Bacterifago Lambda

Luis Kameyama, Norma Oviedo y Gabriel Guarneros.

Departamento de Gentica y Biologa Molecular, CINVESTAV-Instituto Politcnico Nacional Introduccin El estudio de las bacterias estara incompleto sin el estudio de sus elementos extracromosomales como son los plsmidos y sus virus (bacterifagos fagos). Estos elementos son autnomos ya que pueden replicarse por si solos, portan informacin gentica y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades. Los bacterifagos al igual que las bacterias, pueden encontrarse en casi todos los lugares, pero se presentarn generalmente donde estn sus huspedes obligatorios. Los fagos pueden clasificarse de acuerdo a su desarrollo en dos grupos: los fagos virulentos y los fagos temperados. El desarrollo de los fagos virulentos se inicia infectando a la bacteria, posteriormente sus genes son transcritos y traducidos para producir sus propias protenas, las cuales son necesarias para la replicacin de su genoma, para la formacin de su cpside y tallo, para el empaquetamiento del nuevo material gentico sintetizado y para la lisis bacteriana, y teniendo como objetivo final la produccin de las partculas o viriones maduros. Los fagos temperados pueden seguir al igual que los fagos virulentos la va ltica, pero a diferencia de stos, pueden convivir como profagos dentro de la bacteria. A la bacteria que posee un fago integrado se le denomina bacteria lisgena, y al fago integrado se le denomina profago. En la va lisognica, como en el caso del bacterifago (lambda) que infecta a su husped Escherichia coli, su ADN inyectado en forma lineal es primeramente circularizado para ser posteriormente integrado al cromosoma bacteriano. El ADN de integrado estar formando parte del cromosoma bacteriano. La replicacin del ADN se lleva en forma pasiva, o sea, solo se replicar si se replica la del cromosoma del husped. Las funciones para que se desarrolle la va ltica estarn reprimidas y por consiguiente permanecer en un estado de latencia. Este estado puede continuar a travs de un nmero indefinido de generaciones, hasta que algn disturbio ambiental induzca la seal para que el ADN se escinda. Las funciones lticas se vern reactivadas y se producirn nuevos viriones (Fig. 1). El bacterifago se caracteriza por estar constituida aproximadamente de la mitad de protena y la otra mitad de ADN. Su cromosoma la forma una molcula de ADN de doble cadena y consta de 48,502 pb, conteniendo aproximadamente 50 genes, que codifican para

5 protenas relacionadas con la regulacin, 7 con la recombinacin, 21 con la morfognesis de la cpside y tallo, 2 con la replicacin y 2 con la lisis bacteriana. El genoma del fago est organizado de tal forma que presenta grupo de genes en unidades funcionales. A la derecha del sitio attP (sitio de integracin del fago), se localizan los genes relacionados con la recombinacin, posteriormente los genes relacionados a la regulacin, le siguen los de replicacin, los de lisis y finalmente los genes relacionados para la formacin de la cpside y del tallo (Fig. 2). La cpside tiene una estructura icosadrica, con un dimetro aproximado de 0.05 , y unido a sta, una proyeccin tubular de 0.15 de longitud. Lambda fue descubierto por Esther Lederberg en 1951, y a partir de su descubrimiento el estudio con el fago sigue siendo un factor importante en la contribucin al conocimiento de la Gentica Molecular. En este captulo, nos enfocaremos en la descripcin del desarrollo del fago , iniciando con la infeccin fgica, y el control de la regulacin de la expresin de genes necesarios para su desarrollo ltico o lisognico, continuaremos con el establecimiento y mantenimiento de la represin. Posteriormente describiremos la recombinacin integrativa y las diferentes formas de replicacin, terminaremos con el ensamblaje de la cpside, empaquetamiento del ADN y la lisis celular. Infeccin La infeccin es realizada bsicamente en dos etapas, la adsorcin y la inyeccin del ADN. La adsorcin es reversible a bajas temperaturas, pero resulta irreversible una vez que el ADN ha sido inyectado. Lambda infecta eficientemente a la temperatura de 37C. El proceso de la infeccin requiere de energa metablica del husped. El producto del gen J del fago , el cual est formando parte del extremo distal del tallo de reconoce al receptor de maltosa LamB ubicado en la membrana externa del husped. La inyeccin eficiente del ADN requiere adems el producto del genpstM, protena relacionada en el transporte de fosfato y ubicada en la membrana interna. Se ha observado que la infeccin por ocurre sin cambios contrctiles en la estructura del tallo, a diferencia de lo que sucede con el fago T4. Una vez que el ADN ha penetrado a la clula, es circularizado por unin de sus extremos cohesivos en los sitios cos (regiones de cadena sencilla de ADN de 12 nucletidos y cuyas secuencias se complementan). Posteriormente los extremos del ADN son unidos en forma covalente por la ligasa del husped. Desarrollo ltico del fago lambda Despus de la infeccin, puede desarrollarse en forma ltica o lisognica, seleccionando funciones para cualquiera de estas dos vas. Si opta por el desarrollo ltico requerir de la expresin concertada de varias funciones, producto de genes virales y del husped, y las funciones propias de la lisogenia sern reprimidas, as el fago seguir un estricto plan de desarrollo. El programa ltico empieza con la iniciacin simultnea de la transcripcin de dos promotores: el izquierdo pL y el derecho pR. El transcrito temprano de pL termina en el terminador de la transcripcin tL1 y produce un transcrito de ~1,000 nts, equivalente a un

ARNm 12S. El transcrito del promotor pR termina en tR1 y produce un ARNm equivalente de 9S. El transcrito temprano de pL contiene al gen N y cuyo producto N suprime los terminadores de la transcripcin. El transcrito temprano de pR contiene al gen cro, y su producto es un represor transcripcional que regula negativamente la sntesis del represor CI, as como de los transcritos de pL y pR (Fig. 2). Transcripcin temprana-tarda La protena N modifica a la ARN polimerasa que transcribe a partir del promotor pL. Esta desconoce a los terminadores de la transcripcin tL1, tL2, y a otros ms localizados en el opern izquierdo, produciendo transcritos >7,000 nts que incluyen la regin b, ms all del sitio attP (Fig. 3). El mensajero a partir del promotor pR termina ~50% en tR1. La protena N, modifica a la ARN polimerasa y transcribe eficientemente los genes cII, O, P y Q (Fig. 3). Entre los genes P y Q se encuentra un segundo terminador tR2. Este terminador es mucho ms eficiente que tR1 y solamente es suprimido por la presencia de N. As, la ausencia de N, no permite que Q sea expresada. Sin embargo, fagos con deleciones en tR2 ( nin), pueden parcialmente, propagarse en forma ltica an en ausencia de la protena N. Se ha observado que varios minutos despus de la infeccin, la sntesis de los genes tempranos (N y cro), as como de los genes tempranos tardos (del lado derecho cII, O, P; del lado izquierdocII, gam, beta, etc.), empieza a disminuir por la inhibicin de la transcripcin de pL y pR. Esto es debido a que la protena Cro se une a los operadores oL y oR, que se traslapan con sus respectivos promotores pL y pR. La inhibicin debida a Cro resulta esencial para el programa ltico, ya que una excesiva actividad de pL, as como de pR puede ser letal para el desarrollo de . Se ha observado que la sobreproduccin de varios productos de produce efectos adversos en el metabolismo de husped, as como del fago. Transcripcin tarda La siguiente etapa, en la expresin de los genes tardos de se requiere del producto del gen Q, el cual acta como un antiterminador para la transcripcin de pR. Este promotor esta localizado entre el gen Q y el gen R. La transcripcin de pR es constitutiva. El ARNm 6S producido corresponde a la regin del inicio de la transcripcin sR al terminador tR. Este transcrito es detectado an en una lisgena reprimida. As, el transcrito de pR por la accin de Q se extiende a travs de los genes tardos que en su mayora codifican para las protenas estructurales, y termina en algn lugar de la regin b (Fig. 3). Regulacin del programa Ltico Mecanismo de accin de N El producto del gen N es una protena de ~12,200 daltones, que activa la expresin de los genes de , antagonizando con la funcin de los terminadores de la transcripcin. Se ha observado que solamente los transcritos originados de los promotores pL y pR son susceptibles de ser antiterminados por la accin de la protena N. Salstrom y Szbalski en 1978 reportaron una regin en el opern pL necesario para que se llevara la

antiterminacin, y la denominaron nut (esta regin esta compuesta a su vez por dos sitios: boxA y boxB), localizado entre el promotor pL y el terminador tL1. Mutaciones en este sitio, an en presencia de N, provocan que la transcripcin termine en tL1. Posteriores estudios ubicaron a esta regin en los primeros 70 pb con relacin al inicio de la transcripcin de sL. El anlisis por secuencia revel que las mutaciones que no eran capaces de antiterminar caan en una regin de simetra de repetidos invertidos y que forman una estructura de horquilla (boxB), por el apareamiento de sus bases. En forma similar, para el opern de pR se identific una secuencia muy parecida a boxB de nutL, de unos 16-17 pb entre el carboxilo terminal del gen cro y el terminador tR1. Este sitio fue denominado boxB, que junto con boxA de nutR, constituyeron la regin necesaria para la realizacin de la antiterminacin. Por otro lado, se ha demostrado que se requieren factores del husped para que la actividad de la protena N sea efectiva. A estos factores se les denomin Nus. Se seleccionaron mutantes de E. coli incapaces de crecer pero que invariablemente permitieron el crecimiento de fagos nin (independientes de N). Las mutantes llamadas nus nus- fueron localizados en cinco genes: nusA,nusB, nusC, nusD (rho) y nusE, e ubicados en el genoma de E. coli en los minutos: 69, 11, 88, 84 y 72, respectivamente. Posteriormente se encontr a otro gen nusG, cuyo producto est involucrado en la antiterminacin. El modelo que explica la intervencin de N para que realice su funcin antiterminadora es ciertamente complejo. Se forma un complejo comprendiendo a la ARN polimerasa, los factores del husped (NusA, NusB, NusE y NusG), as como N del fago y el sitio nut del ARNm. La parte amino terminal de la protena N hasta el residuo 19 reconoce a la caja B de nut, la regin comprendida entre los aminocidos 34 a 47 interacciona con el factor NusA, y la parte carboxilo terminal de los residuos 73 a la 107 reconoce a la ARN polimerasa. El factor NusA al igual que la protena N, reconocen las dos cajas A y B de nut e interacciona a su vez con la ARN polimerasa. Menos estudiadas son las interacciones de los factores NusB y NusE (equivalente a la protena ribosomal S10), pero ambas son capaces de reconocer a la caja A. Adicionalmente ambos factores interaccionan directamente con la ARN polimerasa. La protena NusG, interacciona con la ARN polimerasa y con NusD (equivalente al factor r de la terminacin). As este complejo transcribe y desconoce los terminadores de la transcripcin (Fig. 4). Adicionalmente, el complejo permanece unido al sitio nut del ARNm formando un ARN en forma de asa que crece a medida que avanza la ARN polimerasa. La protena Q y su funcin La expresin de los genes tardos requiere de la funcin antiterminadora de la transcripcin de la protena Q. El producto de los genes R y S son los primeros en transcribirse a partir del promotor pR' y estn relacionados con la lisis bacteriana. El producto de 10 genes que se transcriben posterior a R y S se relacionan con el ensamblaje de la cpside, y el producto de 12 genes posterior a los genes que codifican para la estructura de la cpside se relacionan con el ensamblaje del tallo. El producto del gen Q es una protena de ~22,500 daltones. El mecanismo por la cual antitermina es diferente al de N. La protena Q acta sobre el ADN en un sitio

denominado qut el cual est localizado entre la posicin -10 y -35 del promotor pR. La unin de Q a qut ocurre mientras est presente el factor de iniciacin 70 en la ARN polimerasa, ya que es necesario un cambio conformacional del templado de cerrado a abierto en el complejo de iniciacin. Para que Q acte se necesita que la ARN polimerasa haya iniciado la transcripcin, y haga una pausa alrededor de los nucletidos +16 y +17. Sin embargo, una doble mutacin en -15 y -13 de la secuencia del promotor reduce la antiterminacin por Q alrededor de unas 10 veces sin cambiar la pausa en +16/+17. La regin posterior al inicio de la transcripcin es tambin necesaria ya que mutaciones en +2 y +6, impiden la accin por Q, y eliminan o reducen sustancialmente la pausa inicial. Al parecer, el nico factor del husped necesario para la antiterminacin por Q es NusA, ya que estimula la actividad de la ARN polimerasa en una forma considerable sobre los terminadores de la transcripcin. Este transcrito tardo es sintetizado en forma continua y se extiende alrededor de unos 26 kb. El hecho de que utilice otro regulador positivo Q, en adicin a N, para llevar a cabo su desarrollo ltico, pudiera explicarse en la fuerza de estos activadores. Estudios de la medicin de la vida media del ARNm indican que la regin tarda es uniformemente transcrita. En contraste con la de pL, bajo la influencia de N, disminuye rpidamente con la distancia. Establecimiento y Mantenimiento de la Represin Si despus de la infeccin, el fago opta por la va lisognica, deber integrarse al cromosoma bacteriano y habr de mantener reprimidos los promotores pL y pR. En el estado lisognico el sistema de represin est funcionalmente activo manteniendo constantes los niveles del represor CI mientras no exista algn disturbio que active el desarrollo ltico. El represor CI es sintetizado a partir de los mensajeros de dos promotores diferentes: pRE y pRM. Ambos promotores tienen como funcin principal la de transcribir al gen cI, pero actan a diferentes tiempos en la va lisognica. Para que el estado lisognico inicie despus de la infeccin, se requiere de la transcripcin del promotor pRE. Este promotor est localizado ~400 pb a la derecha del gen cI, y se solapa con la regin 5'terminal del gen cII. La transcripcin de pRE es en contrasentido al del promotor pR y requiere del activador CII. Una vez iniciada la transcripcin del promotor pRE, estos transcritos en contrasentido a los de pR pueden complementarse y unirse con los de pR formando una doble hlice de ARN. Esta estructura deber inhibir la expresin de Cro, as como la de CII. La inhibicin de Cro es fcilmente entendible, ya que esta protena acta en forma antagnica al represor CI. Para el proceso lisognico se requiere que los niveles de Cro estn en su mnima expresin. Sin embargo, resulta ms difcil entender la disminucin de la expresin de CII, ya que sta es requerida para la produccin de CI. Es probable que en el momento en que CII activa al promotor pRE, los niveles de CII en la clula estn lo suficientemente altos, y no requiera de una sntesis adicional de CII para establecer la lisogenia. Adicionalmente, cabe mencionar que el transcrito proveniente de pRE que transcribe al gen cI tiene un Shine Dalgarno lo bastante fuerte para que CI sea traducido en forma eficiente. El regulador positivo CII tambin acta

sobre el promotor pI que transcribe al gen int, y cuyo producto es necesario para que el cromosoma de se integre al cromosoma bacteriano. Los niveles de la protena CII en la clula deben estar lo suficientemente altos para activar a pRE y a pI. Debido a que CII es metablicamente inestable y es degradada fcilmente por la accin de la proteasa HflA del husped, se requiere un factor adicional del fago, la protena CIII, que contrarresta la accin de esta proteasa. As, CIII junto con CII son requeridos para que se lleve una eficientemente lisogenizacin. Sin embargo, CIII no ser necesario si el husped contiene un gen hflA inactivo (Fig. 5). Mantenimiento de la Represin El mantenimiento del estado lisognico es debido a la accin del represor CI, producido de la transcripcin del promotor pRM. Este promotor requiere de la accin del mismo represor CI para activarse. El promotor pRM se solapa con uno de los sitios de la regin del operador OR, el sitio OR3. Para el mantenimiento de la represin se requiere primeramente que el represor CI acte impidiendo la transcripcin de los promotores pL y pR, por medio de una unin en forma homodmera de CI, sobre el lado derecho en los sitios OR1 y OR2 (los cuales se solapan con el promotor pR), y del lado izquierdo a los sitios OL1 y OL2 (que se solapan con el promotor pL). El dmero de CI se une preferentemente a la regin OR1 del lado derecho, y a OL1 del lado izquierdo. Estas uniones permiten que de manera cooperativa el siguiente homodmero de CI se una a OR2 y OL2, respectivamente. Concentraciones "normales" del represor en la clula, permiten que los sitios OR1 y OR2 estn ocupados generalmente, y esta interaccin no se extienda al sitio OR3. Mutaciones en el sitio OR1, hacen que el dmero se una a los sitios OR2 y OR3, indicando que la unin es cooperativa entre los dmeros de los represores. La unin del represor al sitio OR2 permite que la ARN polimerasa unida al promotor pRM, se active y transcriba al gen cI, producindose ms represor. Si las concentraciones de CI siguen en aumento, el promotor pRM se apagar debido a que el represor se une al sitio OR3. Este sitio y parte del sitio OR2 se solapan con el promotor pRM. Despus de un cierto tiempo, el represor decae, su concentracin baja y el sitio OR3 es el primero en quedar libre por tener menor afinidad. Los otros sitios OR2 y OR1 quedaran libres, sino fuera porque el represor CI unido a OR2 es capaz de activar nuevamente a la ARN polimerasa de pRM. De esta manera se autorregula la expresin de CI, manteniendo constantes los niveles de CI en el citoplasma (Fig. 6). El represor CI es mantenido en ~200 copias por clula y no slo impide la transcripcin de genes del profago, sino tambin la transcripcin de otros genes de fagos infectantes homlogos, por la unin del represor CI a las regiones operadoras OL y OR del fago(s) infectante. Este mecanismo en la que una bacteria lisgena es capaz de inhibir la infeccin por un fago homlogo (fago con la misma especificidad del represor) es denominado inmunidad. As, el represor CI es especfico para fagos que tienen la misma regin de inmunidad. Integracin y Escisin del profago El ADN del fago entra a la clula en forma lineal pero enseguida se circulariza por complementacin de los extremos cohesivos y ligacin de los "nicks" correspondientes. En la respuesta lisognica las funciones lticas, inclusive la replicacin, estn reprimidas por lo que, cuando la bacteria se divide, el ADN circular del fago podra ser segregado

desigualmente entre la progenie. Este evento se evita por la integracin del ADN de al genoma de la bacteria, en forma que al replicarse el profago se transmite igualmente a las clulas hijas. La integracin se efecta por un evento de recombinacin sitio-especfica mediado por la integrasa (Int) codificada por y por protenas del husped llamadas factores de integracin (IHF). Cuando se levanta la represin de una lisgena se requiere que el profago se escinda del cromosoma bacteriano. La escisin requiere tambin de Int y de los IHF, pero adems necesita Xis, el producto del gen xis adyacente a la derecha de int. Expresin de Int durante la lisis La transcripcin del mensaje policistrnico a partir de pL es afectada por la accin de la protena antiterminadora N (ver arriba). El ARN contiene, entre otros, los mensajes de xis e int, pero adems contiene la regin sib (por sitio inhibidor de la regin b) responsable del control postranscripcional de int llamado retroregulacin. La regin sib se localiza a la izquierda del gen int distal al sitio attP, donde se efecta la recombinacin integrativa, y reduce la sntesis de protena Int. El ARNm que contiene la regin retroreguladora sib forma una estructura de tallo y asa que es procesada por la RNasa III. El extremo 3 generado es susceptible a la degradacin por PNPasa y RNasa II. Estas enzimas son exonucleasas que degradan el ARN progresivamente en direccin 3 a 5, lo cual implica que el mensajero de int sea eliminado. No suceden as con el gen xis en el extremo 5 del mismo transcrito porque dentro del mensaje de int se forma una estructura secundaria que resiste la accin de las exonucleasas. Este evento explica que no se sintetice suficiente protena Int a partir del ARNm originado en pL para poder integrar el ADN del fago (Fig. 7). La protena Int no es necesaria si la bacteria infectada est comprometida a una respuesta ltica. Expresin de int durante el establecimiento de la lisogenia Cuando despus de la infeccin por la concentracin de CII alcanza niveles relativamente altos en la clula, se favorece la ruta lisognica. La protena CII estimula la transcripcin en los promotores pRE y pI que est asociada con el establecimiento de la lisogenia. La transcripcin a partir de pRE permite la sntesis del represor de la lisogenia CI y a partir de pI se expresa Int, la protena que media la integracin. Ya que el inicio de la transcripcin de pI ocurre dentro del gen xis, que precede a int, el ARNm generado se traduce en Int pero no Xis. La transcripcin a partir de pI se detiene en el terminador tI una estructura de tallo y asa que est contenida pero no es idntica a la estructura sib mencionada antes. El de pI es un mensajero que slo contiene int que es estable debido a la estructura del terminador tI y que se traduce eficientemente en la Integrasa. Recombinacin sitio especifica de Los sitios donde se lleva a cabo la recombinacin integrativa son attP en el ADN del fago y attB entre los operones gal y bio del cromosoma bacteriano. Estos sitios mantienen homologa limitada a unos 30 pb. Ya que las recombinaciones generales de la bacteria o la del fago, requieren de homologa en las secuencias de cientos de pares de bases de ADN, es

claro que la integracin requiere de otro sistema. Este sistema se le ha llamado "recombinacin sitio especfica" y se caracteriza por su alto grado de especificidad y direccionalidad. El sitio de recombinacin attP del fago, adems de un ncleo de 15 pb, involucra otras secuencias adyacentes (150 pb a la izquierda y 78 pb a la derecha); asimismo attB consta de un ncleo de 15 pb de secuencia idntica a la de attP y secuencias adyacentes que son parcialmente homlogas a la secuencia de . La recombinacin entre ambos sitios att se lleva a cabo gracias a la participacin de la integrasa del fago y las protenas IHF del husped. La recombinacin se efecta por un mecanismo de corte y reunin en el ncleo comn. El smbolo de la regin comn es O y est flanqueado por los brazos o regiones adyacentes simbolizadas P y P que representan los brazos izquierdo y derecho de attP. B y B simbolizan las regiones correspondientes de attB. Las reacciones de insercin y escisin se acostumbran abreviar por la siguiente ecuacin: Int IHF termosensible POP (attP) + BOB (attB) < > BOP (attL) + POB(attR) Int, Xis, IHF termoestable Las secuencias attL y attR son productos de la recombinacin integrativa y sustratos para la escisin. La protena integrasa participa en ambos procesos, y es esencial para la integracin ya que requiere de una mayor concentracin de int, mientras que la escisin ocurre cuando hay una mayor concentracin de Xis que de Int. Formacin del intasoma La integrasa es un polipptido de ~40,000 daltones, con funciones de recombinasa, unin especifica al ADN de attP y de topoisomerasa. Esta enzima es capaz de cortar y ligar las cadenas de ADN para relajar su estructura y promover el intercambio de cadenas con el ADN de la bacteria. La protena Int se une al ADN formando multmeros consistentes de 4 a 8 monmeros al ncleo deattP (donde el entrecruzamiento de cadenas ocurre) reconociendo un par de secuencias de invertidas repetidas que se encuentran uniendo al ncleo y a los brazos flanqueadores del attP. Int tambin se une a una sequencia que se repite 5 veces en los brazos de attP. La protena IHF de E. coli tiene tres sitios de unin en los brazos de attP. Bajo la influencia del superenrollamiento del ADN, attP, Int y IHF, se forma una estructura superenrollada denominada intasoma que es la especie activa de la recombinacin integrativa. En contraste el sitio attB, es sencillo y no contiene secuencias de unin para IHF como los brazos de attP, tampoco es necesario el superenrollamiento en esta regin del ADN para la recombinacin. La regin attB tiene la misma secuencia de 15 pb que se halla en el ncleo del attP y algunos pares de bases que le flanquean completan el par de sitios de unin para Int (Fig. 8). A estos sitios de unin en attB se unirn las protenas Int que forman parte del intasoma y no as la protena Int presente en el citoplasma.

El modelo de recombinacin integrativa postula la formacin de una estructura sinptica entre las cuatro cadenas de ADN en sus regiones homlogas. El acercamiento de las cuatro cadenas auxiliadas por el intasoma permite que ocurra el corte en uno de los extremos del ncleo de las regiones att, las dos cadenas con la misma polaridad son cortadas, ocurre la rotacin de estas cadenas alrededor de las que no han sido cortadas que permite alinearlas con las nuevas cadenas compaeras para ser finalmente ligadas a estas. Este primer intercambio de cadenas tiene la topologa de una estructura de Holliday. Para resolver el entrecruzamiento de las cadenas remanentes, estas son cortadas en el otro extremo del ncleo, rotan y son religadas a las nuevas cadenas correspondientes. Para esta reaccin la presencia de IHF no es necesaria y la protena Int la puede llevar a cabo. En cambio para el primer entrecruzamiento de cadenas si es necesaria la presencia de IHF. La escisin del profago La escisin del ADN del fago requiere de las protenas Int y Xis. Los genes int y xis se localizan juntos inmediatamente a la derecha del sitio attP. Las secuencias de estos genes tienen una superposicin de 20 pb. entre el extremo 5de int y el 3de xis. Cuando se induce la fase ltica se requiere la escisin del ADN del fago. La inactivacin del represor CI producida por la proteasa RecA permite la transcripcin a partir de pL para producir un ARNm que contiene al gen xis e int, pero no la regin sib que fue separada fsicamente durante la recombinacin del sitio attP con attB. Este transcrito no ser degradado y permite la traduccin de ambos genes eficientemente, y cuyos productos son necesarios para la escisin (Fig. 8). La escisin es de tipo sitio especifica y requiere de Int, Xis e IHF. Para esto las cadenas con los sitios attL y attR son intercambiadas para restaurar los sitios attP y attB. La escisin requiere de Xis la cual tiene 2 sitios de unin en el attR. Se piensa que Xis estabiliza la unin de Int para promover un nuevo evento de recombinacin entre attR y attL. La reaccin de escisin es resistente a la temperatura a diferencia de la integracin que es inhibida por la temperatura y altas concentraciones de Xis. Replicacin del fago La replicacin del ADN del fago puede llevarse a cabo en forma pasiva o en forma activa. La replicacin en forma pasiva es realizada por la replicacin del cromosoma bacteriano, ya que el ADN de esta integrado, y al replicarse el cromosoma bacteriano, se replica tambin el de . La replicacin activa es independiente de la replicacin del cromosoma del husped. Esta es llevada a cabo en dos fases: la temprana y la tarda. En la fase temprana, la replicacin es iniciada a partir de un nico origen. Es realizada en forma bi-direccional generando molculas de ADN circulares. La replicacin sigue la forma por la semejanza de las estructuras intermedias con la letra griega Tetha. En la fase tarda de la infeccin, la replicacin sigue la forma del circulo rodante (s), generando mltiples molculas lineales de ADN de l (Fig. 10).

Para que se lleve a cabo la replicacin, se requiere de la maquinaria replicativa, la cual consta de un gran nmero de protenas, y de las cuales la mayora provienen del husped. Solamente dos protenas fgicas, codificadas por el producto de los genes O y P, participan directamente en la iniciacin de la replicacin. As, la replicacin posterior a su inicio sigue el mecanismo establecido del husped E. coli. La mayora de las protenas implicadas en la replicacin, fueron identificada retando al fago a replicarse bajo las condiciones no permisivas de temperatura en cepas mutantes termo-sensibles para la replicacin de E. coli. Replicacin Temprana Posterior a la inyeccin de la molcula lineal del ADN de , esta es convertida a una molcula circular covalentemente cerrada por apareamiento de sus extremos cohesivos de 12 nts (sitios cos) y su posterior ligacin (Fig. 10). Esta molcula circular por la accin de la ADN girasa se superenrolla negativamente formando el sustrato replicativo. Se ha observado bajo el microscopio electrnico que la mayora de las molculas tienen la forma de en el estadio replicativo temprano. Estas estructuras presentan dos cadenas de la misma longitud, correspondiente a la regin replicada, y unido a sus extremos, un tercer segmento el cual no ha sido replicado. Adicionalmente, se observa que existe un pequeo porcentaje de crculos con una pequea hebra unida a sta, indicando que la replicacin tambin sigue el modelo del crculo rodante. La replicacin empieza en un origen nico y procede bidireccionalmente. Las asas replicativas, donde se lleva a cabo la sntesis del ADN, se mueven en forma divergente a su origen y progresan a travs del crculo con velocidades muy similares. La reiniciacin en el origen, est regulada y normalmente no ocurre, hasta que el ciclo replicativo se haya completado. Sin embargo, se ha observado que bajo ciertas condiciones, como la adicin de cafena 2mM al medio, es posible la reiniciacin, observndose que ~20% de las molculas han reiniciado, an cuando el ciclo replicativo anterior no haya finalizado. Se propone que la droga acta bajando la estabilidad helicoidal del ADN, o sea cambiando la estructura del templado y facilitando por consiguiente la reiniciacin de la replicacin. Ambas cadenas del ADN parental son copiadas, de acuerdo al modelo replicativo . Sin embargo, una observacin ms cuidadosa de las microfotografas electrnicas de alta resolucin revelan que en varias de las estructuras q, en la posicin de las asas replicativas, o sea, en los inicios de la sntesis del ADN, se presentan pequeas regiones de ADN de cadena sencilla. Estas regiones pueden ser observadas en ambas asas y estando siempre en el inicio y en brazos opuestos. Esta asimetra inherente en la progresin de las asas replicativas y sabiendo que la ADN-polimerasa lleva a cabo siempre su sntesis en direccin 5 a 3, y que la constitucin de la doble hlice es antiparalela, puede explicarse que una de las cadenas es replicada en forma continua y la otra en forma discontinua. La longitud de estas cadenas cortas de ADN de simple cadena coincide con el tamao de los fragmentos de Okasaki. De acuerdo a este modelo, la replicacin contina hasta terminar en el polo opuesto al origen de replicacin. Es muy probable que despus de este ciclo replicativo, las dos nuevas cadenas circulares que forman dos cromosomas del fago se

presenten en forma concatenada. La separacin de estas no sera posible sin la intervencin de una ADN-topoisomerasa. La replicacin temprana procede en forma exponencial, y el nmero de molculas se duplica cada 2 - 3 min. Sin embargo, no todas las molculas estn en estado replicativo en cualquier momento, slo ~20% de las molculas se replican. Adicionalmente, puede observarse que alrededor de 50 molculas por clula estn en forma monomrica helicoidal antes de que transcurran los primeros 15 min de la infeccin. Replicacin tarda Durante el crecimiento ltico a 37C en medio rico, la replicacin temprana cesa ~15 min de la infeccin, y da lugar a la sntesis de concatmeros (cromosomas lineales de ADN de ligados covalentemente de la cpside y la tallo). Estos pueden ser empaquetados inmediatamente. La primera evidencia de la sntesis del ADN concatemrico viene de las observaciones por la sedimentacin del ADN radioquimicamente marcado. Molculas de dos y hasta ocho veces la longitud del ADN monomrico de han sido claramente observada despus de los 15 minutos en fagos mutantes deficientes en el ensamblaje de la cpside. La posibilidad de que estos concatmeros pudieran venir del producto de la recombinacin, fue eliminada haciendo los experimentos en ausencia de los sistemas de recombinacin, es decir en cepas bacterianas recA--, as como de los fagosred-- e int--. El modelo del crculo rodante provee un posible mecanismo para la sntesis de ADN concatemrico. Una de las cadenas del ADN parental sirve como templado, mientras que la complementaria tiene un corte. La sntesis se inicia en el extremo 3-hidroxilo terminal y continuando a travs del crculo varias veces, produciendo ADN de cadena sencilla. Esta cadena lineal es utilizada como templado para la sntesis de su cadena complementaria. A tiempos tardos en la infeccin, la mayora de los cromosomas del fago est en la forma . La replicacin al igual que en la forma , puede llevarse a cabo en forma bidireccional, o sea, puede replicarse tomando una u otra de las cadenas parentales como templado. Se ha observado que ~40% de la forma replicativa tiene un mismo origen, y coincide con el origen de replicacin de . Algunas de las formas replicativas pueden derivar en forma directa por la inactivacin de alguna de las asas replicativas de . Control de la Replicacin tarda Al parecer, no existe un mecanismo de transicin entre las fases temprana y la tarda en la replicacin de . Las investigaciones sobre un hipottico gen esencial que media el cambio entre la forma y la forma han sido del todo infructuosas. As, la idea de un cambio puede ser errnea. Un punto de vista alterno, es que tanto la forma como se inicien temprano en la infeccin, pero la replicacin de se pare tempranamente, mientras que la de persista hasta tiempos tardos. Se ha observado que una tercera parte de las molculas en los primeros ciclos de replicacin son de la forma . Un importante factor que podra regular la transicin de la fase temprana a la tarda, es la disponibilidad de las protenas O y P. La expresin de O y P es limitada a tiempos tardos por la presencia de la protena Cro, ya que evita la transcripcin a partir del promotor pR. Se ha observado que cuando la

sntesis del ADN es retardada por la limitacin de la cantidad de las protenas O y P activas despus de la infeccin, las primeras formas replicativas observadas son generalmente de la forma . El producto del gen gam de , claramente juega un papel importante en la sntesis de concatmeros de ADN, y el producto del gen red pudiera tambin ser de importancia. La doble mutante gam--red-- de , es incapaz de formar placas en un tapiz bacteriano recA-(deficiente en recombinacin). Bajo estas condiciones, la sntesis de ADN ocurre, pero se acumulan muy pocos concatmeros de ADN. Algunas formas del tipo pueden ser detectadas, pero sus cadenas laterales son muy cortas. Sin embargo, el defecto de la replicacin del circulo rodante de la mutante gam--red-- de puede ser restituida por la doble mutante del husped recA-- y redB-- o redC-- o recD--, sintetizando concatmeros eficientemente. As, la funcin crtica de la protena Gam es la de inhibir la actividad de la exonucleasa V codificada por los genes recB, recC y recD que destruye los concatmeros. La funcin de Red y las funciones de recombinacin del husped son menos claras, posiblemente generan recombinantes entre monmeros circulares. Los multmeros resultantes llevaran al menos dos sitios cos, sustratos para una eficiente encapsidacin. En efecto, si la replicacin normal es bloqueada, la recombinacin llega a ser necesaria para la maduracin de los cromosomas de . Iniciacin de la Replicacin de Resulta claro que tanto para la forma , as como para el 40% de la forma , la replicacin, se inicia en un origen nico ori. El origen de replicacin en sus inicios fue determinado por mapeo con las microfotografias electrnicas, tomando desde el origen de las asas replicativas y extrapolando a la regin cero de replicacin. Esto ubic al ori entre 81.7 2.9% en relacin al extremo izquierdo del genoma de , y muy cerca de los genes O y P. Posteriormente, estudios genticos determinaron con ms precisin el sitio de control para la iniciacin de la replicacin. Este sitio estuvo localizado dentro del gen O, aproximadamente a 80.5 - 80.6% del extremo izquierdo del genoma . El origen de replicacin fue determinado probando diferentes mutantes con deleciones cercanas a y dentro del gen O, observndose si la replicacin se llevaba a cabo o no en profagos. Una vez delimitada esta regin, se clon en regiones no esenciales de fagos o en plsmidos, y por complementacin de O y P, se observaron si eran capaces de replicar o no. Una regin entre el promotor pR y un sitio EcoRI dentro del gen O permite que se replique eficientemente tanto en el sistema de profagos y de plsmidos. Sin embargo, una regin de 34 pb a la derecha del sitio EcoRI increment la replicacin de 20 a 30 veces en el sistema plasmdico. As, pruebas con deleciones indicaron que los lmites de ori estn comprendidos a no mas de 200 pb del sitio EcoRI. Se han propuestos otros sitios mas distantes como el sitio ice (inceptor sequence) dentro del gen cII y localizado a 600 pb a la izquierda de ori que facilitan la replicacin. Sin embargo, deleciones en este sitio han permitido una buena replicacin, por lo que a ori se le considera el nico sitio indispensable para que se lleve a cabo una replicacin normal. Debido a la capacidad de suplir la actividad de O por complementacin, se pudieron hacer ensayos ms finos mutando el origen de replicacin (dentro del gen O) y se defini un segmento mnimo de 63 pb como el origen de la replicacin. Sorprendentemente, esta regin presenta cuatro cajas muy

parecidas de 19 pb conteniendo repetidos invertidos y separados unos de otro por pocas bases. El ADN de esta regin puede modelarse como una estructura de un trbol complejo, sugiriendo que pudiese ser el estado activo del ADN para el inicio de la replicacin. El origen ori tiene otra estructura no usual a la derecha de los repetidos, la cual es rica en pares de AT y exponiendo una distribucin asimtrica de purinas y pirimidinas. Estas propiedades deben facilitar la desnaturalizacin local de la doble hlice. La interaccin especfica entre la protena O y el segmento ori ha sido identificado por anlisis genticos y bioqumicos. La protena O, de 34,000 daltones, acta en forma dimrica. La regin amino terminal de O es esencial para el reconocimiento del ADN y se une a una regin de 95 pb en la cual estn contenidas las cuatro cajas. La protena P es una protena de 26,000 daltones que de acuerdo a las evidencias genticas sugieren que tambin puede interactuar con la protena O. Mutaciones del tipo temperatura sensible pueden ser suprimidas por mutaciones que mapean en P. La protena hbrida O que contiene la parte amino terminal de y la parte carboxilo terminal O de 80, funciona eficientemente para la replicacin con la protena P del fago 80 pero no con la protena P de , indicando que la interaccin a P es con la parte carboxilo terminal de O. La protena P interacta con diferentes protenas del husped, entre estas la mejor caracterizada es con la helicasa del husped DnaB. La asociacin con la protena DnaB y su modificacin en su actividad podran permitir que DnaB entre al complejo replicativo del ADN de . Para que se inicie la replicacin se requiere de la salida de P del complejo de iniciacin, para sto DnaJ/DnaK se asocian a P dejando libre a DnaB. El producto de los genes grpD y grpE estn involucrados tambin en la salida y regeneracin de P. Adems de las protenas replicativas y al sitio ori, la iniciacin de la replicacin requiere una activacin transcripcional de la sntesis de un ARN cercano al origen de la replicacin. En una lisgena para cuando se coinfecta con el mismo fago y un fago auxiliar heteroinmune que provee las protenas O y P de , el genoma reprimido de lambda no es capaz de replicarse indicando la necesidad de la activacin transcripcional. Existen algunos antibiticos como la rifampicina que inhiben la replicacin. Su accin es indirecta, ya que al inhibir la transcripcin de pR, evita la activacin transcripcional para la replicacin. Similarmente, existen otros antibiticos que inhiben indirectamente la replicacin como son el Ac. Nalidxico y la Coumermicina, inhibidores de la ADN-girasa. Esto sugiere que el sustrato para la iniciacin de la replicacin debe ser un sistema de ADN superenrollado. El mecanismo propiamente de la replicacin como el reconocimiento para su iniciacin, el complejo ARN polimerasa para la elongacin y para la terminacin es muy similar a la que ocurre con su husped E. coli y se recomienda ver el captulo de la Replicacin en E. coli. Ensamblaje de las partculas virales de lambda presenta la cpside en forma de icosaedro, que contiene el ADN de doble cadena. Estas son partculas vricas pequeas de 55 nm de dimetro que guardan en su interior al genoma completo de de 16,500 nm de largo. La construccin de la cpside y el posterior

empaquetamiento del ADN comprende la participacin de protenas del fago y de la bacteria. El ADN concatemrico, producto de la replicacin de la forma , y los precursores de las cpsides interactan mediante el reconocimiento de las regiones cos por parte de la enzima terminasa que se encarga del empaquetamiento y corte posterior en la regin cos. La entrada de solamente una unidad cromosomal por cpside es controlada por el reconocimiento del sitio cos terminal por la terminasa. Sin embargo, es posible introducir ADN heterlogo con gran eficiencia en vectores que cuenten con las regiones cos al ser empaquetados en reacciones in vitro. La cpside del virin se forma independientemente del ensamble del tallo, y al unirse ambos conforman la partcula viral madura. Se requiere de la participacin de cuatro protenas del fago y por lo menos de dos protenas de la bacteria para formar la cpside. La protena E forma la estructura del poliedro principal y la protena D se encuentra en la superficie formando un arreglo eicosadrico en la cpside madura. Las protenas B, C y Nu3 del fago junto con las protenas GroEL y GroES del husped interactan para formar la cpside primitiva. Las protenas del husped son necesarias para evitar malformaciones de la cpside al ensamblarse las protenas E y Nu3. La protena Nu3 facilita el ensamble de las protenas E, B y C en la estructura del precursor. La protena B forma el conector entre la cpside y el tallo del virin, el cual est dispuesto en forma de un anillo con un orificio central. Este ser el orificio de la entrada del ADN. Durante la maduracin de la cpside, la protena B es escindida para formar la protena B* en tanto que la protena Nu3 es degradada y removida de la estructura. Las protenas C y E participan en una fusin para formar protenas hbridas X1 y X2 (Fig. 11). Como se mencion antes, en la etapa final de maduracin requiere del empaquetamiento del ADN dentro de la cpside. El ADN concatemrico del fago es reconocido en el sitio cos por la terminasa (complejo I), tambin se necesita la participacin de dos protenas del hospedero, las protenas IHF y THF, para que se realice el corte en el sitio cos. La terminasa de consiste de dos subunidades (Nu1 y A) que reconoce secuencias especificas en la regin cos. Solo se sintetizan de 100 a 200 molculas de terminasa en el curso de una infeccin. El reconocimiento es llevado a cabo gracias al motivo hlice -vuelta- hlice de la subunidad pequea de la enzima Nu1. Esta subunidad se une a 3 o a 4 secuencias repetidas en la regin cos. La subunidad mayor tiene actividad de endonucleasa que rompe el enlace fosfodiester en una de las cadenas (nick). En el sitio cos se localizan dos de estos sitios en cadenas opuestas y a una distancia de 12 nucletidos. La afinidad de la terminasa en la regin de cos es estimulada por la unin y doblamiento del ADN, efectuado por el factor IHF del husped. La unin del complejo I al precursor de la cpside genera el complejo II, cuya reaccin es potenciada por la protena FI del fago (Fig. 11). La entrada del genoma de a la cpside se realiza en forma polar, es decir, la direccin de empaquetamiento del ADN es del gen Nu1 a R. La terminasa no solo se encarga del reconocimiento de los sitios cos, sino tambin de la unin de este con el precursor de la cpside, y establece el origen y direccin de empaquetamiento. El empaquetamiento requiere de la hidrlisis de ATP para la

condensacin del ADN de 30 a 200 veces dentro de la cpside. Durante el empaquetamiento del ADN, la cpside sufre una expansin del 75% en su tamao, dejando espacios en la estructura de la red conformada por la protena E. Estos nuevos espacios son ocupados por la protena D en un nmero equivalente al de la protena E, brindndole estabilidad a la cpside madura. El corte del ADN en su regin cos termina con el empaquetamiento, la terminasa se disocia de la cpside madura pero continua unida al ADN concatemrico para formar un nuevo complejo II con otro precursor de la cpside. En tanto que las protenas W y FII se unen al conector del tallo para evitar la salida del ADN y formar el sitio de unin del tallo con la cpside madura. En tanto, el ensamblaje del tallo se lleva a cabo en forma independiente de la cpside. El tallo del fago consiste de un tubo flexible (no contrctil como en el caso de T4) de 135 nm con un extremo cnico de 15 nm, una fibra terminal de 23 nm. Se compone principalmente de 32 anillos apilados compuesto cada uno de 6 subunidades de la protena V. El producto del gen J compone la fibra terminal que interacciona directamente con el receptor LamB de la superficie de la bacteria. El ensamblaje de la partcula viral se debe principalmente a un fino equilibrio de las diferentes protenas de la cpside y tallo. Los genes estructurales no se encuentran dispuesto al azar en el genoma de sino que los genes de la cpside y del tallo se hallan agrupados en dos regiones que no se solapan. Es interesante notar que los productos de genes que interactan durante el ensamblaje se encuentran codificados en genes adyacentes. Los polipptidos precursores son sintetizados secuencialmente en las cantidades apropiadas durante el ensamblaje, a pesar de ser transcriptos a partir de un solo promotor (pR'). Esto se explica por la expresin diferencial de las protenas, producto de la traduccin diferencial de los cistrones. Pero si se altera la produccin de algunas protenas, se produce un ensamblaje inadecuado que deriva en la formacin de cpsides defectuosas. Lisis Celular Una vez formadas las partculas virales, stas debern salir y dispersarse para encontrar nuevas bacterias y poder multiplicarse. Una de las principales barreras para la salida de las partculas es la malla continua de peptidoglicanos de la pared celular. Esta estructura es estable y resistente y permite mantener la presin osmtica interna de la clula. La estrategia que sigue el bacterifago para sortear esta barrera es producir una endolisina para degradar los componentes de la pared celular. La endolisina es una transglicosilasa que por si sola no es capaz de llegar a su sustrato porque la pared celular se encuentra separado del citosol por la membrana celular, y para llegar a ste requiere de un segundo factor ltico, la holina. Esta es una protena de membrana que daa a la membrana interna y da libre acceso de la endolisina a la pared celular (Fig.12). Los genes de la holina y endolisina, S y R respectivamente del genoma del fago , estn localizados en el inicio de la unidad transcripcional tarda, bajo el control del promotor pR. Este se "prende" aproximadamente a los 8 min del ciclo vegetativo y se expresa en forma constitutiva. La endolisina activa se acumula en el citosol, no teniendo acceso inmediato a

su sustrato. La holina forma lesiones en la membrana que terminan con la respiracin y permiten que la endolisina ataque a la murena. La ms simple explicacin, es que la holina forme poros, y permita que la endolisina cruce la membrana celular. Deleciones en los genes de los holina permite que la respiracin contine, as como la sntesis macromolecular, observndose un incremento de la masa celular, con una acumulacin de viriones en el citosol. Una caracterstica comn del sistema basado en la holina es su dependencia con la membrana energizada, ya que la adicin de venenos contra su sistema energtico, instantneamente disparan la accin de la holina. Este fenmeno de la lisis prematura sugiere que el mecanismo de cronometraje de la lisis depende de la membrana energizada. Propiedades de la holina El gen S de la holina codifica para dos pptidos: uno de 105 aminocidos y otro similar, pero con 2 aminocidos adicionales, o sea de 107 aminocidos, presenta 3 regiones transmembranales con la topologa amino terminal siempre hacia fuera y el carboxilo terminal hacia el citosol. La holina puede unirse al menos en multmeros de seis para formar el poro. La parte citoplasmtica del carboxilo terminal es necesaria para la formacin del poro y tiene un papel regulatorio, dependiendo de sus residuos cargados positivamente. Se ha observado que una misma mutacin en la regin transmembranal 2 (TM2) que cambia la alanina por valina (A52V), le confiere un defecto total en la lisis, acumulndose los viriones mas de la cuenta. Mientras que la mutacin alanina por glicina (A52G) causa una catastrfica lisis temprana, ~20 min, antes de que el primer virion sea ensamblado. Si no se tiene algo adicional, esta es una prueba de que la holina tiene dos funciones esenciales: causar la lisis permeabilizando la membrana y retardar la lisis hasta que el programa del ensamblaje del virin haya generado un nmero suficiente de viriones. Regulacin de la funcin de la holina Qu es lo que hace que la holina dispare la formacin del poro en el minuto 50 sin hacerlo antes o despus?, y sabiendo que ciertos venenos que interfieren con el proceso energtico disparan prematuramente la lisis. Cul es el papel de las membranas energizadas?. Parte de la respuesta est en la protena de 107 residuos. Tanto la holina activa de 105 aminocidos, as como la inhibitoria de 107 aminocidos, son traducidas de diferentes Shine Dalgarno. El cronometraje de la lisis depende de la proporcin de las dos protenas, la cual es 2:1 a favor de la de 105 aminocidos, bajo condiciones estndares de cultivo. La funcin inhibitoria de la protena de 107 es su carga positiva de la posicin 2 (lisina). Graschopf y Blsi fusionando una secuencia seal en la parte amino terminal de 107, eliminan su capacidad inhibitoria y la convierte en una holina activa. Estas consideraciones han permitido proponer un modelo para el evento del disparo de la holina, su dependencia energtica, y su mecanismo inhibitorio. La holina S es insertada en la membrana formando una estructura de horquilla con las regiones TM2 y TM3. La formacin del poro deber requerir que la estructura final tenga 3 regiones TM, por la penetracin amino terminal a travs de la capa bilipdica. As, el inhibidor 107 es defectuosa en llevar a cabo este reacomodo ya que presenta una carga positiva extra en la porcin amino terminal.

Alterando artificialmente la proporcin del inhibidor o de la holina, se puede retardar o acelerar la lisis, respectivamente, sugiriendo que la habilidad para retardar la lisis del inhibidor 107 es un evento poblacional. Debera parecer que la relacin holina - inhibidor estuviera activamente regulado bajo condiciones fisiolgicas, donde un ciclo vegetativo ms extendido pudiera ser favorecido, pero an no se tienen evidencias que tal regulacin haya sido reportado 9:30 jueves 17 abril
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