DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL PARTE I EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL ACTIVO Y EL TIPO MICROORGANISMO

1. OBJETIVO Determinar el efecto del tipo de microorganismo y la concentracin del activo sobre el dimetro del halo de inhibicin para la evaluacin de una sustancia antimicrobiana por difusin el gel. 2. MATERIALES (Materiale !"r #r$!" %e Tra&a'"( Tubo de ensayo con 4 ml de inculo Tubo de ensayo con 2 ml de solucin estndar del antibitico de 1mg/ml Tubos de ensayo peque os vac!os #ecipiente con $" ml de agar antibitico %o.1 fundido a &"'( #ecipiente con 1& ml de agua destilada est)ril (a*as de petri vac!a est)ril con 11 cilindros de acero +ipeta de 1" ml est)ril +ipeta de 1 ml est)ril +in,a est)ril ). MICROORGANISMOS Escherichia coli Pseudomonas eruginosa Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Streptococcus faecalis De los anteriores microorganismos cultivar dos cepas de cada uno en & ml de caldo -. incubados a /&0( por 24 horas. 1 1 1" 1 1 1 1 12 1

*. PROCEDIMIENTO *.1. Pre!ara+i,- %el A+ti." 4.1.1. 4.1.2. 4.1./. 4.1.4. 4.1.&. 4.1.$. -arque los tubos peque os del 1 al 1" (on ayuda de la pipeta de 1" ml adicione 1 ml de agua destilada est)ril en cada tubo Tome 1 ml de la solucin estndar de antibitico de 1 mg/ml y colquelo en el tubo marcado como %o 1 y homogenice. Del tubo 1 tome 1 ml de solucin y colquelo en tubo marcado como %o. 2 y homogenice. #epita el procedimiento hasta el tubo marcado como %o 1" y homogenice. 1ea la 2igura %o. 1

Fi#$ra 1. Pre!ara+i,- %e la %il$+i"-e %el a+ti." *.2. Pre!ara+i,- %el I-,+$l" 4.2.1. 4.2.2. De cada microorganismo haga un cultivo masivo en agar -. e incube a /&'( por 24 horas. (on caldo de preservacin coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una suspensin del microorganismo de 2&3T 4$""nm5 *.). De arr"ll" %el E- a/" 4./.1. 4./.2. 4././. (on ayuda de una pin,a distribuya los cilindros de acero en la ca*a de petri seg6n diagrama ad*unto 42igura %o. 25. 7nocule el recipiente que contienen $" ml agar antibitico %o. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y &"0( con 1 ml del inculo de 2&3T. -e,cle bien sin hacer burbu*as y s!rvalo en la ca*a de petri sin tumbar los cilindros de acero.

4./.4. 4./.&. 4./.$. 4./.9. 4./.8. 4./.;.

De*e endurecer el agar y con ayuda de la pin,a retire los cilindros de acero #evise que los po,uelos no tengan agar en el interior Dispense en cada po,uelo ".1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la distribucin que se ve en la 2igura %o 2. :gregue ".1 ml de agua destilada en el po,uelo central. 7ncube las ca*as a /&0( por 24 horas <uego de incubar mida con un calibrador los dimetros de los halos de inhibicin.

1 1" $ ; &

4 9 2 8

Fi#$ra N".2. Di tri&$+i,- %e l" !"0$el" e- el a#ar.

1. AN2LISIS DE LOS RESULTADOS &.1. #evise las caracter!sticas del halo de inhibicin y determine cuales microorganismos producen halos de inhibicin bien definidos. &.2. #egistre en la Tabla no. 1 los valores de los dimetros de los halos de los microorganismos seleccionados &./. (on la informacin realice el =rfico %o. 1 de Dimetro del halo versus <ogaritmo de concentracin &.4. (alcule los valores de la corona 4>Dimetro del halo ? Dimetro del +o,uelo@/25 &.&. (on la informacin realice el =rfico %o. 2 de <ongitud de la (orona versus <ogaritmo de concentracin. &.$. +or medio de la regresin de m!nimos cuadrados determine la ecuacin de las dos grficosA el valor de #2 y el del intercepto. &.9. +ara determinar el rango de concentracin con la me*or correlacin realice regresiones de m!nimos cuadrados en grupos de cinco 4&5 concentraciones (1 a (&A (2 a ($A (/ a (9A (4 a (9A (& a (; y ($ a (1"A en caso de ser posible. 4Tenga en cuenta que el valor mBimo de dimetro del halo puede estar entre 2& y /" mm y el menor de 12 mm5. &.8. Cl valor del intercepto en la =rafica %o 2A es equivalente a la concentracin m!nima inhibitoria &.;. (on al informacin calculada realice el anlisis de resultados y las conclusiones respectivasA que se emplearn para la segunda seccin del traba*o.

Ta&la N". 1 CONCENTRACION 3+#43l LOGARITMO DE CONCENTRACION DIAMETRO DEL 5ALO (33( LONGITUD DE LA CORONA (33(

DOSIS

(1 (2 (/ (4 (& ($ (9 (8 (; (1"

&"" 2&" 12& $2A& /1A2& 1&A$2& 9A812& /A;"$2& 1A;&/12& "A;9$&$2&

DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL PARTE II EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA DENSIDAD DEL INOCULO 6. OBJETIVO Determinar el efecto de la densidad del inculo sobre el dimetro del halo de inhibicin para la evaluacin de una sustancia antimicrobiana por difusin el gel. 7. MATERIALES (P"r #r$!" %e Tra&a'"( Tubo de ensayo con 2 ml de inculo Tubo de ensayo con 2 ml de solucin estndar del antibitico de 1mg/ml Tubos de ensayo peque os vac!os #ecipiente con $" ml de agar antibitico %o.1 fundido a &"'( #ecipiente con 1" ml de agua destilada est)ril (a*a de petri vac!a est)ril con 11 cilindros de acero +ipeta de 1" ml est)ril +ipeta de 1 ml est)ril +in,a est)ril 8. MICROORGANISMO Bacillus subtilis 9. PROCEDIMIENTO 9.1. Pre!ara+i,- %el A+ti." ;.1.1. ;.1.2. ;.1./. De la primera parte se ha seleccionado el rango de me*or correlacin. : partir de la solucin de 1 mg/ml realice una dilucin que tenga la concentracin ms alta del rango seleccionado la cual llamaremos (1. : partir de (1 realice diluciones seriadas 1D1 hasta (& esta actividad de la misma manera que se reali, en la seccin 4.1. 1 1 & 1 1 1 1 9 1

9.2. Pre!ara+i,- %el I-,+$l" ;.2.1. ;.2.2. ;.2./. ;.2.4. ;.2.&. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar -. suplementado con -nEF 4 4"A/ g/l5 e incube a /"'( por al menos & d!as. 1erifique al microscopio que el cultivo est) totalmente esporulado. (on caldo de preservacin coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una suspensin del microorganismo de 2&3T 4$""nm5. <o llamaremos 7nculo 1G .aga tratamiento t)rmico 49"'( por 1" minutos5 para eliminar las formas vegetativas presentes en la suspensin. +ara preparar el inculo de mayor densidad Tome 1" ml de la suspensin y centrifugue a &""" rpm por 1& minutosH retire el sobrenadanteH resuspenda en pellet en 1 ml de caldo de conservacin. <o llamaremos 7nculo 1"G ;.2.$. +ara los inculos menos densos haga una dilucin 1D1"" de la suspensin de 2&3T. lo llamaremos 7nculo 1"I2G 9.). De arr"ll" %el E- a/" ;./.1. ;./.2. ;././. ;./.4. ;./.&. ;./.$. ;./.9. ;./.8. ;./.;. (on ayuda de una pin,a distribuya los cilindros de acero en la ca*a de petri seg6n diagrama ad*unto 42igura %o. 25. 7nocule el recipiente que contienen $" ml agar antibitico %o. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y &"0( con 1 ml del i-"+$l" 1:; 7nocule el recipiente que contienen $" ml agar antibitico %o. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y &"0( con "A1 ml del i-"+$l" 1:; 7nocule el recipiente que contienen $" ml agar antibitico %o. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y &"0( con "A1 ml del i-"+$l" 1; 7nocule el recipiente que contienen $" ml agar antibitico %o. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y &"0( con 1 ml del i-"+$l" 1:<2; 7nocule el recipiente que contienen $" ml agar antibitico %o. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y &"0( con 1 ml del i-"+$l" 1:<2; Cn cada caso me,cle bien sin hacer burbu*as y s!rvalo en la ca*a de petri sin tumbar los cilindros de acero. De*e endurecer el agar y con ayuda de la pin,a retire los cilindros de acero #evise que los po,uelos no tengan agar en el interior distribucin que se ve en la 2igura %o /. ;./.11. :gregue ".1 ml de agua destilada en el po,uelo central. ;./.12. 7ncube las ca*as a /&0( por 8 a 12 horas ;./.1/. <uego de incubar mida con un calibrador los dimetros de los halos de inhibicin.

;./.1". Dispense en cada po,uelo ".1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la

(1 (& (/ (4 (2

(2 (4 (1

(/ (&

Fi#$ra N".). Di tri&$+i,- %e l" !"0$el" e- el a#ar.

1:. AN2LISIS DE LOS RESULTADOS 1".1. 1".2. 1"./. 1".4. 1".&. #egistre en la Tabla %o. 2 los valores de los dimetros de los halos (on la informacin realice el =rfico %o. 1 de Dimetro del halo versus <ogaritmo de concentracin +or medio de la regresin de m!nimos cuadrados determine la ecuacin de las dos grficosA el valor de #2 . (on los valores de pendiente e intercepto de cada grfico determine la influencia de la densidad del inculo sobre la respuesta del activo. .aga la respectiva discusin y las. conclusiones

Ta&la N". 2 CONCENTRACION 3+#43l LOGARITMO DE CONCENTRACION DIAMETRO DEL 5ALO (33(

DOSIS

(1 (2 (/ (4 (&

DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL PARTE III VALORACION DE LA POTENCIA DE UN ANTIBIOTICO 11. OBJETIVO Determinar la potencia de un antibitico comercial por difusin el gel. 12. MATERIALES Tubo de ensayo con 4 ml de inculo Tubo de ensayo con 2 ml de solucin estndar del antibitico de 1mg/ml Tubos de ensayo peque os vac!os #ecipiente con $" ml de agar antibitico %o.1 fundido a &"'( #ecipiente con 1& ml de agua destilada est)ril (a*as de petri vac!a est)ril con 11 cilindros de acero +ipeta de 1" ml est)ril +ipeta de 1 ml est)ril +in,a est)ril 1). MICROORGANISMO Bacillus subtilis 1*. PROCEDIMIENTO 1*.1. Pre!ara+i,- %el A+ti." 1 1 & 1 1 1 1 / 1

14.1.1. De la primera parte se ha seleccionado el rango de me*or correlacin. 14.1.2. : partir de la solucin de 1 mg/ml del antibitico estndar realice una dilucin que tenga la concentracin ms alta del rango seleccionado la cual llamaremos (1. 14.1./. .aga diluciones serias 1D1 hasta (& de la misma manera que se hace en la seccin *.1. 14.1.4. Diluya el producto en agua destilada hasta obtener una solucin de 1 mg/ml. 14.1.&. : partir de la solucin de 1 mg/ml del producto realice una dilucin concentracin ms alta del rango seleccionado la cual llamaremos +1. 14.1.$. .aga diluciones serias 1D1 hasta +& de la misma manera que se hace en la seccin *.1 que tenga la

1*.2.

Pre!ara+i,- %el I-,+$l"

14.2.1. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar -. suplementado con -nEF 4 4"A/ g/l5 e incube a /"'( por al menos & d!as. 14.2.2. 1erifique al microscopio que el cultivo est) totalmente esporulado. 14.2./. (on caldo de preservacin coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una suspensin del microorganismo de 2&3T 4$""nm5. 1*.). De arr"ll" %el E- a/"

14./.1. (on ayuda de una pin,a distribuya los cilindros de acero en la ca*a de petri seg6n diagrama ad*unto 42igura %o. 25. 14./.2. 7nocule el recipiente que contienen $" ml agar antibitico %o. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y &"0( con 1 ml del inoculo 14././. -e,cle bien sin hacer burbu*as y s!rvalo en la ca*a de petri sin tumbar los cilindros de acero. 14./.4. De*e endurecer el agar y con ayuda de la pin,a retire los cilindros de acero 14./.&. #evise que los po,uelos no tengan agar en el interior. Cn caso de presencia de residuos de agar ret!relos con una esptula delgada est)ril. 14./.$. Dispense en cada po,uelo ".1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la distribucin que se ve en la 2igura %o 4. 14./.9. :gregue ".1 ml de agua destilada en el po,uelo central. 14./.8. 7ncube las ca*as a /&0( por 8 a 12 horas 14./.;. <uego de incubar mida con un calibrador los dimetros de los halos de inhibicin. 11. AN2LISIS DE LOS RESULTADOS 1&.1. 1&.2. 1&./. 1&.4. 1&.&. #egistre en la Tabla %o. / los valores de los dimetros de los halos (on la informacin realice el =rfico %o. 1 de Dimetro del halo versus <ogaritmo de concentracin +or medio de la regresin de m!nimos cuadrados determine la ecuacin de las dos grficosA el valor de #2. 1erifique que las curvas sean paralelas. (alcule la potencia del producto de acuerdo con las siguientes ecuaciones.

Di ta-+ia %e C"-+e-tra+i,- = 2 I = L"# (2( E = >(C1 ? P1( @ (C1 ? P1(A F = 141>(P1?P2?P)?P*?P1( @ (C1?C2?C)?C*?C1(A & = I4E M = F4& P"te-+ia = A-til"#arit3" (M(

+1 +& +/ +4 +2

(2 (4 (1

(/ (&

Fi#$ra N".*. Di tri&$+i,- %e l" !"0$el" e- el a#ar.

Ta&la N". 2 ESTANDARD DOSIS CONCENTRACION 3+#43l LOGARITMO DE CONCENTRACION DIAMETRO DEL 5ALO (33( 1 2 / 4 & MUESTRA DIAMETRO DEL 5ALO (33(