del
anlisis del semen a sus pacientes. El informe del laboratorio ha de ir dirigido al clnico
solicitante.
Datos que ha de incluir
El informe de laboratorio debe de incluir los siguientes apartados:
o Nombre
o Identificacin laboratorio
o Nmero Historia clnica
o Fecha de obtencin de la muestra
o Periodo de abstinencia
o Volumen
o Resultados
o Valores de referencia
o Comentarios
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
112
Resultados 8.1
Tal y como hemos visto en cada parmetro, se ha de tener en cuenta lo siguiente:
o Los resultados se han de expresar con sus unidades correspondientes.
o Siempre que sean recuentos (de espermatozoides o clulas no espermticas) se
expresarn con el ndice de Confianza del 95% entre los dos contajes y el error
asociado si fuese mayor del 5%:
o <200 /subcmara ES>5%
o <25,>0 /subcmara %ES=Sensibilidad del mtodo
o 0 ES=95%
Se procurarn emplear las frases de expresin recomendadas por la OMS.
o Coherencia entre los resultados:
o El porcentaje de vitalidad no puede ser inferior al porcentaje de
espermatozoides mviles.
o Ante porcentajes de vitalidad prximos a cero con recuentos de
espermatozoides altos, lo primero que se ha de descartar es que no haya habido
un error en la fase preanaltica.
o Un alto porcentaje de anticuerpos antiespermatozoides se ha de acompaar de
un movimiento progresivo bajo y/o alto grado de aglutinacin.
Valores de referencia 8.2
En la ltima edicin del Manual de la OMS en lugar de hablar de valores de referencia, se habla
de Lmites inferiores de Referencia (tabla 12):
o Que incluye al 95% de los individuos de referencia con valores superiores al percentil
5, y no en torno al percentil 50 como hasta ahora se haba considerado en los valores
de referencia del espermiograma.
o En una poblacin compuesta por hombres con fertilidad reciente, pertenecientes a
parejas que han obtenido el embarazo en un tiempo inferior o igual a 12 meses.
Es conveniente aclarar que los lmites inferiores de referencia no son valores de referencia de
esterilidad o fertilidad:
o Ya que ni son los valores mnimos que se necesitan para lograr un embarazo, pues
habr muchos varones con valores superiores que no puedan conseguir un embarazo
por causas estrictamente femeninas o por factores que no se ponen en evidencia en
los parmetros del seminograma.
Informe del laboratorio
113
o Ni valores inferiores suponen necesariamente padecer esterilidad o subfertilidad, de
hecho el percentil 5 de los valores frtiles estudiados tiene valores seminales
inferiores a dichos lmites.
Los valores de referencia deben interpretarse conjuntamente con la informacin clnica para
poder sacar algunas conclusiones.
Adems, puede haber diferencias regionales en la calidad del semen, y entre laboratorios. Estos
laboratorios debern considerar la preparacin de sus propios valores de referencia.
VALORES DE REFERENCIA DE LOS PARMETROS MACROSCPICOS DEL SEMEN
PARMETRO VALOR
Licuefaccin < 60
Viscosidad 2 cm
Apariencia homogneo, gris opalescente
pH 7,2
Agregacin Sin inters
Aglutinacin No concluyente
LMITES INFERIORES DE REFERENCIA DEL ESPERMIOCITOGRAMA
PARMETRO VALOR IC 95%
Volumen (ml) 1,5 1,4-1,7
Concentracin spz (10
6
/ml) 15 12-16
Espermatozoides totales (10
6
/E) 39 33-46
Movilidad total (%) 40 38-42
Movilidad progresiva (%) 32 31-34
Vitalidad (%) 58 55-63
Morfologa normal (%) 4 3-4
Concentracin leucocitos 10
6
/ml) <1 -
Anticuerpos antiespermatozoides (%) < 50% -
VALORES DE REFERENCIA DE LOS PARMETROS BIOQUMICOS DEL PLASMA SEMINAL
PARMETRO PERCENTIL 10 PERCENTIL 5
Citrato (mol/E) >60 -
Zinc (mol/E) >3 2,4
Fosfatasa cida (UI/E) >1234 -
-1,4 Glucosidasa neutra (mUI/E) >59 20
L-Carnitina (nmol/E) >654
(a)
o >390
(b)
-
Fructosa (mol/E) > 59 13
IC: Intervalo de confianza .E: Eyaculado (a): cintica enzimtica (b): colorimetra
Tabla 12. Valores y lmites de referencia
o Se considera una eficiencia de criopreservacin ptima un valor de CSF50% junto
con una movilidad total de 30% con 25% de movilidad progresiva.
o La eficiencia de recuperacin de espermatozoides mviles del Swim up suele ser
<20%, mientras que la de la centrifugacin en gradiente de densidad > 20%.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
114
Comentarios 8.3
Conclusin
PARMETRO RESULTADO INFORME
VOLUMEN
NORMAL Normospermia
ALTO Hiperespermia
BAJO Hipoespermia
AUSENCIA Aspermia
RECUENTO
NORMAL Normozoospermia
ALTO Polizoospermia
BAJO Oligozoospermia
AUSENCIA Azoospermia
AUSENCIA en fresco y
PRESENCIA en el sedimento
Criptozoospermia
MOVILIDAD BAJO Astenozoospermia
MORFOLOGA BAJO Teratozoospermia
VITALIDAD BAJO Necrozoospermia
COMBINACIONES:
BAJOS
Recuento Oligo-
Movilidad asteno-
Morfologa terato-
zoospermia
OTROS ELEMENTOS FORMES
HEMATES Hemos o Hematospermia
LEUCOCITOS Leucos, Leucocito o Piospermia
Tabla 13. Nomenclatura de la calidad del esperma
A modo de resumen, el analista puede incluir un comentario sobre la calidad del esperma en
funcin de los resultados cuantitativos del espermiograma, para lo cual se ha de emplear la
terminologa adecuada: permia se refiere al eyaculado; y zoospermia se emplea para
referirse a los espermatozoides. Tabla 13.
Orientacin diagnstica
Azoospermia
Las determinaciones hormonales, en particular la de FSH plasmtica y los marcadores
bioqumicos, la medida del volumen y el pH del plasma seminal, son esenciales para orientar el
diagnstico hacia una azoospermia secretora de origen testicular o antehipofisaria o hacia un
azoospermia excretora debido a una obstruccin o un agenesia de los conductos genitales.
o La FSH plasmtica permite explorar el eje gonadotropo y orientar hacia una etiologa
pretesticular y testicular.
o La L-carnitina y la -1,4glucosidasa seminales permiten explorar todo el tracto a partir
de los cuerpos del epiddimo porque son los marcadores ms significativos.
Informe del laboratorio
115
Ilustracin17. Algoritmo diagnstico de la azoospermia
o Si la FSH est disminuida, puede tratarse de un hipogonadismo hipogonadotrfico. La
anomala es pues de origen endrocrinopretesticular, la testosterona estara tambin
disminuida y los marcadores bioqumicos seran normales o bajos. Es una anomala
rara, curable con tratamiento hormonal.
o Si la FSH est aumentada con una L-carnitina y una 1,4 glucosidasa normales, el
origen es testicular y es una azoospermia secretoria. Esto representa cerca del 70% de
las azoospermias. La elevacin de la concentracin de FSH es proporcional al grado de
afeccin testicular. Las etiologas son numerosas: el sndrome de Klinefelter, los
defectos de maduracin de la lnea germinal, la criptorquidia, las secuelas infecciosas,
las lesiones traumticas o trmicas. Ciertas azoospermias secretoras tienen, sin
embargo, una tasa de FSH normal que complica as su diagnstico.
o Si el FSH es normal con un L-carnitina y una 1,4 glucosidasa baja, se denomina
azoospermia excretoria. Es debida a una obstruccin o una agenesia del tracto
genital.
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
116
La cuantificacin de otros marcadores (fructosa) permitir situar el nivel de esta obstruccin.
o Si la fructosa es normal, se puede sospechar una oclusin del epiddimo o deferencial.
o Si la fructosa es baja con un volumen dbil de esperma y un pH cido, se puede
sugerir una oclusin de los conductos eyaculadores o una agenesia vesculo-
deferencial.
o Hay un caso difcil de diagnosticar, es la afeccin de la cabeza del epiddimo, ya que la
L-carnitina y el resto de marcadores no estn alterados.
En estas azoospermias excretorias, la ciruga se utiliza frecuentemente para confirmar la
topografa de la obstruccin y eventualmente quitarla.
Oligozoospermias
En las oligozoospermias, las determinaciones de los marcadores bioqumicos pueden orientar
hacia ciertas etiologas:
o Obstruccin unilateral: ciertos marcadores estn bajos;
o Prostatitis: la inflamacin provoca la compresin de los conductos excretorios, el
volumen est disminuido, el pH aumentado y todos los marcadores estn bajos. Hay
con frecuencia una leucospermia e incluso una alternancia oligo/azoospermia
(espermasfluctuantes).
Astenozoospermias
En ciertas astenozoospermias es interesante determinar la L-carnitina y la fructosa, porque su
disminucin puede estar en relacin con una disminucin de la movilidad del espermatozoide.
La fructosa es sintetizada en las clulas epiteliales de las vesculas seminales, por conversin a
partir de la glucosa sangunea. La diabetes conlleva un falso aumento de la fructosa seminal
y puede, por ejemplo, disfrazar una bajada de este parmetro.
Otras anomalas
Los marcadores bioqumicos pueden estar alterados en los varicoceles, en los sujetos VIH...
En resumen, la exploracin completa y escrupulosa de la esterilidad y subfertilidad masculinas es
esencial. El espermiograma es un examen primordial, la bioqumica del plasma seminal lo
completa: permite explicar ciertas anomalas, en particular las azoospermias obstructivas.
El diagnstico exacto de la causa de esterilidad y subfertilidad masculinas es el resultado de un
proceso pluridisciplinar, pudiendo recurrir a numerosos exmenes complementarios ms o
menos complejos. Es muy importante, ya que condiciona la eleccin de un tratamiento o de una
tcnica de procreacin mdicamente asistida.
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Captulo 9
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http://www.micropticsl.com/esp/productos/analisis_esperma_sca.html
Sobre los autores
120
Sobre los autores del libro
M Jos Lpez Garca
Doctora en Farmacia
Facultativa especialista en Anlisis Clnicos
Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir
lopezmjose.68@gmail.com
Aurora Urbano Felices
Tcnico Especialista de Laboratorio
Hospital Infanta Margarita. Cabra
Servicio Andaluz de Salud
felices70@hotmail.com
Marta Crdenas Povedano
Tcnico Especialista de Laboratorio
Hospital de Montilla
Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir
martacar22@gmail.com
Sobre los revisores
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Sobre los revisores del libro
Javier M Gutirrez Romero
Licenciado en Farmacia.
Facultativo especialista en Anlisis Clnicos.
Responsable de reproduccin asistida de la UGC Laboratorios Clnicos.
Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz.
javier.gutierrez.sspa@juntadeandalucia.es
Iratxe Lpez Pelayo
Licenciado en Farmacia.
Facultativo especialista en Anlisis Clnicos.
UGC Laboratorios.
Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz.
iratxelp@yahoo.es