122

ANEXO 1

Conteo en cmara de Neubauer.

Esta cmara se utiliza para conteo celular.

Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, esta debe
quedar centrada.
Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la
distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea
o con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser
continuo en un solo intento.
La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del
recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la
apariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones del
recuadro.

Conteo: Lleve la cmara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el
ocular de 4X. Observar lo siguiente.




123




Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias,
etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizar
de la siguiente manera:

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las
clulas presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las
esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio.

Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno
de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la
124


cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la
cmara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se
ve de la siguiente manera:



Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda
realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas
dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa
que hay tres lneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el
momento del conteo ya que definen cuales clulas son contables o cuales
estn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan la segunda lnea
son contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen. Grficamente
se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las clulas que tiene una X son
las que no se deben contar.
125





Despus de contar las clulas se procede a calcular la el numero de clulas
por unidad de volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio
ocupado por el lquido en el que estn las clulas que es el mismo espacio que
hay entre la cuadricula de la cmara y la laminilla de cuarzo.


Se promedia el nmero de esporas de la cmara de arriba con la de abajo, se
multiplica por el factor de dilucin y por un factor F igual a10
6
si se cont el
cuadro central o 10
4
si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el
valor X.


Si 1ml del preinoculo ____________ X esporas
? ____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*10
8
esporas)


Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a
desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.
126



ANEXO 2

Mtodo del cido Dinitrosaliclico (DNS)

Pasos para preparar DNS:

Disolver 1.6 g de NaOH en H
2
O destilada.
Adicionar 30 g de tartrato de Na y K
Adicionar 1 g de DNS
Aforar a 100 mL con H
2
O destilada
Almacenar en frascos mbar a 4 C

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 C. A partir
de la solucin de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrn
con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4.

Procedimiento:

Tomar 0.5 mL de cada dilucin y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.
Preparar una muestra blanco por dilucin de 0.5 mL de H
2
O destilada a 0.5 mL
del reactivo de DNS.
Agitar todas las muestras.
Colocar a ebullir las muestras en bao mara por 5 minutos.
Enfriar con hielo.
Adicionar 5 mL de H
2
O destilada.
Agitar y dejar en reposo 15 min.
Leer a 540 nm.
127


Realizar la curva Absorbancia versus concentracin. Debe tener un coeficiente
de correlacin de 0.991 a 0.999.















Figura 14. Mtodo de DNS












0.5ml muestra
problema + 0.5 ml DNS
Ebullicin de muestra
5min
Enfriar con hielo
Agitar y reposar 15min
Leer Absorbancia
= 540nm
0.5ml agua destilada
128



ANEXO 3

Mtodo de Lowry

Para obtener la curva estndar de Albmina se preparan 5 soluciones patrones de
Albmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.2, 80, 200,
300 y 400 g/mL. Si la concentracin de Protena es menor de 500 g/mL se lee
la absorbancia a 750 nm, si est entre 1000 y 2000 g/mL se lee a 550 nm. Se
prepara un blanco que no lleva Albmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL
de solucin salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a
las dems muestras.

Procedimiento:

Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones patrn de albmina, las
muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marcados para
conservar el orden de concentraciones para la curva.
Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al bao Mara precalentado
a 100C por un tiempo de 10 minutos.
Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.
Agregar a cada tubo 5 mL de la solucin complejante, mezclar y dejar reposar
por 10 minutos.
Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20
segundos.
Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos.

Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrn construir la grfica
Absorbancia vs. Concentracin de albmina srica de bovina (BSA); con esta se
puede determinar la concentracin de las muestras problema interpolando el valor
129


de absorbancia. La curva estndar debe tener un coeficiente de correlacin (r) de
0.991 a 0.999.



























Figura 15. Mtodo de Lowry
0.5ml de solucin
l j t
Preparar tubos 1, 2, 3, 4,5 y blanco
Adicionar
Mezclar y
agitar
Reposar
10 min.
Mezclar
en vrtex 20
Leer
absorbancia
Graficar
Absorbancia
Vs.
Calentar
100C 10min.
0.5ml de NaOH 2N
0.5ml de Reactivo
Enfriar a
Tem. Ambiente
130



ANEXO 4

Tablas ANOVA

Este es el anlisis estadstico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano
de microorganismos, variando el pH de extraccin del Higo y la concentracin de
nutrientes.

Tabla 35. Anlisis de varianza efecto de pH de extraccin sobre el crecimiento de
A. niger.

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 124,684607 3 41,56153572,06354694 0,122294492,86626545
Dentro de los
grupos 725,069663 36 20,140824

Total 849,75427 39


Tabla 36. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin de sustrato en el
crecimiento de A. niger.

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 1255,85077 3 418,61692412,9680654 3,344E-062,81646351
Dentro de los
grupos 1420,34637 44 32,2805993

Total 2676,19714 47








131


Tabla 37. Anlisis de varianza de la incidencia del pH de extraccin en el
comportamiento del Trichoderma harzianum

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 108,935449 3 36,31181644,02126552 0,014467032,86626545
Dentro de los
grupos 325,078109 36 9,02994747

Total 434,013558 39


Tabla 38. Anlisis de varianza de la incidencia de la concentracin en el
crecimiento del Trichoderma harzianum

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 971,163585 3 323,72119512,0302319 7,0164E-062,81646351
Dentro de los
grupos 1183,99485 44 26,9089738

Total 2155,15843 47


Tabla 39. Anlisis de varianza del efecto del pH de extraccin sobre el crecimiento
de Saccharomyces cerevisiae.

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de
las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre
grupos 0,40189872 3 0,13396624 0,22807371 0,87615582 2,90111757
Dentro de
los grupos 18,7962027 32 0,58738133

Total 19,1981014 35








132


Tabla 40. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin de sustrato sobre el
crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 0,89247125 3 0,29749042 0,99085408 0,40807414 2,86626545
Dentro de los
grupos 10,8085088 36 0,30023635

Total 11,70098 39

Tabla 41. Anlisis de varianza del efecto del pH de extraccin sobre el crecimiento
de Rhodotorula.

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 0,17674497 3 0,05891499 0,14744845 0,93056632 2,90111757
Dentro de los
grupos 12,7860256 32 0,3995633

Total 12,9627706 35

Tabla 42. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin de sustrato sobre el
crecimiento de Rhodotorula.

ANLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de
los cuadrados F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 3,88085737 3 1,29361912 4,16272894 0,01248242 2,86626545
Dentro de los
grupos 11,187442 36 0,31076228

Total 15,0682993 39


133



ANEXO 5

Constante K con el programa Polymath

Se utiliz el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K

Aspergillus niger variacin del pH de extraccin

Aspergillus niger a pH de extraccin 2


Biomasa
pH2
= (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.786)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 1.333






134


Aspergillus niger a pH de extraccin 7


Biomasa
pH7
= (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.342)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.3556933

Aspergillus niger a pH de extraccin 12


Biomasa
pH12
= (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/18.334)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.2194934

135


Aspergillus niger medio de Control

Biomasa
Control
= (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/13.574)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 1.1340424

Trichoderma harzianum variacin del pH de extraccin

Trichoderma harzianum a pH de extraccin 2


Biomasa
pH2
= (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.45)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.1203965
136


Trichoderma harzianum a pH de extraccin 7


Biomsa
pH7
= (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/11.412)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.2273364

Trichoderma harzianum a pH de extraccin 12


Biomasa
pH12
= (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.154)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.6580878


137


Trichoderma harzianum medio de Control


Biomasa
Control
= (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.648)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 0.97329

A. Niger variacin de la concentracin de azcares reductores

Aspergillus niger a concentracin de 30g/L


Biomasa
[30gr/L]
= (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.158)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 0.9509181
138


Aspergillus niger a concentracin de 40g/L


Biomasa
[40gr/L]
= (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/14.342)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 1.4580631

Aspergillus niger a concentracin de 50g/L


Biomasa
[50gr/L]
= (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/28.522)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 1.4753353

139


Aspergillus niger medio de Control

Biomasa
Control
= (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.4)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 0.6402406

T. harzianum variacin de la concentracin de azcares reductores

Trichoderma harzianum a concentracin de 30g/L


Biomasa
[30gr/L]
= (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/12.396)*(1-exp(k*Tiempo))))
k = 0.8190618

140


Trichoderma harzianum a concentracin de 40g/L


Biomasa
[40gr/L]
= (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/11.412)*(1-exp(k*Tiempo))))
k = 1.1414981

Trichoderma harzianum a concentracin de 50g/L


Biomasa
[50gr/L]
= (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/29.016)*(1-exp(k*Tiempo))))
k = 0.6289445

141


Trichoderma harzianum medio de Control


Biomsa
Control
= (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/10.634)*(1-exp(k*Tiempo))))
k = 0.4885395