Presentación Seminario Carlos Junio 9

Produccin en biorreactor de rotavirus como agente oncoltico para el
tratamiento de tumores cancerosos

AVANCE DE TESIS DE MAESTRA
Ing. Eliana Lozano Romero
Junio 201
!"#$E#I%"
&arco !onceptual
&etodologa
In'raestructura
Resultados preliminares
&(R!" !"#!EP$)(L
OBJETIVO GENERAL:
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Estandarizar el proceso de cultivo celular de lnea tumoral de
ratn *P2+0 en spinner a escala de 100 mL.
Estandarizar el proceso de cultivo celular de lnea tumoral de
ratn *P2+0 en biorreactor de 2 litros.
Realizar la puri,cacin de virus obtenido - veri,car su capacidad
in'ectiva.
Estandarizar los procesos de produccin - puri,cacin de rotavirus
obtenido de la lnea tumoral de ratn *P2+0 en biorreactor.
&(R!" !"#!EP$)(L
TITULO: Produccin en iorre!c"or de ro"!#iru$ co%o
!&en"e onco'("ico )!r! e' "r!"!%ien"o de "u%ore$
c!ncero$o$
PRODUCCI*
N DE
ROTAVIRUS
Temticas Previas
al tema
(antecedentes)
Temticas
implicadas en el
desarrollo del
proyecto
TEMA
PRODUCCI
*N DE
ROTAVIRU
S
Co%)one
n"e
T+cnico
Co%)one
n"e Soci!'
Cu'"i#o Ce'u'!r
In,eccin
E-"r!ccin
Puri.c!cin
C!r!c"eri/!cin
Temticas Previas al tema
(antecedentes)
Temticas implicadas en el desarrollo
del proyecto
VIRUS
C0NCER
VIRUS
ONCOLTICOS
ROTAVIRUS
1ue $on2
Co%o $e
con,or%!n2
C'!$i.c!cin
3i$"ori!
A)'ic!cione$
De"eccin
Pro)!&!cin
De$"ruccin de
#iru$
Ni#e'e$ de
Bio$e&urid!d
1ue e$2
3i$"ori!
Mec!ni$%o$ de
re)'ic!cin
E,ec"o$
Fuen"e$
Medio$ de "r!n$%i$in
P!"rone$ de
reconoci%ien"o
1u+ "i)o de c+'u'!$
!,ec"!2
M!rc!dore$ 4
%ec!ni$%o$ de
iden"i.c!cin
En,er%ed!de$
!$oci!d!$
Incidenci!
En e' %undo
En Co'o%i!
Cic'o de re)roduccin
Ve'ocid!d de
re)roduccin
V!cun!$
Di!&n$"ico
Tr!n$,erenci!
de %!"eri!'
&en+"ico
De$"ruccin de
#iru$
Ar%! io'&ic!
Tr!"!%ien"o$
%+dico$
1ue e$2
Ti)o$
Tr!n$%i$i
n
Tr!"!%ien
"o$
3i$"ori!
Nue#!$
A'"ern!"i#!$
Co%)!5(!$
F!r%!c+u"ic!$
in#o'ucr!d!$
Re&u'!cione$
FDA
En$!4o$ C'(nico$
Re6uerido$
En$!4o$ en !ni%!'e$
re6uerido$
Tie%)o
Co$"o$
Fo%u'!cin
I%)'ic!cione$ +"ic!$
C%o $e
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C%o %edir
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M!n"eni%ien"o
C+'u'!
$
Ce)!$
Concen"r!cin de
incu'o
A&i"!cin 7
Aire!cin
M+"odo$
Condicione
$
E6ui)o$
M+"odo$
Iden"i.c!ci
n
Condicio
ne$
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Cond8
con$er#!cin
Viru$
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!
c
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VIRUS
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Puri.c!cin
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del proyecto
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del proyecto
VIRUS
C0NCER
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ONCOLTICOS
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Bio$e&urid!d
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Mec!ni$%o$ de
re)'ic!cin
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reconoci%ien"o
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M!rc!dore$ 4
%ec!ni$%o$ de
iden"i.c!cin
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Incidenci!
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En Co'o%i!
Ve'ocid!d de
re)roduccin
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#iru$
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in#o'ucr!d!$
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FDA
En$!4o$ C'(nico$
Re6uerido$
En$!4o$ en !ni%!'e$
re6uerido$
Tie%)o
Co$"o$
Fo%u'!cin
C%o $e
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C%o %edir
e,ec"i#id!d2
M!n"eni%ien"o
C+'u'!
$
Ce)!$
Concen"r!cin de
incu'o
A&i"!cin 7
Aire!cin
M+"odo$
Condicione
$
E6ui)o$
M+"odo$
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n
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!
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!
c
d
!"#$E#I%"
&arco !onceptual
&etodologa
In'raestructura
Entrenamiento Inicial
&ane3o de lneas celulares
Preparacin de &edio
!onteo !elular 4 5iabilidad
Preparacin de &aterial
&E$"%"L"67(
NECESIDAD: (ltas cantidades de virus
A'"! concen"r!cin ce'u'!r
Condicione$:
p8
(gitacin
$emperatura
!oncentraci
n de
Inculo
ETAPA I: Efecto de algunas condiciones de operacin en la
produccin de clulas Sp2/0-Ag14
V!ri!'e$ de
re$)ue$"!:
!oncentraci
n celular
5iabilidad
9 4 20 mL
F!c"or de e$c!'!
100 mL
&E$"%"L"67(
*uper,cie de respuesta :1;< =o>?
=e@nAen
DISE9O E:PERIMENTAL
5elocidad
de agitacin
p8
$emperatura
B0 e>perimentos C19 sets con 1 rDplicaE
G8L8E8: 12
5ariable
#iveles
?1 0 1
Ve'ocid!d de
!&i"!cin ;r)%<
90 100 190
)3 .F0 0 0FB
Te%)er!"ur! ;=C< B9 B0 B2
V!ri!'e Adicion!':
!oncentracin de inculo
#iveles< 9 >10
F 1>109F 9>109 cel+mL por
duplicado an/lisis con ANOVA
TOTAL E:PERIMENTOS: >?
&E$"%"L"67(
Condicione$:
Lote alimentado
V!ri!'e$ de
re$)ue$"!:
!oncentracin
celular
5iabilidad
100 mL
F!c"or de e$c!'!
2000 mL
G*e considera Hue @acer an/lisis
de otros metabolitos resulta Itil
en el desarrollo del pro-ecto por
tanto se @ar/ seguimiento de<
G'uco$!@ '!c"!"o@ LD3@
&'u"!%in! 4 A%onio
Por triplicado an/lisis con ANOVA
TOTAL E:PERIMENTOS: ?
&E$"%"L"67(
Condicione$:
$tulo de 5irus
$ipo de 5irus
Lisado celular
ETAPA II: Efecto de las condiciones de infeccin con rota!irus de
clulas Sp2/0-Ag14 para produccin de rota!irus
V!ri!'e$ de re$)ue$"!:
!inDtica de produccin
100 mL
G*e considera Hue
emplear medios
Humicamente
de,nidos puede ser
Itil pues no se
tendra Hue remover
*J= de los cultivos
antes de la
in'eccin. Estos
ensa-os se
realizar/n en esta
etapa del proceso
con las condiciones
preestablecidas
F!c"or de e$c!'!
Di$e5o E-)eri%en"!': Jactorial
ttulos de virus por duplicado
TOTAL E:PERIMENTOS: A
&E$"%"L"67(
ETAPA II: Efecto de las condiciones de infeccin con rota!irus de
clulas Sp2/0-Ag14 para produccin de rota!irus
F!c"or de e$c!'!
2000 mL
En$!4o .n!':
Por "ri)'ic!do
TOTAL DE ENSABOS: C>
ETAPA
Vo'8
;%L<
Mode'o
No8
E-)eri%en"o
$
V!ri!'e;$<
e#!'u!d!;$<
p8
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mp
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a
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In
cul
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cDl
ula
s
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me
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n
m.
o.i
ini
cia
l
Esc
ala
E$(P( I
100 =o>?=e@nAen B0 : : :
100 (#"5( . :
100 (#"5( . :
E$(P( II
100 Jactorial 1 :
2000 (#"5( B :
RESUMEN E:PERIMENTAL
!"#$E#I%"
&arco !onceptual
&etodologa
In'raestructura
I#JR(E*$R)!$)R(
(decuacin del reactor
(decuacin de sistemas de
cultivo en Spinner
(decuacin del Reactor
In#en"!rio
Inici!':
2 Reactores de vidrio de BL
2 Reactor de vidrio de 1F9 L
1 *oporte para
Reactor de BL
1 $apa soporte para
instrumentacin para
reactor de BL
2 Kits de
Instrumentacin para
reactor CBL - 1F9LE
1 *ervomotor de agitacin
!ontrolador de
temperatura
In#en"!rio
,!'"!n"e
!ontrolador de ">geno disuelto
*istema de mezcla de gases
!ontrolador de sistema de agitacin
FINANCIACI*N:
!onvocatoria 9.2 de 2012 de !olciencias.
Pro-ecto ElegibleF #o ,nanciable.
=anco de la RepIblica. #o Jinanciables
pro-ectos de &aestra.
!onvocatoria %I= 201B. Jinanciado. 10
millones de pesosF
In#en"!rio
,!'"!n"e
Si$"e%! de %e/c'! de &!$e$
Juncin< &ezcla - medicin de
Lu3os de ">genoF !"
2 - (ire
&aterial %isponible< Rot/metros
Recur$o$ Pro)io$:
&anmetros
5/lvulas
(coples
&angueras
Pro"o"i)o Ver$in E8F
In#en"!rio
,!'"!n"e
Pro"o"i)o Ver$in De.ni"i#! Recur$o$ Pro)io$:
!a3a
Si$"e%! de %e/c'! de &!$e$
!alibracin de Rot/metros
Si$"e%! de %e/c'! de &!$e$
E3emplo< !alibracin
Rot/metro !"2
20 0 .0 10 100 120 10 1.0
0
20
0
.0
10
100
120
10
1.0
110
200
'C>E M 1.2.> ? 11..
RN M 0.22
Cur#! de c!'ir!cin COG
Rot/metro
Jlu3o Cml+minE
In#en"!rio
,!'"!n"e
Con"ro'!dor de $i$"e%! de
!&i"!cin
El servomotor no es compatible con controladores de di'erentes marcas
Appli"on no distribu-e m/s unidades individuales de control
*e reHuiere comprar un nuevo servomotor - su controlador
*ervomo
tor
!ontrola
dor
Juent
e
In#en"!rio
,!'"!n"e
(dicional< (provec@ando Hue se @ara la compra del ensamble del
motorF se aprovec@a - se generan los planos del reactor para mandar
@acer las tapasF soportes e instrumentacin 'altantes.
(dHuisicin de
controlador de
o>geno
disuelto - de
p8
Mon"!He e'+c"rico
4 e'ec"rnico de
Con"ro' Uni.c!do
!ontrol de
agitacin por
computador -
registro de
datos de
controladores
en
computador
="&=(
PERI*$OL$I!(
1
00<00 01<2. 02<9B 0<12 09<. 00<12
0
20
0
.0
10
100
C!'ir!cin e'ec"rodo de O-(&eno di$ue'"o
1. =a3ando 1.*ubiendo 2. =a3ando 2.*ubiendo
90<00 0<12 11<B1 11<B 29<99 BB<00 0<12 0<B1
20
22
B1
BB
B9
B0
C!'ir!cin Con"ro' de Te%)er!"ur! Re!c"or
$emperatura !ontrol p8 $emperatura !ontrol o>geno
$emperatura !ontrol temperatura
$iempo CminE
$emperatura PC!E
Parmetros
P= 214
I= 8400
D= 588
t= 90
Condiciones
Bunker cerrado
Sin aire acondicionado
Reactor Cargado con 2 L Agua
Aireacin So!o Aire 0"125 ##$
Agit acin 150 r%$
!ultivos en Spinner
-
Planc@a de agitacin magnDtica
-
5elocidad mnima 190 rpm
Di$e5o de $i$"e%! de con"ro' de !&i"!cin
!ultivos en Spinner
0 1 2 B 9 . 0 1 2 10
B.
B..9
B0
B0.9
B1
B1.9
B2
B2.9
0
E'e#!cin de '! "e%)er!"ur! en '! incu!dor! ! c!u$! de in"roducir %o"ore$ de !&i"!cin
Tie%)o ;%in<
Te%)er!"ur! ;=C<
!ultivos en Spinner
#$%&
2'%(
'%#
1$%1
22%'
4#%#
Te)p

*eal
Te)p

*egis
t
!"#$E#I%"
&arco !onceptual
&etodologa
In'raestructura
Resultados Preliminares
!inDtica de crecimiento ? Inculos
Principio<
Re'erencias< EQects o' @ig@ passage
cultivation on !8"
cells<
a global anal-sis
(ppl &icrobiol
=iotec@nol C2012E
2<.924.01
$. J. =ecAmann R ".
KrSmer R *. Klausing R
!. 8einric@ R$. $@Tte R
8. =Tnteme-er R R.
8oQrogge R$. #oll
ICuJ' e$ e' e,ec"o en '! #e'ocid!d de creci%ien"o de '!$ c+'u'!$ S)GKFLA&EM
en di,eren"e$ )!$!He$ en cu'"i#o$ )or 'o"e2
*e inocula en un 'rasco $ de 09 cm
2 9 > 10 cel+mL en B0mL de medio
de !ultivo %&E&?J12 *uplementado con 10U *J=.

*e @ace conteo por @ematocitmetro - determinacin
de viabilidad con azul de tripano cada 1 u 12 @orasF sin
pasa3e ni cambio de medio. 5olumen de muestra< 100
VL
%eterminacin de 5elocidad de crecimiento - tiempo de
duplicacin
Protocolo<
E3emplo resultados<
0.00 90.00 100.00 190.00 200.00
1.00EW0
1.00EW09
1.00EW0.
'C>E M 2091B.. e>pC 0.09 > E
RN M 1
Pozo 1 Pozo 2
Promedio 6eneral C!Dlulas+mlE !recimiento e>ponencial
E>ponential C!recimiento e>ponencialE
$iempo C@orasE
!Dlulas viables+mL
5elocidad de !recimiento CVE M
0F02B @
?1
$iempo de duplicacin M 1F00 @
E3emplo resultados<
Pasa3e
$iempo de
duplicacin
$iempo de
duplicacin
1 1F0. 1F19
2 1F19 1F19
1F02 1F12
. 1F10 1F19
1 1F12 1F02
12 1F02 1F0.
1. 1F02 1F12
2 1F12 1F19
"rigen de las
variaciones
*uma de
cuadrados
6rados de
libertad
Promedio de
los
cuadrados
J Probabilidad
5alor crtico
para J
Entre grupos 1FBB0E?00 0 1F212.E?01 2F00.1209 0F1.111990 BF900.B1.
%entro de los
grupos 0F9E?01 1 2FB09E?02
$otal 2F02B0E?00 19
5elocidad de
!recimiento
promedio CVE M
0F021 @
?1
$iempo de duplicacin promedio
M 1F12 @
No N!4
di,erenci!
e$"!d($"ic!%e
n"e
$i&ni.c!"i#!
5elocidad de !recimiento promedio CVE M
0F021 @
?1
$iempo de duplicacin promedio M 1F12 @
%ensidad m/>ima 9 > 109 cel viables +mL
0.00 20.00 0.00 .0.00 10.00 100.00120.0010.001.0.00
1.00EW0
1.00EW09
1.00EW0.
'C>E M 2091B.. e>pC 0.09 > E
RN M 1
Pozo 1 Pozo 2
Promedio 6eneral C!Dlulas+mlE !recimiento e>ponencial
E>ponential C!recimiento e>ponencialE
$iempo C@orasE
!Dlulas viables+mL
0F021 @
?1
Inculo Reactor 100mL M 9 >10
cel+mL M 9 >10. cel
&/>ima densidad ,nal M 9 >10
9 cel+mL M 9 >100 cel
F2 ciclos apro>.
M 92FB0 @oras
M 2F9 das apro>.
0F021 @
?1
Inculo Reactor 100mL M 9 >10
cel+mL M 9 >10. cel
&/>ima densidad ,nal M 9 >10
9 cel+mL M 9 >100 cel
Po$i'e$ c!u$!$:
-
In@ibicin por 'alta de
sustrato
-
In@ibicin por p8
-
E>ceso de Lactato 4
(monio
-
%ensidad m/>ima
viable
Medid!$ ! ,u"uro:
-
Realizar an/lisis de
sustrato - metabolitos<
6lucosaF LactatoF
amonio - glutamina
EL CULTIVO POR LOTE
DEFINITIVAMENTE NO
PARECE SER UNA
ALTERNATIVA BUENA PARA
ESTE TIPO DE CULTIVO8
*in embargo teniendo en cuenta su
corta duracin es Itil para la
determinacin del e'ecto de otras
variables en el crecimiento.
!ultivos en Spinner
Estandarizacin seguimiento de glucosa en medio
Protocolo enzim/tico<
Principio<
Protocolo<
10VL de muestra en 900 VL de reactivo
Ccontiene< Jos'atos 100 mmol+LF 'enol 9 mmol+LF glucosa o>idasa Y 10
)+mLF pero>idasa Y 1 )+mLF ?aminoantipirina 0F mmol+LF p8 0F9E
Reaccin 20 min. Z $
ambiente
*e dilu-e muestra con 900 VL de agua desionizada
&edir absorbancia a 900nm
!inDtica de crecimiento ? Spinners
*e inocula en un 'rasco $ de 09 cm
2 9 > 10 cel+mL en B0mL de medio
de !ultivo %&E&?J12 *uplementado con 9U *J=. [ en *imult/neo en 2 spinner de 100 mL de
volumen de reaccin

*e @ace conteo por @ematocitmetro - determinacin
de viabilidad con azul de tripano cada 1 @orasF sin
pasa3e ni cambio de medio. 5olumen de muestra< 100
VL
%eterminacin de 5elocidad de crecimiento - tiempo de
duplicacin
Protocolo<
&onta3e<
Produccin en biorreactor de rotavirus como agente oncoltico para el
tratamiento de tumores cancerosos
PROPUESTA DE TESIS DE MAESTRA
Ing. Eliana Lozano Romero
Junio 201

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Produccin en biorreactor de rotavirus como agente oncoltico para el

tratamiento de tumores cancerosos

&ane3o de lneas celulares

!onteo !elular 4 5iabilidad

(decuacin del reactor

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