I.

INTRODUCCIN

La guanbana (Annona muricata L.) es un rbol pequeo de 5-6 m
de altura, con hojas grandes y brillantes de color verde oscuro. Produce un
gran fruto comestible que es de 15-20 cm de dimetro, de color amarillo-verde
que tiene la carne blanca en su interior., el fruto se encuentra entre las pulpas y
jugos de preferencia en los consumidores; adems, es considerada una planta
medicinal que constituye una alternativa comn para el tratamiento del cncer
gstrico y gastrointestinal en muchos pases del mundo.
Por otra parte, en la farmacologa ha empezado a cobrar fuerza el
hecho que su tallo, sus hojas y semillas han sido usadas histricamente en
medicina tradicional por los pueblos indgenas dadas sus capacidades
antitumorales, parasiticidas y anti-diarreicas
El fruto posee propiedades funcionales y por ello es necesario
obtener datos cientficos sobre las hojas, del cultivo que se viene realizando en
nuestra regin, ya que las hojas se comercializan indicando que posee
propiedades medicinales benficas para la salud, planteando los siguientes
objetivos para el presente trabajo de investigacin:
En el desarrollo de la prctica se plante los siguientes objetivos:
- Conocer el funcionamiento y distribucin de reas del centro de
investigacin.
2

- Utilizar mtodos para realizar la caracterizacion qumica, fitoquimica y
capacidad antioxidante de las hojas de guanbana.






















3




II. REVISION DE LITERATURA
2.1. Generalidades de guanbana
La guanbana (annona muricata L.), soursop en ingls, graviola en
portugus, es originaria de Amrica y frica tropical, y debido a la llegada de
los espaoles a Amrica fue distribuida en los trpicos y hoy en da es posible
encontrarla en el oeste de la India, en Norte y Suramrica, Islas del Pacfico y
en el Sureste de Asia (CORREA, 2012). Es una fruta tropical extica y en
nuestra amazonia peruana es cultivado en los departamentos de En la selva
peruana, se cultiva en los Departamentos de Loreto, San Martn y Ucayali, su
cultivo es dirigido al consumo de pulpa (SIAMAZONIA, 2001).

2.2. Clasificacin taxonmica de guanbana
La guanbana (Annona muricata L.), originaria de Amrica y frica
tropical, pertenece:
Gnero: Guanaban
seccin: Evannona,
divisin: Spermatophytia,
subdivisin: Angiosperma,
clase: Dicotilednea,
subclase: Archylamudeae,
Orden: Ranales,
4

Familia: Anonaceae,
Gnero: Annona
Especie: Annona muricata L.

Su ptimo desarrollo se da en altitudes menores a 1.200
msnm, con temperatura media entre 25 y 28C, humedad relativa entre 60 y
80 %. Crece y produce bien en una amplia gama de condiciones edficas.
(MRQUEZ, 2009).

2.3. Variedad de guanbana y caractersticas del cultivo
2.3.1. Variedades de guanbana
Entre las numerosas especies del gnero Annona, las ms
conocidas son: A. reticulata L., A. squamosa L., A. cherimolla Mill y A. muricata
L., siendo est ltima la denominada guanaba en los pases de habla hispana,
y la que presenta las mejores caractersticas para su industrializacin. (AVILA,
F. 2005).
El rbol o arbusto es de 3 a 10 m de alto, ramificado, cnico,
frondoso, con hojas ovaladas elpticas de 2 a 6 cm de ancho por 6 a 12 cm de
largo, con yemas axilares, (MENDEZ, 2003).





5

2.4. Composicin qumica de la hoja de guanbana
ASCZUBI (2008), menciona que en las hojas de guanbana existen
Lactonas tales como: Annohexocina, Annomuricina A, B, C y E, Annomutacina,
Annopentocinas A, B y C, Muricoreacina, Gigantetronemina, Murihexocina A y
C, Javoricina; Isoquinolinas: Anonaine, Anoniine, Atherospermine, Coreximine;
Lpidos: Acido gentsico, Acido lignocrico, Acido linoleico, Acido esterico.

2.5. Antioxidantes y Radicales libres
2.5.1. Antioxidantes
Los compuestos antioxidantes estn en la capacidad de inhibir la
oxidacin de molculas y por lo tanto actuar como protectores de molculas
biolgicas contra especies reactivas de oxgeno o radicales libres. (CORREA et
al., 2012).
- Polifenoles
Los efectos de los polifenoles son fundamentalmente
consecuencia de sus propiedades antioxidantes (QUIONES et al., 2012)
La concentracin en polifenoles de cualquier alimento es muy
variable, porque depende de muchos factores tales como la variedad o el grado
de maduracin del vegetal. Tambin su biodisponibilidad es muy variable
(CREUS, 2004).

2.5.2. Radicales libres
Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades
que provocan reacciones en cadena, estas reacciones solo son eliminadas por
6

la accin de otras molculas en estos procesos txicos en el organismo, los
llamados sistemas antioxidantes defensivos. Se ha demostrado que el
organismo posee un nmero de mecanismos a travs de los cuales produce y
a la vez limita la produccin de especies reactivas de oxgeno. Un exceso de
radicales libres suele iniciar el dao de la pared vascular y en este proceso se
encuentra implicado el colesterol LDL; se ha demostrado en la incidencia de
enfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes.
(RAMOS et al., 2008).
a) Radical 1,1 difenil-2- picril-hidrazil (DPPH)
Es un radical libre estable y se utiliza como indicador para medir la
capacidad de secuestro de cualquier compuesto que posea actividad
antioxidativa. El principio del mtodo de DPPH consiste en la sustraccin de un
tomo de hidrgeno proveniente de un donador (ejemplo compuesto fenlico)
para generar el compuesto difenilpicrilhidrazina y una especie radical. En este
proceso, la reaccin desarrolla un cambio de color de violeta a amarillo a
medida que disminuye la absorbancia detectable a 515 nm. (LEBEAU et. al.,
2000).

2.6. Laboratorio de investigacin
Un verdadero laboratorio de investigaciones (el de una Universidad, por
ejemplo) tiene por misin producir conocimiento cientfico bsico o aplicado por
el conocimiento mismo, suelen tambin producir tecnologas. Es tambin
natural que ello ocurra porque la tarea de investigacin no tiene fronteras
rgidas y por lo tanto muchos investigadores no se detienen en la obtencin de
7

un determinado conocimiento sino que se interesan en su aplicacin y realizan
as trabajos que no son especficos de un laboratorio de investigaciones sino
de una fbrica de tecnologa (SBATO Y KAPLAN, 1972).
Su objetivo es contribuir al desarrollo de las ciencias biolgicas,
biotecnolgicas y de la salud a travs de la resolucin de problemas sociales o
econmicos. Siempre en la bsqueda de la excelencia en investigacin se
busca atraer nuevos grupos de investigacin que ayuden a hacer crecer la
actividad de investigacin. (FUNDACIN PABLO CASSARA, 2012).

2.7. Mtodos de Anlisis
2.7.1. Cuantificacin de Polifenoles totales
Los compuestos fenlicos son antioxidantes naturales, por lo
general se encuentran en frutas y verduras. La preparacin de muestras para
los estudios analticos es necesario determinar la composicin polifenlica en
estas matrices. El sistema de extraccin ms utilizado es extraccin lquido-
lquido (LLE), que es un mtodo barato, puesto que implica el uso de
disolventes orgnicos, pero requiere largos tiempos de extraccin, dando lugar
a la degradacin extracto posible. Asimismo, extraccin en fase slida (SPE) se
puede utilizar en muestras lquidas. Las tcnicas modernas, que han ido
reemplazando a las convencionales, incluyen: extraccin con fluidos
supercrticos (SFE), la extraccin de lquido presurizado (PLE), la extraccin
asistida por microondas (MAE) y la extraccin asistida por ultrasonido (EAU).
Estas tcnicas alternativas reducir considerablemente el uso de disolventes y
acelerar el proceso de extraccin (GARCIA et. al., 2010).
8

El mtodo espectrofotomtrico desarrollado por Folin y Ciocalteau,
para la determinacin de fenoles totales, se fundamenta en su carcter
reductor y es el ms empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de cidos
fosfowolfrmico y fosfomolibdco en medio bsico, que se reducen al oxidar los
compuestos fenlicos, originando xidos azules de wolframio (W8O23) y
molibdeno (Mo8O23). Los resultados se expresan en mg de cido glico por
100 g de pulpa de frutos. (KUSKOSKI et. al., 2005).

2.7.2. Determinacin de la capacidad antioxidante mediante el
radical 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH)
Se evala la capacidad que tiene un posible antioxidante para
neutralizar un radical. El compuesto 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH) es un
radical estable que presenta una intensa coloracin violeta y que absorbe
radiacin a 517 nm, de forma que su concentracin se puede determinar
mediante mtodos espectrofotomtricos. Se determina la concentracin inicial
de DPPH y la concentracin resultante una vez que se ha aadido el posible
antioxidante, de forma que una disminucin de la absorcin de radiacin se
traduce en una disminucin de la concentracin de DPPH debida a la cesin de
electrones de la especie antioxidante (RIVERO Y BETANCORT, 2009).

2.7.3. Cromatografa de capa fina.
La expresin Thin Layer Chromatography (T. L. C.), consiste
esencialmente el empleo de capas finas y uniformes de adsorbentes
normalizados sobre soporte rgidos (placas de vidrio, porta-objetos de
9

microscopa, polister, etc.), en las que se depositan mezclas o sustancias
puras, para que mediante desarrollo con un fase mvil (disolventes) en
una cubeta, puedan separarse e incluso identificar por medida de la
capacidad de adsorcin (AREAL Y BESSA, 2011).

2.7.4. Anlisis qumicos
Los anlisis comprendidos dentro de este grupo, tambin conocido
como anlisis proximales Weende, Estos anlisis nos indicarn el contenido de
humedad, protena cruda (nitrgeno total), fibra cruda, lpidos crudos, ceniza y
extracto libre de nitrgeno en la muestra. (FAO, 1993).














10




III. PLAN DE TRABAJO

3.1. Reconocimiento del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia- CIDBAM
3.1.1. Descripcin y ubicacin del CIDBAM
3.1.2. Organizacin
3.2. reas del Centro De Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico
de la Amazonia- CIDBAM
3.2.1. rea de micropropagacion in vitro d vegetales
3.2.2. Area de HPLC
3.2.3. Area de cultivo celular
3.2.4. Area de biologa molecular
3.2.5. Area de antioxidantes
3.3. Anlisis realizados
3.3.1. Materia prima
3.3.2. Preparacin de extractos
3.3.3. Mtodo de anlisis
3.3.3.1. Anlisis qumico proximal
3.3.3.2. Anlisis fitoqumico
3.3.3.3. Anlisis de polifenoles totales
3.3.3.4. Anlisis de la capacidad antioxidante

11

3.4. Caracterizacin qumica y fitoqumica de las hojas de guanbana
3.5. Capacidad funcional de las hojas de guanbana
3.5.1. Determinacin de polifenoles totales
3.5.2. Anlisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibicin del
radical DPPH (IC
50
) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH)





















12




IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO

4.1. Reconocimiento del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia (CIDBAM)
4.1.1. Descripcin y ubicacion del CIDBAM
El CIDBAM esta orientada promover el desarrollo socio-econmico,
promueve investigaciones orientado al mejoramiento del conocimiento en reas
de importancia para la Amazonia Andina. Promueve el entrenamiento y
educacin de estudiantes con el fin de transmitir los conocimientos y resultados
cientficos de las investigaciones biotecnolgicas.
El centro de investigacin para el desarrollo Biotecnolgico de la
Amazonia (CIDBAM), de la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS);
ubicada en Av. Universitaria s/n, distrito de Rupa Rupa, Provincia de Leoncio
Prado, regin Hunuco; a una altitud de 667 m.s.n.m. con un clima tropical
hmedo y una temperatura promedio de 24C y humedad relativa media de
89%.
4.1.2. Organizacin
El CIDBAM viene funcionando fundamentalmente con fines
acadmicos, investigacin, produccin y extensin tecnolgica que depende
directamente del Vice-rectorado Acadmico. La organizacin se encuentra
detallada en la Figura 1 Anexo I.
13

4.2. Areas del Centro de Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico
de la Amazona
El Centro de Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico de la
Amazonia CIDBAM, actualmente se cuenta con diferentes ambientes,
equipos, materiales y reactivos, su distribucin se describe en la Figura 2
Anexo II.

4.2.1. rea de micropropagacin in vitro de vegetales
En esta rea se realiza el cultivo in vitro de tejidos vegetales, rea
con caractersticas y medios para el buen desarrollo de tejidos y clulas que se
trabajen, emplendose una serie de tcnicas y mtodos de micropropagacin
en diferentes cultivos de nuestra amazonia.
Materiales
- Tubos de ensayo Genx Mate (10ml, 50ml).
- Vasos de precipitacin (100ml, 500ml, 100ml).
- Fiolas (1000ml, 500ml, 50ml, 10ml).
- Baguetas de vidrio estriles.
- Placas petri.
- Asa de siembra.
- Pipetas de 1 mL.
- Matraz.
- Mecheros.
- Probetas.
- Termmetros.
14

Equipos
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-
312A, 220-240 V.
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo 25x-2,
220-240 V.
- Equipo de balanza analtica AE 163 (ADAM TOLEDO,
Switzerland).
- Equipo de flujo laminar marca PIDESTAL modeloODH4- 9340A,
220-110 V.
- Autoclave NAPCO model 9000 D, 32 psi, 130C, 230 V, 6,3 A,
1430 w, USA.

4.2.2. rea de HPLC
rea de Cromatografa Lquida de Alta Performancia (HPLC),
dedicndose cuanto a la separacin, aislamiento, identificacin y cuantificacin
compuestos desconocidos que el investigador requiera con estndares
adquiridos por el centro de investigacin.
Materiales
- Vasos de precipitacin (1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL,
10mL).
- Fiolas (1000 mL, 500mL, 100mL, 50 mL 10 mL).
- Probetas.
- Termmetros.
- Tips, FISHERBRAND (1000 L, 200 L, 100 L).
15

- Micropipetas, Gene Mate (1000 L, 200 L, 100 L).
- Matraces erlenmeyer, PIREX.
Equipos
Los equipos que se encuentran en esta rea cuentan con ficha de
uso, ficha de registro para cada uno de los equipos que se utilicen durante las
evaluaciones que se realizan, estos equipos son:
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientificindustrias
SITM).
- Equipo de cromatografa lquida de alta performancia (HPLC)
modelo LC-10AVP (ShimadzuScientific, MD, USA.). Equipado
con: Desgasificador modelo FCV 10AL VP, Bomba modelo LC-
10ATVP, Columna cromatogrfica C18-110R Gemini, Horno de
columna modelo CTO 10ASVP Detector UV-Vis modelo SPD-
10AVVP, Controlador Modelo SCL 10AVP, Software de
interfase CLASS-VP, Computadora compatible USB-52X,
Inyector de muestra de capacidad 20 L.
Reactivos y solventes
Los reactivos encontrados en esta rea estn debidamente
codificadas y registradas para su fcil ubicacin en estantes separados de los
materiales y equipos para evitar contaminacin o accidentes, tenemos:
- L (+) cido ascrbico puro, Sigma Chemical.
- (+)-catequin, Sigma Chemical.
- Etanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
- Metanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
16

- cido actico, Sigma Chemical.
- Acetonitrilo (grado HPLC), Sigma Chemical.

4.2.3. rea de cultivo celular
En esta rea se realiza la bsqueda de microorganismos
productoras de enzimas, contando con un ambiente estril con reactivos,
materiales y equipos empleados en cada uno de los mtodos empleados.
Materiales
- Erlenmeyers estriles.
- Pipetas bacteriolgicas estriles.
- Baguetas de vidrio estriles.
- Placas petri.
- Asa de siembra.
- Pipetas.
- Matraz.
- Mecheros.
- Gradillas.
- Micro pipetas.
Equipos
- Incubadora Labor MUSZERIPARI MUVER LP 111, 220V, 0,19
Kw, HUNGARA.
- Agitador orbital de bandeja BAMSTEAD internacional Lab-Line,
Modelo MaxQ2000, 220 240V, 0.4 A, 45 w, 50/60 Hz, 500 rpm
USA.
17


Medios de cultivo
- Agar-agar Merck GERMANY.
- Agar OGY Merck GERMANY.
- Agar glucosa Merck GERMANY.
- Agar Sabouraud Merck GERMANY.
- Extracto de carne seco granulado Merck GERMANY.
- Extracto de levadura BIOGEN.
- Peptona de carne obtenida por digestin pancretica granulado
Merck GERMANY.
- Glicerina Merck GERMANY.
- Goma arbiga SIGMA ALDRICH.

4.2.4. rea biologa molecular
Esta rea est relacionada con otros campos de la Biologa y la
Qumica, particularmente Ingeniera gentica y Bioqumica. La biologa
molecular concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de
los diferentes sistemas de la clula.
Materiales
- Ermelenyer estriles de 500 ml de capacidad.
- Pipetas bacteriolgicas estriles.
- Mecheros.
- Gradillas.

18

Equipos
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo TVL-
312A, 220-240 V.
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-
312A, 220-240 V.
- Equipo de termociclador marca MINICYCLER TM modelo MJ
Research - PTC-150, 220-240 V.
- Destilador modelo D 7036 (Barnstead).

4.2.5. rea de antioxidantes
Esta rea se encamina a la evaluacin del contenido compuestos
funcionales de productos a estudiar. Evaluando la capacidad antioxidante,
cuantificacin de polifenoles entre otros.
Las muestras que cada investigador posee se encuentran
debidamente codificadas para facilitar su identificacin e indicar si aun estn
en condiciones para su evaluacin.
Materiales
Los materiales se encuentran ordenadamente en estantes
separados a los estantes de reactivos, estos despus de usadas son lavados
adecuadamente para que en prximos usos no alteren resultados o causen
reacciones no esperadas, tenemos:
- Materiales de vidrio :
- Frascos de vidrio con tapa.
- Embudos
19

- Matraces (50, 250 ml) Kimax USA, Schott Duran Germany.
- Probetas (100, 250 ml) Brand Germany.
- Pipetas con mbolo (10 ml) Pyrex USA
- Vasos de precipitacin (50, 100, 250,500 ml) Pyrex USA.
- Tubos de plstico con tapa (15 20 ml).
- Microtubos (1.5 2.0 ml).
- Micropipetas (10 100 L), (100 1000 L).
- Tips (200 - 1000 L ).
- Cubetas de poliestireno (1cm x 1cm x 4.5cm).
- Bolsas de polietileno.
- Papel metlico.
- Papel de filtro rpido.
- Asa de siembra
- Placas Petri
Equipos
Los equipos que se utilizan en esta rea cuentan con indicaciones
de uso, donde se explica grficamente el modo de uso del equipo, as mismo
cuentan con ficha de registro donde cada investigador registra sus datos fecha
y hora de uso.
- Centrifuga marca Hettich modelo MIKRO 22R y velocidad
10,000 rpm.
- Rotavapor BUCHI R-200.
- Autoclave NAPCO model 9000 D, 32 psi, 130C, 230 V, 6,3 A,
1430 w, USA.
20

- pH metro marca METTLER TOLEDO.
- Espectrofotmetro modelo Genesys 6 (Thermo Electrn
Corporation).
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientific industrias
SITM).
- Bao mara modelo YCW-010E (Associated With Cannic, Inc,
USA).
- Equipo de ultrasonido.
- Desionizador modelo D 7035 (Barnstead).
- Balanza analtica: digital Precission, capacidad mxima 210 g.,
modelo ESJ 210-4.
- Balanza analtica digital, sensibilidad 0.0001g. U.S.A. marca
Sartorius.
- Balanza analtica modelo AE 163 (METLER TOLEDO,
Switzerland).
- Horno microondas SANSUNG.
- Sonicador JAC ULTRASONIC 1002.
- Estufa modelo ODH6- 9240A (TOMOS Heatring Drying Oven).
- Congelador FFV-2065FW (Frigidaire, USA).
- Congelador vertical BOSCH.
- Refrigerador Icebeam Door Cooling LG GR-5392QLC.
Reactivos
Los reactivos de encuentran debidamente codificado existiendo un
listado de estos para su fcil ubicacin, se cuenta con fichas donde se reporta
21

el gasto de cada reactivo por cada investigador, ubicados en estantes muy
separados de los materials:
- cido glico al 98.1% Sigma Aldrich.
- (+) Catequina: pureza 98%. Sigma Chemical.co
- 1,1-Diphenyl-1-picrilhydrayl (DPPH; Sigma Aldrich, USA).
- 2,2-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)
diammonium salt (ABTS; Sigma Aldrich, USA).
- 2,2-azobis (2-amidino-propane) (ABAP; Sigma Aldrich, USA)
- Fosfato de potasio dihidrogenado (Scharlau, UE).
- Etanol al 99.99% Merck KGaA.
- Folin-ciocalteus phenol reagent, 2N, Sigma Aldrich.
- Carbonato de Sodio (Na2CO3) p.a. ISO. Scharlau.
- Hidrxido de Sodio (NaOH) en lentejas p.a. ISO. Merck.
Germany.
- Agua destilada desionizada (H2Odd).

4.3. Anlisis realizados
4.3.1. Materia prima
Las hojas de guanbana fueron recolectadas del fundo
MILAGROS en el km 27.8 carretera Tingo Mara- Aguayta. , se trasladaron
al Centro de Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico de la Amazonia
(CIDBAM) para su respectivo acondicionamiento y su posterior anlisis
siguiendo cada uno de las operaciones descritas en la Figura 3.

22




















Figura 3. Flujograma de operaciones para la preparacin de la muestra.

4.3.2. Preparacin de extractos
4.3.2.1. Preparacin del extracto para el anlisis fitoqumico
Para la obtencin del extracto se pes 30 g de muestra seca
y se adicion 140 mL de alcohol al 96 %, la mezcla fue macerada en envases
de vidrio color mbar, puestas en el agitador orbital a temperatura ambiente
COSECHA
SELECCIN-
CLASIFICACION
TRANSPORTE
RECEPCION
BLANQUEADO
OREADO
SECADO
MOLIDO
Ebullicin/60seg
T
O
Amb. / 12horas
65
O
C/ 12 horas
ENVASADO
SELLADO
CODIFICADO
ALMACENADO
HOJAS APICAL, MEDIA Y BASAL

23

durante siete das; posteriormente la mezcla fue filtrada con papel de paso
rpido con la ayuda de una bomba de vaco, el filtrado se coloc en platos
hondos. Finalmente la muestra se llev a concentrar en una estufa a 40 C por
un periodo de tiempo aproximado de 3 a 4 dase.
4.3.2.2. Preparacin de extracto para cuantificacin de
polifenoles totales y determinacin de la capacidad
antioxidante
Los extractos fueron preparados a partir de las muestras
secas; se pesaron 1,5 g de muestra y se enraz en 15 mL de solucin
hidroalcohlica 50:50 (agua: etanol), se transfiri a frascos de vidrio de color
mbar, se taparon hermticamente cada frasco y se llev a agitacin por 24
horas a temperatura ambiente. Pasado el tiempo se filtr el extracto con papel
filtro de paso rpido. Finalmente la solucin filtrada se almacen en frascos
mbar a -20 C como se muestra en la Figura 4.










24










Figura 4. Flujograma para preparacin de extracto hidroalcohlico para los
anlisis de actividad antioxidante y polifenoles totales.

4.3.3. Mtodo de anlisis
4.3.3.1. Anlisis qumico proximal
- Humedad, mtodo 23.003 AOAC (1997).
- Protena, mtodo 991.29 AOAC (1997).
- Grasa, mtodo 935, 60 AOAC. (1997).
- Fibra, mtodo 930.20 AOAC (1997).
- Cenizas, mtodo 942.50 de calcinacin directa AOAC
(1997).
- Carbohidratos, se determin por diferencia de los dems
componentes del anlisis fisicoqumico (HART y FISHER,
1991).

MUESTRA
SECA MOLIDA
EXTRACCION
HIDROALCOHO
LICA
AGITACION
FILTRADO
ENVASADO
ALMACENADO
Dilucin 50:50
24 h / 100 rpm
-20 C
1.5 g de muestra
25

4.3.3.2. Anlisis fitoqumico
Se determin por el mtodo de estudio de productos
naturales, descrito por LOCK DE UGAZ (1988).
Ensayo de Solubilidad
Para este procedimiento se tomaron pequeas cantidades de
muestra del extracto obtenido como se menciona en el tem 4.3.2.1 y se coloca
en diferentes tubos de ensayo, en los cuales se diluyeron con diferentes
solventes, aproximadamente 2 a 3 ml (n-hexano, acetona, diclorometano,
metanol, etanol y agua destilada). Se dejo en reposo por un tiempo de 2 a 4
minutos, el solvente con mejor solubilidad frente al extracto seco se tom para
la marcha fitoqumica.
Marcha fitoqumica
La deteccin de constituyentes qumicos del extracto etanlico
se realiza siguiendo la marcha fitoqumica general.
Ensayos cromatogrficos
En la cromatografa en capa fina, se usa como sistema de
solventes: metanol: Diclorometano (1:4 v/v), presentndose tres manchas a la
luz UV/V 254 nm y 365 nm, luego se realiz la cromatografa en escala
preparativa y fueron reveladas con los reactivos FeCl
3
(1%), H
2
SO
4
(50%) y el
reactivo Wagner.
4.3.3.3. Anlisis de cuantificacin de polifenoles totales
Se realiz mediante el mtodo de espectrofotometra de
absorcin molecular desarrollado por Folin y Ciocalteau con modificaciones
descrito por SANDOVAL et al. (2001).
26

Curva patrn
Se tom 1.58ml de H
2
O destilada en un microtubo
procediendo a incorporar 20l de acido glico a concentraciones de 1; 0.5;
0.25; 0.125 y 0.0625 mg/ml seguidamente se aadi 100l de folin, 300l de
Na
2
CO
3
, finalmente; vortear toda la mezcla para incubar por 2horas en la
oscuridad y ser leda a 700nm.
Determinacin de polifenoles en hojas de guanbana
Se tom 1580 l de H
2
O desionizada en un microtubo
procediendo a incorporar 20l de la muestra seguidamente se incorpor 100l
de folin y finalmente 300l de Na
2
CO
3
para neutralizar la reaccin; vortear toda
la mezcla para incubar por 2 horas en la oscuridad y se realizo la lectura a
700nm. Los resultados se expresaron en miligramos equivalentes de Acido
glico (AG) por 100 gramos de muestra.
4.3.3.4. Anlisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de
inhibicin del radical DPPH (IC
50
) radical 1,1-diphenyl-2-
picrilhydrazil (DPPH)
Mtodo de inhibicin del radical DPPH (2,2-diphenyl-
picrilhydrazyl), descrito por Brand- Williams modificado por SANDOVAL et
al.,2001. El extracto utilizado para este anlisis correspondi a 100 mg/ml a
partir de este se prepar soluciones de trabajo, se tom una cubeta de
poliestireno se adicion 25 L de la solucin y 975 L de solucin DPPH a 100
M, se realiz la lectura en un espectrofotmetro de UV/VIS a una longitud de
onda de 517 nm con un tiempo de 10 min e intervalos de tiempo de 30
segundos como se observa en la Figura 5. Para determinar el porcentaje de
27

inhibicin se utiliz la siguiente ecuacin:
( )
100 %
(

=
AbsControl
AbsMuestra AbsControl
DPPH Inhibicion

Donde: Abs Control: Absorbancia del control
Abs Muestra: Absorbancia de la muestra en 10 min.









Figura 5. Flujograma para la determinacin de la capacidad antioxidante.

4.4. Caracterizacin qumica y fitoqumica de las hojas de guanbana
4.4.1 Caracterizacin qumica de las hojas de guanbana
Se realiz el anlisis fisicoqumico de las hojas de guanbana pice,
medio y basal de la planta, siguiendo los mtodos ya descritos en el mtodos
de anlisis. Los resultados se muestran en el Cuadro 1.

10000 rpm/10min/4C
517nm/10min


r
3
r
2
r
1

LECTURA
DETERMINACIN (% de inhibicin, IC
50
)
CENTRIFUGADO
DILUCIN
REACCIN (DPPH)
EXTRACTO (100mg/mL)
28

Cuadro 1. Resultado del anlisis qumico proximal de las hojas de guanbana.




Partes Hojas
Analisis Fisicoqumico APICAL MEDIO BASAL
BH1 BS2 BH1 BS2 BH1 BS2
Humedad 81.390.91 ---- 70.131.20 ---- 66.500.64 ----
Protena (%) (N x 6.25) 2.150.13 11.540.16 3.550.23 11.870.29 4.590.27 13.680.60
Grasa (%) 0.900.05 160.01 1.850.04 6.210.12 2.590.04 7.720.05
Fibra (%) 3.900.18 20.950.06 6.180.36 20.670.37 7.180.19 21.420.36
Ceniza (%) 0.980.06 5.280.07 1.790.06 6.020.23 2.770.12 8.260.25
Carbohidratos (%) 3 10.680.51 57.380.24 16.490.56 55.240.40 16.380.38 48.921.15
1
% Base hmeda,
2
% Base seca,
3
Por diferencia

29

4.4.2 Caracterizacin fitoqumica de las hojas de guanbana
- Ensayo de solubilidad
Durante el ensayo de solubilidad se mostro que tan soluble era el
extracto frente a los diferentes solventes buscando un solvente en el cual se
obtena una mejor dilucin para proseguir con la marcha fitoqumica como se
puede apreciar en el Cuadro 2, obteniendo una mayor solubilidad con etanol en
todos los extractos de los estadios de las hojas de guanbana.
Cuadro 2. Resultado de solubilidad en los extractos de las hojas de
guanbana.
Estadios de las hojas de guanbana
Solvente Apical Medio Basal
ter de petrleo + + ++
Acetona + + ++
Benceno + ++ ++
Cloroformo ++ ++ +++
Etanol +++ +++ +++
Metanol ++ +++ +++
Agua destilada - - -
(-) Ausente; (+) Poca solubilidad; (++) Regular solubilidad; (+++) mayor solubilidad







Figura 6. Solubilidad de los diferentes estadios de las hojas de guanbana.

30

- Marcha fitoqumica de las hojas de guanbana
En el Cuadro 3 se muestran los resultados del anlisis fitoqumico
siguiendo el mtodo mencionado en la parte de marcha fitoqumica.

Cuadro 3. Resultado del anlisis fitoqumico de las hojas de guanbana.
Tipo de reaccin
Hojas de guanbana
Compuestos
pical Medio Basal
Ninhidrina - - - Aminocidos
Gelatina + + + Taninos
Tricloruro Frrico (FeCl
3
) +++ +++ +++
Compuestos
Fenlicos
Dragendorff + + + Alcaloides
Mayer + + + Alcaloides
NaOH 5% - Bortranger ++ + + Quinonas
Molish(o-naftol-H
2
SO
4

concentrado)
++ ++ ++ Glicsidos
Shinoda (Mg-HCl
concentrado)
++ ++ + Flavonoides
(-) Ausente; (+) Poca cantidad; (++) Regular cantidad; (+++) Abundante cantidad










Figura 7. Coloraciones en el anlisis fitoqumico de las hojas de guanbana.
31

- Anlisis cromatogrfico de las hojas de guanbana


Figura 9. Diagrama de una cromatografa de
capa fina (muestra -eluyente)




Figura 10. Diagrama de
una cromatografa de
capa fina (revelado de
las placas con luz UV)


4.5. Capacidad funcional de las hojas de guanbana
4.5.1. Determinacin de polifenoles totales
Los resultados obtenidos en la determinacin de polifenoles totales
expresada en mg equivalente de acido glico (EAG) se presentan en el
Cuadro 4.
Cuadro 4. Contenido de polifenoles en hojas de guanbana apical, media y
basal
32

TRATAMIENTO mg EAG/100 G
Apical 7088.78 304.40
Media 5922.95 175.62
Basal 3906.20 30.70

4.5.2. Anlisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibicin
del radical DPPH (IC
50
) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil
En cuanto a la capacidad de inhibicin del radical DPPH, los resultados se
observan en el Cuadro 5.
Cuadro 5. Efecto de las hojas de guanbana en la actividad antioxidativa.
Tratamientos
IC50,g/mL
Mxima Inhibicin, %
Apical 46.111.71
86.162.19
Medio 80.711.91
92.440.69
Basal 123.073.05
89.530.44













33





V. DISCUSIN

5.1. Referencia del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia (CIDBAM)
5.1.1. Descripcin y ubicacion
El CIDBAM esta orientada promover el desarrollo socio-econmico,
promueve investigaciones orientado al mejoramiento del conocimiento en reas
de importancia para la Amazonia Andina. Promueve el entrenamiento y
educacin de estudiantes con el fin de transmitir los conocimientos y resultados
cientficos de las investigaciones biotecnolgicas. CASTAEDA et al., (2010)
hace referencia sobre los centro de investigacin que es un lugar dotado de los
medios necesarios para realizar investigaciones, experimentos trabajos de
carcter cientfico o tcnico. asimismo PUCP (2012), menciona que un centro
de investigacin esta dedicado al desarrollo de proyectos e investigaciones en
diferentes campos del conocimiento.

5.1.2. Organizacin
En la Figura 1. se puede observar que el organigrama del CIDBAM
es de orden jerrquico, MCGRAW-HILL (2008), mencionan que las
organizaciones jerrquicas estn centralizadas y se estructuran por niveles, los
34

organigramas verticales tienen forma piramidal, representndose los niveles
jerrquicos de arriba abajo. El organigrama de la Figura 1 esta encabezada por
el Vicerector acadmico seguido por el director del centro; la FUNDACION DE
LA HUPA INVESTIGACION (2010), menciona que el director es el responsable
directo del funcionamiento y organizacin del laboratorio.
La UACH. (2007) menciona sobre las funciones principales del director:
- Vigilar el adecuado cumplimiento del objeto del Centro.
- Determinar las polticas, objetivos, estrategias y acciones para orientar el
trabajo del Centro.
- Aprobar sus Reglamentos Internos y en general la organizacin y los
sistemas internos de trabajo, y presupuesto de cada ejercicio anual.
- Aprobar la contratacin de crditos para financiar la ejecucin y
operacin de programas del Centro.
El laboratorio debe analizar y documentar todas las actividades que
realiza diferentes a las de ensayo o calibracin para determinar si se producen
conflictos de inters en personal clave de la organizacin. En el caso de que el
laboratorio pertenezca a una organizacin superior el anlisis debe incluir las
actividades realizadas por dicha organizacin (ISO/IEC 17025 , 2005).

5.2. Reconocimiento del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia- CIDBAM
Como se observa en el anexo II, Figura 2; el centro de investigacin se
encuentra dividida en reas marcadas, cada una brindando seguridad, en
cuanto a los sistemas de ventilacin solo el rea de HPLC cuenta con aire
35

acondicionado, GUARDINO (2000), menciona sobre las ventajas de separar en
reas un laboratorio:
- Separacin de las reas con riesgo elevado.
- Control de acceso a las reas de riesgo elevado.
- Diseo de sistemas de ventilacin independientes.
- Facilidad de evacuacin en casos de emergencia.
- Dificultad de propagacin de incendios.
- Control de la contaminacin.
Cada una de las reas reconocidas cuentan con materiales, equipos y
reactivos empleados en cada uno de los anlisis, estos se encuentran
ordenadas en estantes, los materiales los hay de material de vidrio, porcelana y
plstico
Los reactivos de cada rea se encuentran codificados respectivamente
para su fcil ubicacin, UPP (2012) menciona que los reactivos que se utilicen
en el laboratorio debern almacenarse adecuadamente, identificados y
separados de materiales.
Actualmente el centro no cuenta con un reglamento para el manejo y
desecho de sustancias peligrosas. INSTITUTO DE ECOLOGA (2005)
menciona que todos los laboratorios que utilicen sustancias peligrosas
debern contar con un reglamento para el manejo y desecho de las mismas.
Los equipos que se utilizan en el rea de antioxidantes cuentan con
indicaciones de uso, donde se explica grficamente el modo de uso del equipo,
as mismo cuentan con ficha de registro donde cada investigador registra sus
datos fecha y hora de uso, UPP (2012), menciona que cuando se haga uso de
36

cualquier equipo de laboratorio es de carcter obligatorio registrarse en la
bitcora, de no existir, reportarlo con el tcnico de laboratorio.
Las muestras usadas en los respectivos anlisis se encuentran
debidamente codificadas, la UPP, (2012) menciona que las muestras que se
guarden en los refrigeradores, congeladores, shaker, y equipos de incubacin,
deber estar etiquetada con la siguiente informacin:
- a) Nombre completo del alumno.
- b) Fecha y perodo que se mantendr almacenada.
- c) Tipo de muestra.
- e) investigador responsable.

5.3. Anlisis realizados
En el CIDBAM se realizan una serie de anlisis con datos similares o
cercanos a los reportados para evitar ciertos desperfectos en cuanto a
diferentes factores como lo menciona la ISO/IEC 17025 (2005), los requisitos
tcnicos de calibracin se dirigen a aquellos factores que en el caso de un
laboratorio, contribuyen a la exactitud, fiabilidad y validez de los ensayos que
realiza. con factores: Factor humano, Locales y condiciones ambientales,
mtodos de ensayo y calibracin y validacin de mtodos, equipos, trazabilidad
de las medidas, muestreos, manipulacin de las muestras de ensayos y
calibraciones.

5.4. Caracterizacin qumica y fitoqumica de las hojas de guanbana
5.4.1. Caracterizacin qumica de las hojas de guanbana
37

Los resultados obtenidos durante el anlisis qumico proximal se
muestran en el Cuadro 1. En donde se observan los siguientes datos: humedad
81.39, 70.13, 66.50%; protena 11.54, 11.87, 13.68%; grasa 16, 6.21, 7.72%;
fibra 20.95, 20.67, 21.42; ceniza 5.28, 6.02, 8.26, y carbohidratos 57.38, 55.24,
48.92%, respectivamente en cada estadio de las hojas de guanbana. JUSTO
(2007), reporta en las yemas terminales de la guanbana (Annona muricata L.)
obteniendo los siguientes resultados: humedad 76%, protena 16%, grasa 7%,
cenizas 6%, fibra 20.6%, carbohidratos 49.3 %.

5.4.2. Caracterizacin fitoqumica de las hojas de guanbana
Los resultados el ensayo de solubilidad presentados en el Cuadro 2
muestran que el etanol fue el solvente con el que se obtuvo mejores resultados.
En el Cuadro 3 se observan los resultados de la marcha fitoqumica de las
hojas de guanbana encontrndose mayor presencia compuestos fenlicos,
glicsidos y flavonoides.
VARGAS et al., (2005) mencionan que en varias especies los
flavonoides varian sustancialmente entre genotipos, cambios estacionales,
edades y daos de la hoja y sitios de ubicacin.

5.5. Capacidad funcional de las hojas de guanbana
5.5.1. Determinacin de polifenoles totales
Durante la evaluacin de polifenoles totales de las hojas de
guanbana como se muestran los resultados en el cuadro 4 se obtuvieron
7088.78 mg AG/100g en las hojas apicales, 5922.95 mg AG/100g en las hojas
38

medias o joven y 3906.20 mg AG/100g en las hojas basales o maduras,
MARN et al., (2011) reporto resultados donde se mostraron mayor contenido
de polifenoles 9.071,46 mg AG/100g muestra seca, en hojas jvenes en
comparacin con las hojas maduras con 4.663,57 mg AG/100g muestra seca,
Destacando la hoja joven como el mejor estado fenolgico de la hoja para la
cuantificacin de polifenoles totales en plantas de guayabo.
5.5.2. Anlisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibicin
del radical DPPH (IC
50
) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil
(DPPH)
Se observ que para el anlisis de la capacidad antioxidante
Coeficiente de inhibicin del radical DPPH (IC
50
) los resultados se
representados en el cuadro 5. Observamos un IC50 en las hojas: Apical
46.11 g/mL, medio 80.71 g/mL , basal 123.07 g/mL; BASKAR et al., (2007)
realizaron una investigacin en la India a diferentes concentraciones (100-500
g/mL) del extracto etanlico de hojas de guanbana pulverizadas
proporcionando como resultado 70 g/mL IC50, valor intermedio en el estudio
de especies de Annonceas.







39




VI. CONCLUSIONES

- Se conoci las diferentes reas con las que cuenta el CIDBAM; el
funcionamiento del espectrofotometro, centrifuga entre otros equipos.
- Se conoci el metodo para cuantificar polifenoles totales, los mtodos para
realizar el analisis quimico proximal, analisis fitoquimico y actividad
antioxidante.
- Se realiz la caracterizacin qumica, fitoqumica y capacidad antioxidante
de las hojas de guanbana, obtenindose las mejores caracteristicas en la
hoja apical; con contenidos de polifenoles totales 7088.78 mg AG/100g y
de 5922.95 mg AG/100g en las hojas medias o joven y 3906.20 mg
AG/100g en las hojas basales o maduras.
- La capacidad antioxidante obtenida en la hoja apical fue 46.111.71, en la
hoja media 80.711.91 y en la hoja basal 123.073.05 IC50, g/mL
respectivamente





40





VII. RECOMENDACIONES

- Realizar la calibracin de todos los equipos que se encuentran en las
diferentes reas.
- Tener reglamento para el manejo y desecho de sustancias peligrosas.
- Realizar un manual de gestin de calidad.
- Evaluar por HPLC compuestos especficos que se encuentran en la hoja de
guanbana.
- Contar con acceso a revistas reconocidas a nivel mundial para la obtencin
de investigaciones actualizadas.
- Capacitaciones al asistente de investigacin para el empleo de nuevos
equipos y mtodos, de esta forma ampliar el numero de investigaciones.









41




VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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46















IX. ANEXOS
47


A-I. Organigrama del Centro de Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico de la Amazonia










Figura 1. Organigrama del CIDBAM.
Centro de Investigacin para el Desarrollo de la
Amazonia (CIDBAM)

Coord. Facult.
de Agronoma
Coord. Facult
de Zootecnia
Coordinador Facult. de
Ingeniera en Industrias
Alimentarias
Coordinador Facult.
Recursos Naturales
Renovables
Vicerrectorado
Acadmico
Asistente de
Investigacin
48

A-II. Plano de distribucin de las reas de CIDBAM-CIPNA








Figura 2. Plano de distribucin CIDBAN-CIPNA

49

INDICE GENERAL
Pgina
I. INTRODUCCIN ......................................................................................... 1
II. REVISION DE LITERATURA ...................................................................... 3
2.1. Generalidades de guanbana ........................................................................... 3
2.2. Clasificacin taxonmica de guanbana .................................................... 3
2.3. Variedad de guanbana y caractersticas del cultivo ............................ 4
2.3.1. Variedades de guanbana ................................................................................. 4
2.4. Composicin qumica de la hoja de guanbana ...................................... 5
2.5. Antioxidantes y Radicales libres ................................................................... 5
2.5.1. Antioxidantes .......................................................................................................... 5
2.5.2. Radicales libres ...................................................................................................... 5
2.6. Laboratorio de investigacin ............................................................................ 6
2.7. Mtodos de Anlisis ............................................................................................. 7
III. PLAN DE TRABAJO ............................................................................. 10
3.1. Reconocimiento del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia- CIDBAM ............................................... 10
3.1.1. Descripcin y ubicacin del CIDBAM ........................................... 10
3.1.2. Organizacin ................................................................................ 10
3.2. reas del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazonia- CIDBAM ................................................. 10
3.2.1. rea de micropropagacion in vitro d vegetales ............................. 10
3.2.2. Area de HPLC .............................................................................. 10
3.2.3. Area de cultivo celular .................................................................. 10
3.2.4. Area de biologa molecular ........................................................... 10
3.2.5. Area de antioxidantes ................................................................... 10
3.3. Anlisis realizados .............................................................................................. 10
3.3.1. Materia prima................................................................................ 10
3.3.2. Preparacin de extractos .............................................................. 10
3.3.3. Mtodo de anlisis ........................................................................ 10
3.3.3.1. Anlisis qumico proximal .......................................................... 10
3.3.3.2. Anlisis fitoqumico .................................................................. 10
50

3.3.3.3. Anlisis de polifenoles totales ................................................... 10
3.3.3.4. Anlisis de la capacidad antioxidante ....................................... 10
3.4. Caracterizacin qumica y fitoqumica de las hojas de
guanbana...........................................................................................11
3.5. Capacidad funcional de las hojas de guanbana ........................... 11
3.5.1. Determinacin de polifenoles totales ............................................ 11
3.5.2. Anlisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibicin del
radical DPPH (IC
50
) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH) .............. 11
IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO .......................................... 12
4.1. Reconocimiento del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia (CIDBAM) .................................... 12
4.1.1. Descripcin y ubicacion del CIDBAM ....................................... 12
4.1.2. Organizacin ............................................................................... 12
4.2. Areas del Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazona........................................................ 13
4.2.1. rea de micropropagacin in vitro de vegetales ..................... 13
4.2.2. rea de HPLC.............................................................................. 14
4.2.3. rea de cultivo celular ............................................................... 16
4.2.4. rea biologa molecular ............................................................. 17
4.2.5. rea de antioxidantes ................................................................ 18
4.3. Anlisis realizados ............................................................................ 21
4.3.1. Materia prima .............................................................................. 21
4.3.2. Preparacin de extractos ........................................................... 22
4.3.3. Mtodo de anlisis ..................................................................... 24
4.4. Caracterizacin qumica y fitoqumica de las hojas de
guanbana ......................................................................................... 27
4.4.1 Caracterizacin qumica de las hojas de guanbana .............. 27
4.4.2 Caracterizacin fitoqumica de las hojas de guanbana ........ 29
4.5. Capacidad funcional de las hojas de guanbana ........................... 31
4.5.1. Determinacin de polifenoles totales ............................................ 31
4.5.2. Anlisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibicin del
radical DPPH (IC
50
) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil ........................... 32
V. DISCUSIN ............................................................................................... 33
51

5.1. Referencia del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia (CIDBAM) .................................... 33
5.1.1. Descripcin y ubicacion ............................................................ 33
5.1.2. Organizacin ............................................................................... 33
5.2. Reconocimiento del Centro De Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico De La Amazonia- CIDBAM ..................................... 34
5.3. Anlisis realizados ............................................................................ 36
5.4. Caracterizacin qumica y fitoqumica de las hojas de
guanbana ......................................................................................... 36
5.4.1. Caracterizacin qumica de las hojas de guanbana .............. 36
5.4.2. Caracterizacin fitoqumica de las hojas de guanbana ........ 37
5.5. Capacidad funcional de las hojas de guanbana ........................... 37
5.5.1. Determinacin de polifenoles totales ............................................ 37
5.5.2. Anlisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibicin del
radical DPPH (IC
50
) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH) .............. 38
VI. CONCLUSIONES .................................................................................. 39
VII. RECOMENDACIONES .......................................................................... 40
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ...................................................... 41
IX. ANEXO ....................................................................................................46