Liria S. Calahorrano, N. David Zapata, Escuela Politcnica del Ejrcito (ESPE), Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa, .Sangolqu-Ecuador. E-mail: liria.calahorrano@gmail.com, ndavidzc@hotmail.com
RESUMEN
El trematodo, Fasciola hepatica causa la enfermedad parasitaria conocida como fasciolosis, enfermedad que ocasiona prdidas econmicas por decomiso de hgados en mataderos y disminucin en la produccin de leche y carne. El objetivo de esta investigacin fue extraer los antgenos de excrecin de Fasciola hepatica en ganado ovino. Se obtuvieron 6 hgados del matadero municipal de la ciudad de Quito, de los cuales se extrajeron las fasciolas. Se aplicaron diferentes protocolos de extraccin, y se analiz la cantidad de protena total con el mtodo Biuret. Una cromatografa de capa fina para identificar los aminocidos presentes y acercarnos al tipo de antgeno que posee el extracto. Los protocolos de extraccin no presentaron diferencias y los antgenos presentes tienen una gran probabilidad de pertenecer a la familia de las cistenas proteasas.
Palabras clave: ovinos, Fasciola heptica, antgenos de excrecin y secrecin, fasciolosis ABSTRACT
The trematode, Fasciola hepatica parasite causes a disease known as fasciolosis, which causes economic losses by seizure of livers in slaughterhouses and decreased production of milk and meat. The objective of this research was extracted antigens of excretion and secretion of Fasciola hepatica in sheep. We obtained 6 livers of the municipal slaughterhouse of Quito, which flukes were removed from these livers. We applied different extraction protocols and analyzed the amount of total protein with the Biuret protocol. A thin layer chromatography to identify the amino acids and the type of approach that has antigen extract. Extraction protocols are not different; antigens have a high probability of belonging to the family of cysteine proteases.
INTRODUCCIN
La Fasciola hepatica es un tremtodo que parasita un gran nmero de vertebrados como caballos, cerdos, ovinos, bovinos, incluyendo al hombre (Prez et al., 2009; Paz-Silva et al., 2010). La fasciolosis es una enfermedad de importancia debido a las prdidas econmicas y productivas que provoca en el ganado bovino (Kassuku et al., 1986; Hammond & Sewell, 1990; Wamae e Ihiga 1991; Menkir et al., 2007), por los efectos patognicos de este parsito en el organismo. Los adultos de F. heptica tienen un cuerpo plano de hoja, de unos 30mm de largo y 15mm de ancho, son de color gris-rosado a parduzco (Contreras, 2000). La fasciolosis tiene una distribucin mundial en rumiantes (Arias, et al., 2011), con mayor frecuencia en Europa, zonas montaosas del sur del continente Asitico, este y sur de frica, en las regiones templadas y tropicales del continente Americano, en Nueva Zelanda y en Australia (Boray, 1985). En Amrica Latina se ha reportado en pases como Ecuador, Venezuela y Per en animales y en seres humanos (Prez, 2003). El contagio ocurre cuando el pastoreo del ganado se realiza en zonas hmedas, que permiten el desarrollo del hospedador intermediario, el caracol del gnero Lymnaea (Salazar et al., 2006; Arias et al., 2011). La infeccin generalmente ocurre cuando el ganado se alimenta de pasto contaminado con la fase infecciosa (metarcercariae) del parsito (Marcos et al., 2007); por tanto, la fasciolosis puede ser considerada como una zoonosis originada por agua contaminada. El diagnstico de F. hepatica en el hospedador definitivo puede realizarse a partir de la necropsia de animales muertos (Chvez, 2010), a travs de la observacin de los parsitos adultos en el hgado y sus lesiones, y la observacin de huevos mediante anlisis coprolgicos (Dennis et al., 1954; Kleiman et al., 2005). Generalmente son tcnicas utilizadas despus de que el animal presenta sntomas relacionados a una alta carga parasitaria. Otros mtodos de diagnstico son tcnicas moleculares y los ensayos inmunoenzimticos (ELISA) (Dumnigo & Villalvilla, 1998), los cuales usan muestras de suero para demostrar la presencia de anticuerpos en contra de los antgenos del parsito (Arias et al., 2011), pueden detectar infecciones tempranas con baja carga parasitaria. Adems, se justifica el uso de mtodos inmunolgicos debido a la baja sensibilidad de los exmenes coprlogicos (Cabrera et al., 2001; Espino et al,. 1987) en contraste con la alta especificidad y sensibilidad del ELISA. Se ha demostrado que durante la infeccin de F. hepatica se liberan compuestos con actividad antgenica (Keegan & Trudgett, 1992; Arias, 2001; Lomba, 2005). Los antgenos ES estn compuestos por molculas de naturaleza glicoproteica (Colmenares et al., 2007), que pueden generar reacciones cruzadas. Los antgenos de ES de 8, 10, 11, 14, 17, 23 -30 kDa del verme adulto de F. hepatica pueden tener una buena sensibilidad y especificidad (70-100%) por Western Blot (Daz, et al., 1998; Espino, et al., 2000; Kim, et al., 2003; Silva et al., 2005), el trabajo asumir que se trabaja con estos antgenos. La F. heptica es un parasito incidente en el Ecuador, sobre todo en la region andina (Cali, 2012). En los antgenos de ES (excrecin-secrecin), un componente importante son las cistena proteinasas con 25-26kDa, las cuales forman parte del arco de precipitacin Fharc2 usado para serologa en humanos y ganado bovino, caprino, ovino, entre otros (Crdova et al., 1999), dentro de este grupo la familia de las catepsinas son muy importantes por su alta sensibilidad y especificidad (Tantrawatpan et al., 2005). El objetivo de esta investigacin es la extraccin y purificacin de antgenos de ES de Fasciola hepatica, de manera que estos antgenos tengan un potencial uso para el desarrollo de tcnicas de diagnstico. MTODOS
Recoleccin y muestreo.- En la Empresa Municipal de Rastro de Quito, se recolectaron parsitos de hgados, provenientes de ovejas sacrificadas, para ello se seleccionaron 6 hgados infestados y fueron 6 hgados y fueron transportados en un cooler refrigerado, a los laboratorios de Biotecnologa de la Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE).Los gusanos adultos de F. heptica fueron extrados de los conductos biliares de los hgados.
Extraccin y obtencin de los antgenos ES.- Los antgenos fueron obtenidos segn el protocolo descrito por Guobadia y Fagbemi (1995). De manera general, los parsitos adultos se separaron en grupos de 10 individuos, se lavaron 3-4 veces con solucin salina tamponada con fosfato (PBS) 0.01 M (pH 7,2), con el fin de eliminar restos de sangre y bilis. Se incubaron durante de 24 horas, para purificar los antgenos se centrifug a 4000 rpm a 4 C durante 30 minutos y se recogi el sobrenadante que contena los productos de ES de los parsitos. Para comprobar si la filtracin influye en la extraccin del antgeno se realizaron dos tratamientos con 6 repeticiones cada uno, el primero consiste en filtrar a travs de un poro de membrana de 4.5 m y el segundo sin filtrar. Finalmente, se almacen en tubos falcn las muestras en refrigeracin a -20 C.
Determinacin de la cantidad de protena (Protocolo de Biuret).- Primero se realiz la curva de calibracin con un patrn estndar, albumina de suero bovina (Gibco) que fue diluida a diferentes concentraciones como se muestra en la Tabla 1. La ecuacin de la curva de calibracin se obtuvo mediante correlacin de los datos de absorbancia con los de cantidad de protena. Se procedi a descongelar las muestras de antgenos a -20C, a 2 mL del antgeno se aadieron 2 mL de KOH y 4 gotas de CuSO4,La lectura se realiz a una longitud de 545 nm, en un espectrofotmetro Genoma (Jenway). Se midieron las absorbancias de las muestras.
Hidrolisis cida y cromatografa en capa fina de los aminocidos. De 24-48 horas se coloco 1 mL del extracto en 50ml HCl a 110C. La reaccin de la cromatografa se realiz con nihadrinina en silica gel y el diluyente butanol: cido actico: agua en proporcin 40:20:40.
Anlisis Estadstico.- Se utiliz el paquete estadstico R. Se realiz la prueba de t para dos muestras con supuestas varianzas iguales para mostrar si existe diferencia significativa entre las medias de cada tratamiento. Se trabaj con un = 5%.
RESULTADOS La curva de calibracin se realiz con Newborn Calf Serum (suero de ternero neonato), (Gibco). La concentracin del blanco no se encontraba disponible en el recipiente, as que se trabaj con una concentracin aproximada de 45 mg/Ml de suero de ternero neonato. Se realizaron diferentes disoluciones del blanco para obtener una curva que nos permita detectar la concentracin en un rango preciso.
Tabla 1. Parmetors de la curva de calibracin de suero de ternero neonato
La curva de calibracin muestra que a medida que se aumenta la concentracin de la protena, la absorbancia tambin aumenta. Lo que permite realizar una regresin lineal (una lnea que se ajuste a la mayor cantidad de puntos, Figura 1), para obtener una ecuacin de primer grado: y = 0,011x + 0,137, despejando el valor de x, llegamos a la ecuacin de inters: x=90.9 y-12.5, concentracin en funcin de absorbancia, de esta manera se puede interpolar las concentraciones de protena total conocida la absorbancia de la muestra. Se debe notar que el coeficiente de correlacin, R 2 =0.748 es debido a la medicin del blanco; sin embargo, se acepta la ecuacin obtenida porque la mayora de puntos atraviesan la grfica. Comment [L1]: COMO SE AJUSTO NO ENTIENDO?????? Comment [L2]: NO ME EXPLICAN ESTA CURVA DE CALIBRACION EN MATERIALES Y METODOS
FIGURA 1. Curva de calibracin.
Se analizaron los protocolos, filtrar (F) y sin filtrar (SF) despus de la centrifugacin para la obtencin del antgeno. Cada tratamiento posee 6 repeticiones, se midi la absorbancia con el protocolo de biuret. A partir de la absorbancia y con la ecuacin: x(concentracin)=90.9y(absorbancia)-12.5, se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Anlisis de las muestras de antgenos Muestra Absorbancia Protena Total (mg/mL) Muestra Absorbancia Protena Total (mg/mL) F1 0,233 8,6797 SF1 0,341 18,4969 F2 0,283 13,2247 SF2 0,346 18,9514 F3 0,291 13,9519 SF3 0,306 15,3154 F4 0,302 14,9518 SF4 0,304 15,1336 F5 0,269 11,9521 SF5 0,277 12,6793 F6 0,232 8,5888 SF6 0,238 9,1342 F: Filtrado, SF: Sin Filtrar Segn la prueba t se pudo evidenciar que existe una direferncia significativa entreSe realiz una prueba t para determinar si existe una diferencia significativa entre cada protocolo. Se aplic Ho: 1- 2=0, bilateral y una signifancia del 5%. El valor p se muestra en la Tabla 3, 13.19% (mayor a 5%), por lo que se acepta la hiptesis nula. En otras palabras no existe una diferencia significativa entre la media de ambos tratamientos. Sin embargo, se debe notar que dentro del mismo tratamiento existe variacin entre las repeticiones debido a ciertas varias dentro del mismo protocolo, de las cuales se discute despus.
Tabla 3. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales Filtrado Sin Filtrar Media 11,8915 14,9518 Varianza 7,323053076 13,54770328 Varianza agrupada 10,43537818
Diferencia hipottica de las medias 0
Grados de libertad 10
Estadstico t -1,640856242
P(T<=t) dos colas 0,131861477
y = 0.011x + 0.1374 R = 0.7484 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 A b s o r b a n c i a
Protena total (mg/mL) Curva de calibracin Comment [L3]: POR FAVOR ESCRIBIR UN BUEN TTULO ENTENDIBLE Y COMPLETO LA FIGURA HABLA POR SI SOLA Comment [L4]: NO ME EXPLICAN EN MATERIALES Y METODOS ESTO DE LOS PROTOCOLOS FILTRAR O SIN FILTRAR Comment [L5]: ESTO VA EN MATERIALES Y METODOS Valor crtico de t (dos colas) 2,228138842
En la cromatografa de capa fina se consiguieron los siguientes valores de Rf (coeficiente de correlacin). Despus de la hidrolisis cida de las protenas, lo que permiti la separacin de los aminocidos.
Tabla 4. Coeficientes de correlacin obtenidos de la cromatografa de capa fina(propanol 80%) Rf (experimental) Aminocido Rf (terico) 38 Ala 39.5 16.2 Asn 16.5 14.3 Asp 14.5 11 Cis 11.5 22.9 His 23 21.2 Glu 21.5 50 Val 51
Los aminocidos presentes en el extracto de F. heptica son: alanina, asparragina,cido aspartico, cistena, histidina, glutamina, valina que son parte de las proteasas presentes en los antgenos de excresin secrecin.
DISCUSIN
En el protocolo de Biuret, existe un error en la calibracin debido al valor de R 2 es 0.748, lo que demuestra que no todos los datos se correlacionan. La causa ms probable fue el blanco al momento de encerar, se debi haber cometido un error en este momento. Sin embargo, la linealizacin es la adecuada considerando el dato inicial. No existe una diferencia significativa entre los dos tipos de tratamientos: filtrado o sin filtrar.
Existe una mayor cantidad de protena en el tratamiento que es sin filtrar ya que permite el paso de ms molculas, en cambio con el filtro el paso de molculas disminuye. Sin duda se debe realizar otras comparaciones para comprobar que efectivamente no existe diferencia, ya que dentro del mismo tratamiento, encontramos gran cantidad de varianzas. Se debe destacar que los tratamientos las repeticiones de la 2 a la 5 son semejantes, en contraste con la 1 y 6 que forman otro grupo.
La familia de las cistena proteasas engloba a todas aquellas proteasas que presentan un residuo de cistena en su centro cataltico (Jordn et al., 2000). Otros aminocidos que forman parte del sitio activo son la Glu, His y Asn (Brucchaus et al., 2003). Pueden ser identificados dentro de la secuencia primaria debido a que estn rodeados por aminocidos bien conservados. El grupo tiol es un centro nucloeflico debido a la cercana de la His, que dona electrones, el grupo sulfhidrilo (Cys) y el imidazol (His) generan una dada liberadora de carga tiolato-imisazolium, estabilizado por una asparagina y una glutamina, altamente conservadas (Sajid y McKerrow, 2002). Esta podra ser una indicacin por que se obtuvieron este tipo de aminocidos en la comatografa de capa fina, as que es probable que dentro del extracto estn presentes este tipo de protenas.
Los anticuerpos dirigidos contra las cistenas proteasas puede tener un efecto inhibitorio en su actividad proteoltica, como los anticuerpos anti-captesina L de F. heptica (Smith et al., 1994). Las cistena proteasas son muy inmunognicas por lo que se han utilizado en varios artculos sobre antgenos de F. heptica. Las proteasas se requieren para la salida de los helmintos de los Comment [L6]: FALTA EXPLICAR MEJOR ESTA PARTE QUE PASO CON LOS DATOS DE EL PRIMER ENSAYO CON EL SEGUNDO ES DECIR VERSUS CROMATOGRAFIA HAY DIFERENCIA OBTUVIERON ALGO????? Comment [L7]: FALTA TRABAJAR EN DISCUSION Comment [L8]: PORQUE ESTOS ERRORES NO SE PUEDEN COMETER AL MOMENTO DE ENCERAR Comment [L9]: EXPLIQUENME COMO ESTE PARRAFO EMPATA CON SU TRABAJO, HAY QUE MEJORAR LA REDACCION quistes protectores o huevos (Ward et al.,1997; Lustigman et al., 1996; Sung y Dresden, 1986). Las csteina proteasas son importantes para la invasin del hospedero por varios parsitos (Keene et al., 1986; Reed et al., 1989). Por lo que es argumentado porque la cistena proteasa, se debe encontrar en el extracto de F. heptica.
AGRADECIMIENTOS
A todos nuestros compaeros de Inmunologa, que nos ayudaron con su protocolo. A las docentes Mara Augusta Chvez, Blanca Naranjo .. A la Lic Silvana Granda laboratorista de la carrea de Biotecnologa por y al laboratorio de Biotecnologa por su apoyo en nuestra investigacin, en especial a Silvana Granda.
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Comment [L10]: ESTE PARRAFO ES BUENA IDEA PERO HAY QUE CONCATENAR CON LOS RESULTADOS OBTENIDOS Comment [L11]: DE QUE CARRERA ? DE QUE UNIVERSIDAD??? SON DE POSGRADO O PREGRADO Y PORQUE??? REDACTAR MEJOR Comment [L12]: TODAS LAS CITAS DEL TEXTO DEBEN ESTAR ENUMERADAS AQU Y VICEVERSA CUIDADO???? Espino AM, Dumnigo BE, Fernandez R, Finlay CM. 1987. Immunodiagnosis of human fasciolosis by enzyme linked immunosorbent assay using excretory-secretory products. Am J Trop Med Hyg; 37: 605-8. Hammond J A and Sewell M M H. 1990. Diseases caused by helminthes. In: M M H Sewell and D W Brocklesdy (edirors. Handbook on Animal Diseases in the Tropics, 4th edition.(CTVM Edinburgh University).pp 119-123 Jordn J., Galindo M., Cea V., Gonzlez C. 2000. Cistena proteasas y neurodegeneracin. REV NEUROL 2000; 31 (4): 333-340. Disponible en: http://www.uclm.es/profesorado/jjordan/pdf/review/1.pdf [25/11/2013] Kassuku A A, Christensen N O, Monrad J, Nansen P and Knudsen J. 1986. 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