110 Bioquimia

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Artculo original
Qumica clnica
Preparacin y evaluacin de un equipo de
reactivos para la determinacin de glucosa
(glucosa oxidasa/peroxidasa)
Martha Prez-Espi noza,* Eduardo Brambi l a*
* Laboratorio de Investigaciones Qumico Clnicas, Facultad de
Ciencias Qumicas, Benemrita Universidad Autnoma de
Puebla. Puebla, Pue. Mxico.
Correspondencia:
D.C. Eduardo Brambila
Laboratorio de Investigaciones Qumico Clnicas, Fac. de Ciencias
Qumicas, BUAP. Gral. Pedro Hinojosa Nm. 17. Lomas de Loreto.
72260. Puebla, Pue. Mxico. e-mail: ebrambil@ siu,buap.mx
Recibido: 02-09-2005
Aceptado: 7-11-2005
RESUMEN
Este tr abajo descr i be l a pr epar aci n y eval uaci n de un equi po
de r eacti vos par a l a deter mi naci n de gl ucosa pl asmti ca por
el mtodo de Tr i nder . La eval uaci n i ncl uy l a deter mi naci n
de l i neal i dad, pr eci si n i ntr a- e i nter -d a, el estudi o del efecto
de i nter fer entes, r ecobr o y compar aci n de mtodos par a esti -
mar el er r or anal ti co total . Los r esul tados mostr ar on que el
mtodo fue l i neal hasta 400 mg/dL, adems de tener una exce-
l ente pr eci si n, con coefi ci entes de var i aci n i nter - e i ntr a-d a
de 0.67% y 1.13% r especti vamente. La deter mi naci n de gl u-
cosa sl o fue afectada por heml i si s e i cter i ci a muy i ntensa,
as como por el evadas concentr aci ones de ci do ascr bi co. Di -
fer entes canti dades de gl ucosa aadi das a l as muestr as fuer on
r ecobr adas al 100%. La compar aci n del equi po de r eacti vos
con el mtodo de l a hexoci nasa mostr una el evada cor r el aci n
(r = 0.996), si n embar go, l os r esul tados fuer on apr oxi mada-
mente 5 mg/dL menor es a l os de l a hexoci nasa. El er r or total
del mtodo (5.8 mg/dL) a un ni vel de deci si n mdi ca de 120
mg/dL, fue menor al establ eci do como estndar de cal i dad
anal ti ca (10 mg/dL). Los l mi tes de r efer enci a esti mados a
par ti r de un gr upo de i ndi vi duos sel ecci onados fuer on de 67 a
111 mg/dL. Con base en estos r esul tados podemos afi r mar que
el equi po de r eacti vos el abor ado en nuestr o l abor ator i o ti ene
l a cal i dad anal ti ca par a ser empl eado como una her r ami enta
confi abl e en el anl i si s de gl ucosa pl asmti ca.
Palabras clave: Gl ucosa r eacti vos, l i neal i dad, pr eci si n,
exacti tud, eval uaci n de mtodos, compar aci n de mtodos, l -
mi tes de r efer enci a, er r or total , estndar es de cal i dad.
ABSTRACT
I n thi s work we descri be the elaborati on and evaluati on of a
glucose ki t based i n the Tri nder method. Glucose ki t evalua-
tion included studies of linearity, within-run and between-day
preci si on assays, recovery, and method compari son to deter-
mine total error of the kit. Results showed that the kit was li-
near up to 400 mg/dL, in addition it had an excellent precision
wi th wi thi n-run and between-day coeffi ci ents of vari ati on of
0.67% and 1.13%, respectively. Glucose kit was affected only by
high haemoglobin and bilirubin concentrations, and high le-
vels of ascorbic acid. Addition of several glucose amounts to the
samples was 100% recovered. Method compari son studi es u-
si ng the hexoci nase method as a reference method shown a
highly correlation (r = 0.996), but, results were approximately
5 mg/dL lower i n the glucose ki t prepared i n our laboratory.
Total error in our method (5.8 mg/dL) was acceptable as com-
pared wi th the maxi mum al l owabl e error to gl ucose assays
(10 mg/dL). Reference li mi ts obtai ned from selected i ndi vi -
duals were 67 to 111 mg/dL. Based i n these results we state
that the glucose kit prepared in our laboratory has the analytic
quality to be used for plasma glucose determinations.
Key wor ds: Glucose kit, linearity, precision, bias, method eva-
luation, method comparison, reference limits, total error, qua-
lity standards.
INTRODUCCIN
La deter mi naci n de l a concentr aci n de gl ucosa en
pl asma o suer o consti tuye una de l as deter mi naci o-
nes ms fr ecuentemente r eal i zadas por l os l abor ato-
r i os cl ni cos en el mundo.
Los mtodos para l a determi naci n cuanti tati va de
glucosa en los lquidos biolgicos tienen su origen en el
siglo XI X, con la aparicin del reactivo de Fehling para
l a determi naci n de carbohi dratos.
1
Tomando como
Preparacin y evaluacin de un equipo de reactivos para la determinacin de glucosa
111 Volumen 30 No. 4 Octubre-Diciembre 2005. p. 110-117
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:rop odarobale FDP
VC ed AS, cidemihparG
arap
acidmoiB arutaretiL :cihpargideM
sustradode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
sustradode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
cihpargidemedodabor
base las caractersticas reductoras de los carbohidratos,
a pri nci pi os del si gl o XX se desarrol l aron una seri e de
mtodos fundamentados en reacci ones de xi do reduc-
cin, los cuales incluan una primera reaccin de reduc-
cin de Cu++ a Cu+, seguida por la reduccin de dife-
rentes compuestos por el Cu+ para producir productos
col oreados que se med an por col ori metr a. Con este
fundamento aparecieron los mtodos de Benedict,
2
Fo-
l i n y Wu,
3
Nel son y Somogyi
4
y el mtodo de l a reduc-
cin del ferricianuro
5
siendo el primer mtodo automa-
ti zado para l a determi naci n de gl ucosa.
6
Debi do a l a
falta de especificidad de los mtodos de xido-reduccin
7
se hi zo necesari o desarrol l ar mtodos ms espec fi cos,
como l os mtodos de l a o-tol ui di na y sus modi fi caci o-
nes,
8,9
antrona,
10
etc. Estas determinaciones, introduci-
das entre los aos 40 y 50 fueron empleadas por un gran
nmero de l aboratori os durante casi 20 aos, si n em-
bargo, debido a la elevada toxicidad de los reactivos y la
dificultad para automatizarlos, los mtodos de conden-
sacin fueron reemplazados paulatinamente por mto-
dos basados en el uso de enzimas como reactivos, menos
txicos y fciles de automatizar. El mtodo de la glucosa
oxidasa, fue uno de los primeros ensayos en ser aplica-
dos para la evaluacin rutinaria de un gran nmero de
especmenes.
11
En la actualidad, debido a sus caracters-
ti cas anal ti cas y su bajo costo, si gue si endo el mtodo
de el ecci n por l a mayor a de l os l aboratori os cl ni cos.
En adicin a este mtodo, aparecieron mtodos basados
en el uso de otras enzimas como la hexocinasa
12
(Passey
y cols., 1977) y la glucosa deshidrogenasa.
7
Actualmente
el mtodo de la hexocinasa es considerado como el mto-
do de referencia por su elevada especificidad, gran sensi-
bilidad, as como por su excelente precisin y exactitud.
Reci entemente, en el l abor ator i o de i nvesti gaci o-
nes qu mi co cl ni cas de l a Facul tad de Ci enci as Qu -
mi cas de l a Benemr i ta Uni ver si dad Autnoma de
Puebl a, hemos i ni ci ado un pr oyecto encami nado a l a
pr epar aci n de "equi pos de r eacti vos" par a l as deter -
mi naci ones ms fr ecuentes en el r ea de l a qu mi ca
cl ni ca. En este ar t cul o descr i bi mos l a el abor aci n
del mtodo par a l a deter mi naci n de gl ucosa descr i to
por Tri nder, as como l a eval uaci n de este mtodo de
acuer do a l os estndar es de cal i dad vi gentes y l a ob-
tenci n de l mi tes de r efer enci a a par ti r de un gr upo
de i ndi vi duos r epr esentati vos de l a pobl aci n.
MATERIAL Y MTODOS
Enzimas y reactivos
Las enzi mas y r eacti vos empl eados par a l a pr epar a-
ci n del equi po de r eacti vos, fuer on obteni dos de l a
casa comer ci al Si gma-Al dr i ch Qu mi ca, (Tol uca,
Mxi co); l os cual es i ncl uyer on: gl ucosa oxi dasa (EC
1.1.3.4) y peroxidasa de rbano (EC 1.11.1.7), 4-ami no-
fenazona, fenol , gl ucosa y tween 20. Los reacti vos uti -
l i zados par a l a pr epar aci n de l os amor ti guador es
fuer on gr ado anal ti co.
Reaccin y composicin del equipo
de reactivos
13
La medi ci n de gl ucosa en l as muestr as se bas en l a
si gui ente r eacci n:
CH OH
2
H O
2
+ O
2
+
O
H O
2 2
cido glucnico +
Glucosa
oxidasa
H O
2 2
+
+
OH
CH
3
H
3
C
NH
2
O
N
N
Fenol
4-Aminofenazona
4(p-benzoquinona
imino) aminofenazona
Peroxidasa
CH
2
H
2
C N
O
N
N
O
Martha Prez-Espinoza y col. MG
112 Bioquimia
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Amortiguador de fosfatos 100 mmol/L pH
7.0. A 800 mL de agua desti l ada se agr egar on 12.95 g
de fosfato di sdi co di hi dr atado, 4.95 g de fosfato de
potasi o anhi dr o y 0.5 g de azi da de sodi o. Los r eacti -
vos se di sol vi er on, se ajust a un pH de 7.0 y l a sol u-
ci n se l l ev a un vol umen fi nal de 1 L.
Reactivo de color. A 100 mL del amor ti guador
de fosfatos se aadi er on 16 mg de 4-ami nofenazona,
1,800 U de gl ucosa oxi dasa (EC 1.1.3.4), 100 U de pe-
r oxi dasa (EC 1.11.1.7), 105 mg de fenol y 50 L de
tween 20.
Estndar de glucosa. Para l a cal i braci n del m-
todo se pr epar un estndar de gl ucosa con una con-
centr aci n de 1 g/L en sol uci n de ci do benzoi co al
0.1%. A par ti r de esta sol uci n se pr epar ar on estn-
dar es i ndi vi dual es par a l a eval uaci n de l a l i neal i dad
del mtodo y estndar es de tr abajo con una concen-
tr aci n de 100 mg/dL. Adi ci onal mente, par a cal i br a-
ci n del mtodo se empl e un estndar tr azabl e de
gl ucosa con una concentr aci n de 100 mg/dL (Si gma-
Al dr i ch Qu mi ca, Tol uca, Mxi co).
Procedimiento y clculos. A 1.0 mL de r eacti vo
de col or se adi ci onar on 10 !L de suer o, estndar o
agua par a pr epar ar l os pr obl emas, estndar es o bl an-
co r especti vamente. Las mezcl as de r eacci n se i ncu-
bar on dur ante 10 mi n a 37C y se r eal i zar on l as l ec-
tur as espectr ofotomtr i cas de l os pr obl emas y
estndares a 510 nm, cal i brando el espectrofotmetro
contr a el bl anco de r eacti vos. Par a este estudi o se
empl e un espectr ofotmetr o UV/VI S Lambda EZ
150 (Per ki n El mer , Mxi co).
El cl cul o de l a concentr aci n de l os pr obl emas se
deter mi n di vi di endo el val or de l a absor ci n del pr o-
bl ema entr e el estndar , y el r esul tado se mul ti pl i c
por l a concentr aci n del estndar .
Evaluacin del mtodo
14
Linealidad. La l i neal i dad del mtodo se deter mi n
medi ante l a cuanti fi caci n de estndar es de gl ucosa
con concentr aci ones de 50 a 1,000 mg/dL. El estudi o
se r eal i z por tr i pl i cado.
Variabilidad intra-da e inter-da. La vari abi l i -
dad i ntra-d a se determi n medi ante l a esti maci n del
CV analizando 20 veces, en un mismo da de trabajo, un
suero de control con concentraciones de glucosa cerca-
no al nivel de decisin mdica (110 mg/dL). De igual for-
ma, l a vari abi l i dad i nter-d a se determi n medi ante l a
esti maci n del CV, anal i zando durante 20 d as sucesi -
vos la concentracin de glucosa en el suero de control.
Interferentes. Par a eval uar el efecto i nter fer en-
te de ci er tas sustanci as en l a deter mi naci n de gl uco-
sa, se pr epar ar on muestr as medi ante l a adi ci n de di -
fer entes canti dades de hemogl obi na, bi l i r r ubi na, ci -
do ascr bi co y l os anti coagul antes ci tr ato de sodi o,
oxal ato de sodi o y EDTA-di sdi co (Cuadro I ). Adi ci o-
nal mente se pr epar ar on muestr as con di fer entes can-
ti dades de l pi dos, obteni endo as muestr as con l i pe-
mi a l i ger a, moder ada e i ntensa. Par a cada muestr a
con el i nterferente (probl ema) se prepar un tubo con
l a concentr aci n basal de gl ucosa si n el i nter fer ente
(testi go). Las muestr as se anal i zar on por tr i pl i cado, y
l a di fer enci a entr e l os tubos testi go y pr obl ema se
atr i buy al i nter fer ente.
Recobro. Los estudi os de r ecobr o se r eal i zar on
adi ci onando canti dades conoci das de gl ucosa a una
muestra. Para este estudi o en cada muestra se adi ci o-
n gl ucosa en concentr aci ones equi val entes a 100,
300 y 500 mg/dL. Los resul tados, obteni dos por tri pl i -
cado en cada muestr a, se expr esan en por centaje de
r ecobr o, el cual se obti ene di vi di endo l a concentr a-
ci n de gl ucosa medi da entr e l a canti dad de gl ucosa
aadi da por 100.
Comparacin de mtodos. El equi po de r eacti -
vos pr epar ado en el l abor ator i o se compar con un
Cuadro I. I nter fer entes del mtodo de deter mi naci n de
gl ucosa.
I nter fer ente
aadi do I nter fer enci a
(mg/dL en gl ucosa
Aspecto l a muestr a) (mg/dL)
Heml i si s
Leve 21 0.5
Moder ada 43 2.8
I ntensa 86 4.8
Muy i ntensa 172 7.2
I cter i ci a
Leve 2.5 0.2
Moder ada 5.0 1.8
I ntensa 10.0 -1.8
Muy i ntensa 20.0 -6.9
Li pemi a
Leve ND 1.3
Moder ada ND 3.3
I ntensa ND 4.8
ci do ascr bi co
2.5 -3.0
5.0 -14.5
Ci tr ato de sodi o
2.5 -2.3
Oxal ato de sodi o
2.0 2.8
EDTA-Na
2
2.0 1.0
ND. No deter mi nado
Preparacin y evaluacin de un equipo de reactivos para la determinacin de glucosa
113 Volumen 30 No. 4 Octubre-Diciembre 2005. p. 110-117
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equi po de r eacti vos comer ci al (SPI NREACT, Naucal -
pan, Mxi co), basado en el mi smo fundamento, as
como con el mtodo de r efer enci a de l a hexoci nasa
(Di agnosti c Chemi cal s Li mi ted, Pr i nce Edwar d I s-
l and, Canada). Par a este estudi o se empl ear on 60 es-
pec menes de paci entes con un i nter val o de concen-
tr aci ones de gl ucosa entr e 60 y 450 mg/dL. En cada
espci men se deter mi n si mul tneamente l a concen-
tr aci n de gl ucosa sr i ca con l os tr es mtodos y el
anl i si s estad sti co de l os r esul tados se r eal i z de
acuer do al pr ocedi mi ento pr opuesto por Westgar d y
Hunt,
15
empl eando l os pr ogr amas estad sti cos Mi cr o-
soft Excel 2003, Method Val i dator V. 1.1.10.0 y Cbs-
tat V. 4.2.1, medi ante l a cor r el aci n y r egr esi n de
Demi ng. Se consi der un val or de p < 0.05 como esta-
d sti camente si gni fi cati vo.
Estimacin de los errores del mtodo. Los
er r or es al azar y si stemti cos del equi po de r eacti vos
se cal cul ar on a par ti r de l os r esul tados de var i abi l i -
dad i nter -d a y de l os estudi os de compar aci n de m-
todos. El er r or total fue esti mado medi ante l a suma
de l os er r or es al azar y si stemti co.
14
Lmites de referencia
Seleccin de individuos de referencia. Par a
este estudi o se empl e una sel ecci n pr ospecti va
16
de 120 i ndi vi duos, de ambos sexos, cl ni camente sa-
nos con una edad compr endi da entr e l os 18 y 50
aos. Los cr i ter i os par a l a i ncl usi n, excl usi n y di -
vi si n de l os i ndi vi duos de r efer enci a se obtuvi er on
a par ti r de l a i nfor maci n r ecabada en un cuesti o-
nar i o apl i cado antes de l a obtenci n de l os espec -
menes. Los i ndi vi duos con antecedentes fami l i ar es
di r ectos de di abetes mel l i tus o al ter aci ones hor mo-
nal es fuer on excl ui dos como i ndi vi duos de r efer en-
ci a. De cada i ndi vi duo de r efer enci a se obtuvo un
espci men sangu neo, se separ el suer o e i nmedi a-
tamente se r eal i z l a deter mi naci n de l a concen-
tr aci n de gl ucosa.
Obtencin de los lmites de referencia. Los
r esul tados de l as deter mi naci ones de gl ucosa de l os
i ndi vi duos de r efer enci a sel ecci onados se tr atar on
estad sti camente de acuer do a l as r ecomendaci ones
de l a Feder aci n I nter naci onal de Qu mi ca Cl ni ca
17
con ayuda del pr ogr ama estad sti co Cbstat V. 4.2.1,
basado en l os pr ocedi mi entos NCCLS. Par a l a ob-
tenci n fi nal de l os l mi tes de r efer enci a se empl e
un mtodo par amtr i co, el cual contempl a l a tr ans-
for maci n de di str i buci ones no nor mal es a nor mal es
medi ante tr ansfor maci ones matemti cas de l os da-
tos or i gi nal es.
17
RESULTADOS
La figura 1 muestr a l a l i neal i dad del mtodo de de-
ter mi naci n de gl ucosa el abor ado en el l abor ator i o y
que fue obteni da al uti l i zar estndar es de gl ucosa con
concentr aci ones de 50 a 1,000 mg/dL. El mtodo fue
l i neal hasta una concentr aci n de 450 mg/dL, a con-
centr aci ones mayor es el mtodo mostr una desvi a-
ci n de l a l ey de Lamber t-Beer haci a val or es ms ba-
jos. Por l o tanto, l as muestr as con concentr aci ones
mayor es a 450 mg/dL de gl ucosa se di l uyer on con so-
l uci n sal i na y despus de r epeti r l a deter mi naci n,
l os r esul tados se mul ti pl i car on por el factor de di l u-
ci n cor r espondi ente.
El coefi ci ente de var i aci n (CV), obteni do de l os
r esul tados de 20 deter mi naci ones de gl ucosa r eal i za-
das en una mi sma muestr a, en un d a de tr abajo, fue
de 0.67%, mi entr as que el CV de 20 deter mi naci ones
de gl ucosa r eal i zadas en 20 d as consecuti vos en l a
mi sma muestr a fue de 1.13%.
Los r esul tados de l a concentr aci n sr i ca de gl uco-
sa con l a pr esenci a de di fer entes i nter fer entes se
muestr an en el cuadro I . La heml i si s y l i pemi a pr o-
dujeron una i nterferenci a posi ti va, que fue proporci o-
nal a l a canti dad de heml i si s o l i pemi a pr esente, 100
mg/dL de hemogl obi na y una l i pemi a i ntensa (esti ma-
da vi sual mente) pr odujer on un i ncr emento apar ente
de gl ucosa de 4.2 y 4.8 mg/dL, respecti vamente. La i c-
teri ci a mostr una i nterferenci a negati va que fue pro-
por ci onal a l a canti dad de bi l i r r ubi na pr esente en l a
muestr a, l a pr esenci a de 20 mg/dL de bi l i r r ubi na se
vi o r efl ejada en una di smi nuci n apar ente de gl ucosa
3
2
1
0
A
b
s
o
r
c
i

n
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Concentracin de glucosa (mg/dL)
1000
Figura 1 Figura 1 Figura 1 Figura 1 Figura 1. Linealidad del mtodo. La absorcin del producto de
la reaccin se determin a 500 nm. Las diferentes concentra-
ciones de glucosa se obtuvieron a partir de la dilucin de un
estndar con una concentracin de 1 g/dL.
Martha Prez-Espinoza y col. MG
114 Bioquimia
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temti ca a l os val or es or i gi nal es que i ncl uy una fun-
ci n exponenci al modul ar en dos etapas, esta tr ans-
for maci n per mi ti l a nor mal i zaci n de l os datos or i -
gi nal es.
17
Fi nal mente, con l os datos tr ansfor mados a
una di str i buci n nor mal se deter mi nar on l os l mi tes
de r efer enci a, l os cual es cor r espondi er on al i nter val o
de 65 a 111 mg/dL de gl ucosa.
DISCUSIN
Este tr abajo tuvo como objeti vo el abor ar un equi po
de reacti vos para l a determi naci n de gl ucosa pl asm-
ti ca basado en el mtodo descr i to por Tr i nder . Con l a
fi nal i dad de conocer l as car acter sti cas anal ti cas del
de 6.9 mg/dL. De i gual for ma, l a adi ci n de ci do as-
cr bi co a concentr aci ones de 5 mg/dL mostr una
fuer te i nter fer enci a negati va par a gl ucosa del or den
de l os 14.5 mg/dL. La pr esenci a de l os anti coagul an-
tes ci tr ato de sodi o, oxal ato de sodi o y EDTA-Na
2
no
mostr ar on i nter fer enci as si gni fi cati vas a l as concen-
tr aci ones fr ecuentemente usadas en l a pr epar aci n
de pl asma sangu neo.
El cuadro I I muestr a l os r esul tados de r ecuper a-
ci n del mtodo. El por centaje de r ecuper aci n des-
pus de l a adi ci n de 100 y 300 mg/dL de gl ucosa a
una muestr a de suer o fue cer cano al 100%, mi entr as
que l a r ecuper aci n despus de l a adi ci n de 500 mg/
dL, empl eando el mtodo si n modi fi car fue del 92.9%,
si n embar go al r eal i zar una di l uci n de l a muestr a,
l os resul tados de recuperaci n i ncrementaron al 97%,
poni endo de mani fi esto l a i mpor tanci a de conocer l a
l i neal i dad del mtodo.
Con l a fi nal i dad de eval uar l a exi stenci a de er r or es
si stemti cos, el mtodo el abor ado en el l abor ator i o se
compar con un mtodo comer ci al , basado en el mi s-
mo fundamento, as como con el mtodo de referenci a
de l a hexoci nasa. La compar aci n entr e el mtodo
el abor ado r especto al comer ci al mostr una excel ente
cor r el aci n (r = 0.999, p < 0.01), obteni ndose pr c-
ti camente l os mi smos r esul tados, l a di fer enci a pr o-
medi o entr e estos dos mtodos fue de 0.18 mg/dL de
gl ucosa (Figura 2). La compar aci n con el mtodo de
l a hexoci nasa tambi n mostr una el evada cor r el a-
ci n (r = 0.996, p < 0.01), si n embar go, el mtodo
el abor ado en el l abor ator i o pr esent una di fer enci a
si stemti ca constante del or den de 5.0 mg/dL r es-
pecto al mtodo de r efer enci a (Figura 3). El er r or to-
tal del mtodo a ni vel es de deci si n mdi ca de 50 y
120 mg/dL de gl ucosa fuer on de 5.7 y 4.7 mg/dL de
gl ucosa, r especti vamente.
El estudi o estad sti co de l os val or es de r efer enci a
obteni dos a par ti r de 120 i ndi vi duos cl ni camente sa-
nos mostr ar on una asi metr a y cur tosi s si gni fi cati va,
por l o que se requi ri apl i car una transformaci n ma-
Cuadro II. Estudi o de r ecobr o de gl ucosa.
Gl ucosa aadi da Gl ucosa r ecobr ada* Gl ucosa r ecuper ada
(mg/dL) (mg/dL) (% de r ecuper aci n)
100 100.6 100.5
300 301.2 100.4
500 464.5

92.9
500 485.0

97.0
* Pr omedi o de al menos 3 deter mi naci ones en cada ensayo;

gl ucosa
medi da si n modi fi caci n del mtodo;

gl ucosa medi da despus de r eal i zar
una di l uci n del espci men.
500
400
300
200
100
0
Equipo de
reactivos
b = 1.005
a = -0.83
r = 0.999
n = 60
0
Equipo
comercial
de reactivos
100 200 300 400 500
Fi gura 2 Fi gura 2 Fi gura 2 Fi gura 2 Fi gura 2. Anlisis de regresin de Deming entre el equipo de
reactivos y un equipo de reactivos comercial basados en el mis-
mo fundamento.
Preparacin y evaluacin de un equipo de reactivos para la determinacin de glucosa
115 Volumen 30 No. 4 Octubre-Diciembre 2005. p. 110-117
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mtodo (er r or i ntr nseco), ste fue eval uado par a es-
ti mar l os er r or es al azar y si stemti cos, y con base en
estndar es de cal i dad deter mi nar su aceptabi l i dad o
r echazo como una her r ami enta de anl i si s. Es de
gr an i mpor tanci a que l os mtodos par a deter mi na-
ci n de gl ucosa tengan una el evada preci si n y exacti -
tud,
18
ya que l os nuevos cr i ter i os par a el di agnsti co
de di abetes mel l i tus especi fi can como punto de cor te
un val or de 126 mg/dL,
19
l o que ha di smi nui do el i n-
ter val o de deci si n par a di sti ngui r entr e un val or
"nor mal " de gl ucosa y el val or di agnsti co de di abetes
mel l i tus.
La preparaci n de l os reacti vos empl eados para de-
ter mi naci n de gl ucosa se r eal i z tomando como base
el mtodo de Tr i nder .
13
Pr evi o a l a eval uaci n anal ti -
ca del equi po de r eacti vos se deter mi n l a l i neal i dad
del mtodo, l os r esul tados mostr ar on que ste ti ene
un i nter val o l i neal de 50 a 400 mg/dL de gl ucosa, r e-
sul tados que concuer dan con l os obteni dos en tr aba-
jos pr evi os.
20
Los estudi os de var i abi l i dad mostr ar on que el
equi po de r eacti vos pr esent una excel ente pr eci si n.
Mi entr as que este mtodo pr esent un CV i ntr a-d a
de 0.67% e i nter -d a de 1.13%, pr evi amente se ha des-
cr i to que l as deter mi naci ones de gl ucosa basadas en
el mtodo de Tr i nder muestr an CV i ntr a-d a que van
desde 0.9% a 1.9% e i nter -d a de 1.8% a 3.0%.
12,13,20
Con l a fi nal i dad de eval uar el efecto de i nterferentes
frecuentemente encontrados en el trabajo del l abora-
tori o cl ni co, a muestras sri cas se aadi eron di feren-
tes concentraci ones de hemogl obi na, bi l i rrubi na, l pi -
dos, ci do ascr bi co y anti coagul antes. Con base en
estudi os pr evi os de eval uaci n de mtodos,
12
se consi -
der que el i nter fer ente tuvo un efecto si gni fi cati vo
cuando su pr esenci a en l as muestr as pr odujo un cam-
bi o apar ente de l a concentr aci n de gl ucosa de al me-
nos 5 mg/dL. Sl o l a heml i si s muy i ntensa (172 mg/
dL de hemogl obi na) mostr una i nter fer enci a posi ti -
va en el mtodo, mi entr as que l a i cter i ci a muy i n-
tensa (20 mg/dL de bi l i r r ubi na) y l a pr esenci a de ci -
do ascr bi co (5 mg/dL), mostr ar on i nter fer enci as
negati vas si gni fi cati vas. Repor tes pr evi os han mos-
tr ado que el ci do ascr bi co
13,21
y l a bi l i r r ubi na
22
afectan negati vamente l a deter mi naci n de gl ucosa,
al par ecer l a i nter fer enci a por ci do ascr bi co es de-
bi da a su oxi daci n pr efer enci al sobr e el cr omgeno
4-ami nofenazona.
23
El efecto de l a bi l i r r ubi na es ms
compl ejo, se ha pr opuesto que sta es capaz de des-
tr ui r un i nter medi ar i o de l a r eacci n catal i zada por
l a per oxi dasa.
22
Ni nguna otr a sustanci a eval uada
mostr efectos i nter fer entes si gni fi cati vos en l a de-
ter mi naci n de gl ucosa.
Los estudi os de r ecuper aci n mostr ar on que el
equi po de r eacti vos pr esent r ecobr os cer canos al
100% cuando se aadi er on 100 y 300 mg/dL de gl uco-
sa a l as muestras. Despus de adi ci onar 500 mg/dL de
gl ucosa y real i zar el mtodo si n modi fi caci n, se obtu-
vo un r ecobr o del 92.9%, si n embar go, al r eal i zar l a
deter mi naci n en una muestr a di l ui da el val or de r e-
cobr o i ncr ement a un 97%, estos r esul tados mues-
tr an l a i mpor tanci a de conocer l a l i neal i dad del mto-
do y as evi tar er r or es si stemti cos.
La exacti tud del equi po de r eacti vos se eval u por
comparaci n con un equi po de reacti vos comerci al ba-
sado en el mi smo fundamento Tr i nder , as como con
el mtodo de l a hexoci nasa. El anl i si s de cor r el aci n
y r egr esi n de Demi ng mostr ar on que l os mtodos
500
400
300
200
100
0
0
Equipo de
reactivos
Mtodo de la
hexocinasa
100 200 300 400 500
b = 0.985
a = -6.5
r = 0.996
n = 60
Fi gura 3 Fi gura 3 Fi gura 3 Fi gura 3 Fi gura 3. Anlisis de regresin de Deming entre el equipo de
reactivos y el mtodo de referencia de la hexocinasa.
Martha Prez-Espinoza y col. MG
116 Bioquimia
edigraphic.com
basados en l a r eacci n de l a gl ucosa oxi dasa tuvi er on
una excel ente cor r el aci n (r = 0.999) y pr cti camen-
te l os mi smos r esul tados. Cuando se compar el equi -
po de r eacti vos con el mtodo de r efer enci a de l a
hexoci nasa, el anl i si s estad sti co mostr una el evada
cor r el aci n (r = 0.996), si n embar go, tambi n puso
de mani fi esto que l os mtodos basados en l a r eacci n
de l a gl ucosa oxi dasa/per oxi dasa dan r esul tados de
gl ucosa menor es (5 mg/dL en pr omedi o) a l os obteni -
dos con el mtodo de l a hexoci nasa. Este mi smo com-
por tami ento ha si do descr i to pr evi amente,
12,20,24
l a
magni tud de l as di fer enci as depende en gr an medi da
del cromgeno empl eado en l a reacci n catal i zada por
l a per oxi dasa.
25
De acuer do a l os cr i ter i os de Westgar d y col s.
(1974), l a deci si n de aceptar o r echazar un mtodo
como her r ami enta di agnsti ca se basa en l a compar a-
ci n del er r or del mtodo en estudi o con un estndar
de cal i dad o er r or per mi ti do. En gener al , l os estudi os
de eval uaci n per mi ten esti mar el er r or del mtodo a
un ni vel de deci si n mdi ca (ni vel es del metabol i to en
donde hay l a mayor pr obabi l i dad de i ncur r i r en un
er r or di agnsti co) par a as compar ar l o con un er r or
per mi ti do sel ecci onado. Si el er r or del mtodo es ma-
yor que el er r or per mi ti do, el mtodo no es aceptabl e
como her r ami enta di agnsti ca.
14
El er r or total esti -
mado par a el equi po de r eacti vos fue de 6.8 y 5.8 mg/
dL a l os ni vel es de deci si n mdi ca de 50 y 120 mg/dL
r especti vamente. Tomando como base un er r or per -
mi ti do de 10 mg/dL, de acuer do a l os er r or es per mi ti -
dos empl eados por Clinical Laboratory I mprovement
Amedments (CLI A-88) par a estos ni vel es de deci si n
mdi ca,
26
podemos asegur ar que el equi po de r eacti -
vos el abor ado en el l abor ator i o puede ser empl eado
como un mtodo confi abl e par a l as deter mi naci ones
de gl ucosa en ci r cul aci n.
Los er r or es si stemti cos de l os mtodos han tr ata-
do de ser mi ni mi zados medi ante di fer entes estr ate-
gi as, Wal ker y col s. (1982)
27
han empl eado l a adi ci n
o sustr acci n de una constante (equi val ente al er r or
si stemti co) a l os r esul tados de un mtodo de deter -
mi naci n de tr i gl i cr i dos. No obstante que esta "co-
r r ecci n" del er r or si stemti co ha si do adecuadamen-
te documentada, consi der amos que una estr ategi a
al ter nati va ms adecuada es l a deter mi naci n de l os
l mi tes de r efer enci a del mtodo, como ha si do r eco-
mendado por el panel de exper tos par a l a obtenci n
de val or es de r efer enci a de l a I FCC.
28
Como se mues-
tr a en l a secci n de r esul tados, l os l mi tes de r efer en-
ci a obteni dos a par ti r de un gr upo de i ndi vi duos de
r efer enci a fue de 65 a 111 mg/dL de gl ucosa, l a com-
par aci n de estos l mi tes con otr os r epor tados par a
l os mtodos de l a gl ucosa oxi dasa/per oxi dasa mues-
tran gran concordanci a,
25
si n embargo al compararl os
con l os l mi tes de r efer enci a par a gl ucosa obteni dos
con el mtodo de l a hexoci nasa (71 a 116 mg/dL), en-
contr amos que son mayor es en apr oxi madamente 5
mg/dL, di fer enci a que coi nci de con el er r or si stemti -
co deter mi nado par a el equi po de r eacti vos pr epar ado
en el l abor ator i o.
En concl usi n, el equi po de r eacti vos el abor ado en
el l abor ator i o muestr a una excel ente pr eci si n y una
exacti tud adecuada. La magni tud del er r or total del
mtodo, menor a l os estndar es de cal i dad o er r or es
per mi ti dos que son empl eados en nor mas i nter naci o-
nal es como CLI A88, nos per mi ten asegur ar que este
equi po de r eacti vos ti ene l a cal i dad anal ti ca par a ser
empl eado como una her r ami enta confi abl e en el an-
l i si s de gl ucosa pl asmti ca. Adi ci onal mente, l a esti -
maci n de l os l mi tes de r efer enci a pr opi os par a este
mtodo per mi te mi ni mi zar el er r or si stemti co de
este mtodo y adems di sponer de par metr os de
compar aci n pr opi os de l a pobl aci n en estudi o.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se real i z en el Laboratori o de I nvesti ga-
ci ones Qu mi co Cl ni cas de l a Facul tad de Ci enci as
Qu mi cas de l a BUAP, gr aci as al apoyo econmi co de
l a di r ecci n de esta facul tad.
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