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INTRODUCCION

Los cidos desoxiribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son polmeros de nucletidos
formados por un azcar de cinco carbones (desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN), una
base nitrogenada (que puede ser adenina, timina, citosina, guanina o uracilo) y una molcula
de fosfato.
La expresin de los genes es la base del metabolismo celular, y por sta se entiende que el
ADN se transcribe en ARN, que a su vez se traduce en protenas. Esta secuencia ADN-
ARN-protenas constituye el dogma central de la biologa molecular.
Los estudios contemporneos de ecologa molecular se han esforzado en entender las
funciones metablicas de los diferentes componentes biolgicos presentes en el ambiente y
en conocer la diversidad biolgica mediante el uso y aplicacin de tcnicas moleculares
basadas en la amplificacin de diversas regiones del ADN y ARN. La deteccin de la
expresin de los genes o la presencia de mARN especficos nos permitir acercarnos a
temas como el impacto de los diferentes componentes fsicos y biolgicos del ambiente en la
expresin del ADN (ya que la simple presencia de ADN no nos indica la actividad de los
genes), as como a la regulacin metablica de las enzimas que son esenciales en el papel
ecolgico que juegan los organismos dentro de su ecosistema (ciclos biogeoqumicos,
bioremediacin, reciclaje de nutrientes), entre otros.
En la extraccin de los cidos nucleicos, existen diferentes mtodos que permiten su
obtencin partiendo de diferentes fuentes por ejemplo; plantas plsmidios, gtas de sangre,
cabellos, clulas bacterianas, o eucariotas, etc. El mtodo de extraccin para la purificacin
de ADN depende de la aplicacin del anterior.
En esta prctica utilizaremos como muestra diferentes tejidos vegetales. El procedimiento se
fundamenta en lisis celular por medios mecnicos y qumicos, liberacin del acido nucleco
con CTAB al 2% el cual rompe la membrana celular y nuclear purificando posteriormente el
ADN con cloro formo luego el ADN es precipitado con Isopropanol frio para su purificacin.



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MARCO TEORICO

EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayora de
los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En
este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos los cidos nucleicos
purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de
modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos
existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios
siguientes:
cido nucleico diana;
organismo fuente;
material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin);
uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de ADNc, etc)

Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular,
inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restosde clulas. El
procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de ser
suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero
suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana.
.
Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares suelen ser
combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes:
extraccin/precipitacin;
cromatografa;
centrifugacin;
separacin por afinidad.

Extraccin/precipitacin
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de los
cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse unacombinacin de fenol y cloroformo con
objeto de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una
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precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa,
puede aadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la
precipitacin. Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones
salinas elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de protenas mediante cambio de
pH.

Cromatografa
Pueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separacin: permeacin sobre gel,
intercambio inico, adsorcin selectiva o unin por afinidad. La permeacin sobre gel
aprovecha las propiedades de las partculas porosas del gel para tamizar molculas. Se
emplea una matriz con poros de tamao definido, que dejan pasar las molculas ms
pequeas por difusin, pero no las ms grandes, que quedan eluidas en el volumen vaco.
As pues, las molculas quedan eluidas por orden de tamao decreciente. La cromatogrfica
de intercambio inico es otra tcnica, que se basa en la interaccin electrosttica de la
molcula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los cidos nucleicos
(polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden e luirse de las columnas de
intercambio inico con simples Tampones salinos. En la cromatografa de adsorcin, los
cidos nucleicosse fijan selectivamente en slice o vidrio, en presencia de determinadas
sales (por ejemplo, sales caotrpicas), mientras que otras molculas biolgicas no se fijan. A
continuacin, los cidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampn hiposalino y se
obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores.

Centrifugacin
La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de purificacin eficaz. As, por ejemplo, la
ultracentrifugacin en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva
empleando mucho tiempo para purificar plsmidos. La centrifugacin suele asociarse a otros
mtodos, como la cromatografa de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la
permeacin sobre gel y la centrifugacin para separar el ADN o ARN de contaminantes ms
pequeos (sales, nucletidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar segn el tamao.
Algunos procedimientos combinan la adsorcin selectiva en matriz

Separacin por afinidad
En los ltimos aos, cada vez son ms los mtodos de purificacin que combinan la
inmovilizacin por afinidad de cidos nucleicos y la separacin magntica.
Por ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partculas magnticas revestidas
deestreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partculas puede
eliminarse de la solucin (y de los contaminantes libres) con un imn. Esta tcnica en fase
slida simplifica la purificacin de los cidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de
centrifugacin, extraccin orgnica y separacin de fases por una operacin de separacin
magntica, nica y rpida.
.
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Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB
El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por
Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente, en
1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El mtodo es adecuado para
extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y est
especialmente indicado para eliminar los polisacridosy los compuestos polifenlicos, que,
de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha
aplicado con frecuencia en gentica molecular de los vegetales y ha sido probado en
ensayos de validacin para detectar OGM. Se han elaborado algunas variantes adicionales
para adaptar el mtodo a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin
transformar.

Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y precipitacin
Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de cetiltrimetilamonio
(CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De
ese modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems contaminantes
permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se
solubiliza aumentando la concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol.









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PROCEDIMIENTOS

1) Pesar 600 mg de tejido foliar, adicionar el tejido foliar a un microtubo de 1.5 ml y
triturar el tejido foliar con un micropistilo.



2) Macerar con 1 ml de CTAB 2% e incubar a 64 C en un plato caliente durante 40
minutos.






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3) Agregar 500 l de cloroformo: octanol (24:1), mezclar suavemente (hasta que se
observe un color blanco).




4) Colocar el microtubo en una microcentrifuga y centrifugar por 15 minutos a 10,000
RPM.







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5) Extraer la fase acuosa (400-500 l) y transferirla a un microtubo nuevo.



















6) Agregar 600 800 l etanol absoluto o isopropanol y frio (punto de congelacion)
mezclndose suavemente hasta observar la precipitacin del acido nucleico.

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7) Centrifugar 14,000 RPM durante 10 minutos. Descartar el sobrenadente con el
cuidado de no descartar el pellet formado.









8) Agregar 450 l de alcohol 70% para lavar el pellet, descartar el etanol y dejar secar el
pellet a temeratur 60C en un plato caliente.


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9) Agregar de 60 a120 l de agua destilada dependiendo del tamao del pellet y
resuspender. Finalmente Almacenar a -20 C







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DATOS
Investigue los siguientes trminos:
EDTA
cido etilen diamino tetra actico es una sustancia utilizada como agente quelante que
puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de
coordinacin octadrica. Coordina metales pesados de forma reversible por cuatro
posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando hexadentado, y el ms
importante de los ligandos quelatos.

CTAB
El Bromuro de hexadecil trimeti lamonio o Bromuro de cetil trimetil
amonio (C
16
H
33
)N(CH
3
)
3
Br) es una sal de amoniocuaternario, uno de cuyos grupos
alquilo es de gran longitud, con actividad detergente. Se le conoce tambin por las
siglas CTAB, del ingls Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide. Es
un surfactante catinico. Sus usos incluyen la utilizacin como solucin tamponante
para la extraccin de ADN. Y es uno de los compuestos
del antisptico tpico Cetrimide. El catincetiltrimetilamonio es un agente antisptico
efectivo contrabacterias y hongos.

CLON
un clon (griego retoo) es un conjunto de individuos genticamente idnticos que
descienden de un mismo individuo por mecanismos de reproduccin asexual.

ENZIMA
Las enzimas son molculas de naturaleza proteica y estructural quecatalizan reacciones
qumicas, siempre que sean termodinmicamente posibles: una enzima hace que una
reaccin qumica que es energticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy
baja, sea cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la
presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actan sobre
unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes
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denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que
ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las
denomina reacciones enzimticas.

GEN
Un gen es una secuencia ordenada de nucletidos en la molcula de ADN (o ARN, en el
caso de algunos virus) que contiene la informacin necesaria para la sntesis de una
macromolcula con funcin celular especfica, habitualmente protenas pero tambin ARNm,
ARNr y ARNt.

PLASMIDO
Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y
transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente
en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su
tamao vara desde 1 a 250kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su
tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por clula.

VECTOR
Un vector gnico es un agente que transfiere informacin gentica, por algn medio, de un
organismo a otro. Son utilizados enbiotecnologa un Vector de clonacin para portar el ADN
recombinante desde una clula donadora hasta la clula receptora en los que se inserta el
gen que se quiere transferir. A continuacin se infecta la clula hospedadora con ese vector
recombinante, obtenindose la clula transgnica.

Investigue y resuma un protocolo de extraccin de ADN de tipo casero para
tejidos animales y tejidos vegetales.
PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN PARA TEJIDOS VEGETALES
EXtraccin de ADN de robles colombianos Dellaporta , el cual ha dado buenos resultados en
los trabajos con plantas adelantados en el laboratorio de Biologa Molecular dela Universidad
Nacional sede Palmira . Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composicin de
la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extraccin de todo su contenido,
incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por accin mecnica, pulverizando el tejido
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con hielo seco o con nitrgeno lquido. En seguida, se deben destruir las membranas
celulares de manera que el ADN, acompaado de otros compuestos (protenas, enzimas,
carbohidratos), quede disponible. La mezcla de tejido as obtenida se agrega a una solucin
buffer o tampn de extraccin, en presencia de agentes quelantes, de soluciones de baja o
alta fuerza inica (para que sea soluble el ADN) y de altas concentraciones de NaCl. Los
agentes quelantes (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la accin de
enzimas nucleasas; ellos capturan los iones magnesio y no permiten que acten como
cofactores de las nucleasas. Las altas concentraciones (5 M) de NaCl seemplean para
prevenir la contaminacin de la muestra con polisacridos que afectan la pureza del ADN,
pudiendo inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y
endonucleasas de restriccin; la base para la separacin de los polisacridos de los cidos
nucleicos, es su solubilidad diferencial en presencia de las altas concentraciones de NaCl los
polisacridos precipitan bajo la accin de fuerzas centrifugas. A la mezcla anterior se agrega
un detergente aninico como el SDS (sodio dedecil sulfato), que solubiliza protenas, tejidos
y membranas, evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los
desechos o restos celulares. Para prevenir que el ADN extrado presente coloracin gris o
parda, la cual se debe a la actividad de polifenoloxidadas presentes en algunos tejidos, se
incluye en el buffer de extraccin P.V.P (polivinil pirrolidona)(6). Para separar las protenas,
se lleva la mezcla de tejido con el tampn a incubacin a 65C con lo cual se desnaturalizan
las protenas. Para retirar las protenas denaturadas y la mayora de los polisacridos, se
agrega una sal como el acetato de potasio fro. Por centrifugacin se separan tejidos,
membranas, polisacridos y protenas de los cidos nucleicos, los cuales quedan en el
sobrenadante. Finalmente hay que separar el ADN de la fase acuosa, para lo cual se debe
precipitar el mismo, usando un alcohol como el isopropanol, el cual es selectivo en la
precipitacin del ADN en presencia de ARN. Despus de precipitado el ADN se disuelve en
una solucin tampn (TE de pH 8.0) o en agua bidestilada. El ARN se remueve adicionando
enzima RNAasa a la solucin.
PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN PARA TEJIDOS ANIMALES
Protocolo de extraccin de ADN de miniprep: Una miniprep es una extraccin
de ADN de naturaleza plasmdica de un cultivo bacteriano
El mtodo ms comn para ello es romper las clulas de dicho cultivo mediante un choque
alcalino de modo que slo permee selectivamente su ADN plasmdico. Para ello, se toma un
volumen de 2-5 mL de un cultivo crecido en medio lquido y se centrifuga, aislando as las
clulas de aqul. Despus, se resuspende dicho pellet y se expone dicha suspensin a una
disolucin que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS), la cual solubiliza en parte
lamembrana externa de las bacterias Gram negativas, lo que produce la liberacin del
contenido celular de stas: ADN genmico y plasmdico desnaturalizados, ARN, protenas...
Tras esto, se aade a la mezcla acetato potsico, acdico, lo cual neutraliza todo
el debriscelular y provoca la rpida renaturalizacin del ADN plasmdico, que queda en
suspensin, mientras que el genmico y el resto de componentes celulares se reticulan y
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precipitan ayudados por la alta concentracin de sales, especialmente del recin
generado dodecil sulfato de potasio. Finalmente, se centrifuga nuevamente la mezcla para
aislar elsobrenadante, rico en el ADN plasmdico y en ARN, el cual deber ser eliminado
mediante una ribonucleasa.La miniprep es la tcnica inicial de purificacin y concentracin
de ADN plasmdico para cualquiera de sus posibles fines, entre los que destaca la clonacin

Existen muchos protocolos de la extraccin del ADN, De que depende la
seleccin de un protocolo en particular?
La aplicacin de las diferentes tcnicas empleadas en biologa molecular para el anlisis del
genoma, depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN. Para lo cual se
utilizan diversos mtodos de extraccin, dependiendo del tipo de tejido a emplear.

Qu aplicaciones tiene la extraccin de ADN?
Para aislar el ADN hay que hacer que precite en alcohol. El ADN es soluble en agua pero
cuando se encuentra en alcohol se desarrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el
agua.ademas de pemitirnos ver el ADN,el alcohol separa del ADN e otros componentes
celulares, los cuales son dejaos en la solucion acuosa. esto es la continuacion si hoy no
dormimos.

Cmo se almacena el ADN e clulas procariotas y eucariotas?
CLULA PROCARIOTA:
-Su ncleo es primitivo, pues carece de membrana nuclear. La informacin gentica se
almacena en molculas de ADN que tienen forma circular (no en doble hlice como en las
eucariotas). Dichas molculas se ubican, en algunas bacterias, en la llamada zona nuclear.-
En lugar de tener organelos, como cloroplastos y mitocondrias, encargados de las funciones
energticas, presentan los llamados cuerpos membranosos, que se forman de
invaginaciones de la membrana plasmtica; y cumplen funciones de respiracin y
fotosntesis.-La transmisin del material gentico no se cumple por mitosis, sino mediante
divisin directa. No se forma entonces el aparato mitico.-La pared celular tiene estructura y
composicin qumica particulares. En ellas predominan un glucopptedo llamado murena.-El
volumen de las clulas procariotas es menor pues oscila entre 1 y 2 micrmetros. Las
clulas eucariotas presentan tamao mayor: de 10 a 100 micrmetros.-La divisin celular en
procariotas es por fisin binaria gemacin, no hay mitosis. En eucariotas s hay diversas
formas asociadas con mitosis.-Sistema sexual, cuando est presente en procariotas, hay
transferencia unidireccional de genes desde el dador al receptor. En las eucariotas hay
fusin nuclear completa de genomas gamticos equivalentes, asociados con la meiosis.-
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Organelos de movimiento: en procariotas son flagelos simples; en eucariotas cilias o flagelos
complejos, cuando estn presentes.

CELULAS EUCARIOTAS:
Tienen su ncleo definido, en ste, la clula guarda su informacin gentica. Una clula
eucariota tiene citoplasma y organelos celulares. Realizan un metabolismo aerobio (Con
ayuda de oxigeno).- Algunos eucariontes realizan la fotosntesis, gracias a la presencia en
su citoplasma de orgnulos llamados plastos, los cuales derivan por endosimbiosis de
bacterias del grupo denominado cianobacterias (algas azules).- Se puede distinguir tres
partes fundamentales: membrana celular, citoplasma y ncleo- El material gentico est
incluido en un ncleo verdadero el cual se encuentra rodeado por una envoltura
membranosa compleja: la envoltura nuclear - Su citoplasma contiene una variedad de
organelo membranosos y no membranosos especializados para realizar distintas funciones-
Las clulas eucariotas constituyen todos los organismos eucariotas que incluyen :
hongos, protozoarios plantas y animales.


DISCUSIN
Para extraer ADN de un tejido vegetal nuestro primer paso ser pesar aproximadamente 600
mg del tejido foliar y depositarlo en un microtubo seguidamente trituramos el tejido con la
ayuda de un micropistilo. Macerar el tejido con 1 ml de CTAB para la liberacin de acidos
nucleicos mediante la ruptura de la membrana celular y nuclear, e incubamos a 64 C
durante 40 minutos. Agregamos 500 l de cloroformo que este purifica el ADN liberandolo de
restos protenas y otros contaminantes presente y lo mezclamos suavemente hasta obtener
un color blanco, colocamos el microtubo con el tejido foliar en la microcentrifuga por 15
minutos a 10,000 rpm, al retirarlo de microcentrifuga observaremos una fase acuosa y otra
mas densa, extraemos la fase acuosa y la transferimos a un tubo nuevo, le agregamos de
600 a 800 l de alcohol absoluto o isopropanol frio para precepitar el ADN y purificarlo, lo
mezclamos suavemente hasta observar la precipitacin del acido nucleico. Nuevamente
colocamos el microtubo por 10 minutos en la microcentrifuga a 14,000 rpm, al retirarlo de la
microcentrifuga descartamos el sobrenadente con el cuidado de no descartar el pellet
formado, agregamos 400 l de etanol al 70% para lavar el pellet, descartamos el etanol y
dejamos secar el pellet a una temperatura de 60 C, agregamos de 60 a 120 l de agua
destilada y resuspender. Finalmente almacenamos a -20C.
CONCLUSIONES
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1. Al final de la practica describimos el fundamento de la tcnica de
extraccin de acido nucleico.

2. Identificamos un mtodo de extraccin de cidos nucleicos
eucariotas.

3. Conocimos la funcin de cada uno de los reactivos utilizados.










BIBLIOGRAFIA
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