UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA

FACULTAD DE MEDICINA
CATEDRA DE BIOLGIA MOLECULAR
CROMATOGRAFIA
RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS.- TEST DE NINHIDRINA
OBJETIVOS.-
Aprender correctamente la tcnica de Cromatografa de Papel.
Reconocer los aminocidos presentes en una solucin.
Comprender el fundamento de la reaccin de la Ninhidrina.
CROMATOGRAFIA.- En realiddad es bastante difcil describir en forma rigurosa la cromatografa, en s
es una tcnica empleada para separar cantidades relatiamente pe!ue"as de sustancias mu# relacionadas
!umicamente. Este es un mtodo de separacin eminentemente fsico.
$a separacin de las sustancias se fundamenta en funcin de la estructura mecnica del recorrido de
separacin %tubos o capas&' seg(n el tipo de fase %estacionaria o mil& # seg(n el tipo de separacin
%ascendente, descendente o bidimensional&.
En este mtodo se emplea una FASE ESTACIONARIA (Fs) y una FASE MOVIL (Fm) a la !ue tambin
se le llama elu#ente. $os componentes de una me)cla se transportan a tras de una fase estacionaria por
medio de una fase mil !ue flu#e.
TIPOS DE FASE ESTACIONARIA
Puede ser un *+$,-+ .,NA/EN0E -,1,-,-+ sostenido en un estrecho tubo de idrio o metal
2n PAPE$ P+R+*+ o un *+$,-+ .,NA/EN0E -,1,-,-+ aplicado sobre una placa de idrio en el
!ue la .A*E /+1,$ se despla)a por accin capilar o por graedad, CR+/A0+3RA.,A P$ANA.
0ambin puede ser un $,42,-+ ,N/,*C,5$E con la fase mil.
$a .A*E /+1,$ !ue puede ser un l!uido o un gas pasa a tras del slido por presin o por graedad6
CR+/A0+3RA.,A EN C+$2/NA.
$as elocidades relatias de migracin son constantes para unas condiciones dadas # se e7presan en forma
de alores Rf.
Rf6 es la relacin de elocidad de migracin de los solutos frente a la del disolente o elu#ente.
El Rf es una constante de la sustancia !ue normalmente es de diferente magnitud en distintos sistemas
cromatogrficos.
DISTANCIA RECORRIDA POR EL SOLUTO
Rf = ------------------------------------------------------------------------
DISTANCIA RECORRIDA POR EL DISOLVENTE (euyen!e).
CALCULOS DE LOS VALORES Rf E IDENTIFICACION
El alor Rf para una sustancia dada es la relacin de la distancia de dicha sustancia desde su punto de
aplicacin a la distancia del frente del disolente al punto de aplicacin. *i por e8emplo, el frente del
disolente estuiera a 9,: cm. de la lnea de aplicacin # los centros de las manchas para dos sustancias
estuieran respectiamente a ;,9 # <,= cm. de la lnea de aplicacin, entonces los alores Rf para estas dis
sustancias seran ;,9>9,: ? @,=@ # <,=>9,: ? @,<A.
El alor Rf puede ariar para una sustancia dada en relacin a las diferentes sustancias disolentes. ,ncluso
con el mismo sistema disolente el alor Rf de un compuesto dado puede cambiar considerablemente con la
humedad relatia, temperatura # otras condiciones !ue no pueden ser fcilmente controladas.
$os alores Rf pueden ser mu# parecidos en su reproductiidad en actiacin adecuada # e!uilibracin
%saturacin de la cmara con los apores del disolente& pero pueden ariar en cantidades considerables en
los distintos laboratorios' por esta ra)n, los alores del Rf de la bibliografa se deben utili)ar con
precaucin. *on aliosos para indicar el orden relatio de resolucin de compuestos pero debern
contrastarse en cada laboratorio # preferentemente comprobar con cada grupo de determinaciones.
TEST DE NINHIDRINA
FUNDAMENTO" $a ninhidrina descarbo7ila # desamina el aminocido, reducindose de tal manera !ue al
reaccionar con otra molcula de ninhidrina no reducida # con el amonaco a a formar un comple8o de color
ioleta.
Algunos aminocidos como la prolina # la hidro7iprolina dan con la ninhidrina una coloracin amarilla.
Ninh. B R C CD C C++D CCCCCCC R C CDE B C+E B ND< B Ninh. Red.

NDE
Ninh. Red. B Ninh. B ND< CCCCCCCCCCCCCCC Color 1ioleta
CROMATOGRAFIA DE PAPEL
MATERIALES
.rascos para cmara de saturacin.
/icropipetas de @,@E ml.
Placas de idrio
*oluciones de aminocidos6 gl#cina # alanina en una concentracin de @,= mg>ml.
.m 6 Cloroformo C metanol C hidr7ido de amonio %Proporcin de ;6;6F&
.s 6 Papel Gathman NHF@
Reelador6 solucin de Ninhidrina al @,=I
Estufa a A@ C.
Pin)as.
0i8eras.
PROCEDIMIENTO"
Preparar la cmara para cromatografa con el elu#ente o .m con E; horas de anticipacin %esto se hace
con la finalidad de !ue la cmara se sature con los apores del elu#ente&.
Preparar la .s de la siguiente manera6
Cortar el papel Gathman en tiras de FA,= cm. de largo por =,@ cm. de ancho.
Con un lpi) de punta fina marcar una lnea a @,= cm. de uno de los e7tremos %ste es el borde
superior !ue a a ir adherido a la placa de idrio&.
En el e7tremo inferior marcar otra lnea a @,= cm. del borde %es la parte !ue a a sumergirse en el
elu#ente&.
Por encima de esta lnea marcar otra a @,= cm. de distancia # sobre ella marcar los puntos de partida
del soluto %es la lnea de partida del soluto&.
Colocar mu# cuidadosamente con una micropipeta @,@E ml. de las sustancias a separar sobre la lnea de
partida. Estas sustancias deben estar a ms o menos F cm. de separacin.

NOTA: -e8ar secar luego de cada punteada de muestra.

Adherir la .s en la placa de idrio # colocarla en la cmara para cromatografa.
-e8ar correr la .m por espacio de <@ minutos.
0ranscurrido este tiempo, retirar el CR+/A0+3RA/A # secar en estufa a A@HC por <@ minutos.
Proceder al reelado con puleri)acin de Ninhidrina, eitando !ue el reactio gotee.
Colocar el Cromatograma en la estufa a A@HC por E@ minutos.
Retirar e interpretar los resultados obtenidos en el cromatograma.
-eterminar el Rf de los aminocidos presentes.
BLGA. ISABEL YARMAS DUEAS