Pruebas diagnsticas basadas en la respuesta inmunitaria

Por qu utilizamos el diagnstico inmunolgico?

El diagnstico clnico no suele ser definitivo. Las lesiones histolgicas pueden ser indicativas pero pocas veces son patognomnicas A veces, el diagnstico microbiolgico es lento, complicado o imposible

Principales motivos de utilizacin del diagnstico inmunolgico

Respuesta secundaria

Intensidad de la respuesta

Respuesta primaria

IgG>>IgM

IgM>> IgG
Tiempo

Periodo de induccin (0-14 das)

Esquema de la respuesta inmune primaria y secundaria

Ttulo: Mxima dilucin a la cual un suero contina siendo positivo en una prueba serolgica determinada Seroconversin: Aumento del ttulo de anticuerpos x4 o paso de negativo a positivo

Intensidad de la respuesta

Seroconversin

Tiempo

Conceptos de ttulo de anticuerpos y seroconversin

Conceptos bsicos
Las IgM normalmente reflejan una infeccin reciente El aumento del ttulo de anticuerpos indica una infeccin reciente A veces, simplemente con determinar un ttulo elevado podemos suponer que se ha producido una infeccin reciente Los ttulos de IgG por s solos suelen indicar uan infeccin pasada

Conceptos bsicos de interpretacin de resultados

1. Pruebas basadas en la deteccin de anticuerpos

Pruebas de aglutinacin
Se utilizan con antgenos particulados tales como una suspensin bacteriana. Detectan preferentemente IgM

Rosa de Bengala (brucelosis)

Este tipo de pruebas suele ser extremadamente sensible pero, al mismo tiempo suele padecer de falta de especificidad por el hecho de ser mayoritariamente IgMs lo que se detecta

Pruebas de aglutinacin: Se basan en la unin de antgenos particulados a los anticuerpos, preferentemente de clase IgM. Suele tratarse de pruebas muy sensibles pero con poca especificidad. Ejemplos de este tipo de pruebas es la aglutinacin con rosa de Bengala empleada en el diagnstico de la brucelosis.

Pruebas de precipitacin
Se utilizan con antgenos solubles a los que se permite difundir en una matriz semislida

Lnea de precipitacin

Inmunodifusin en gel de agar

Se trata de pruebas relativamente sensibles y especficas pero con un elevado componente subjetivo y muy engorrosas

Pruebas de precipitacin: En este caso se utilizacin antgenos solubles que se difunden frente a los anticuerpos. La unin antgeno-anticuerpo precipita de forma visible y permite establecer la presencia de anticuerpos especficos. Un ejemplo clsico de este tipo de pruebas es la inmunodifusin en gel de agar utilizada histricamente en el diagnstico de la leucosis bovina.

Fijacin del complemento

La fijacin del complemento se basa en la capacidad del complemento para unirse a los complejos antgeno-anticuerpo. La prueba incluye la adicin de eritrocitos sensibilizados con una hemolisina. Si el suero posee anticuerpos especficos, se fija el complemento y no puede unirse a la hemolisina para lisar los eritrocitos. Se trata de una prueba muy especfica. C +
Suero Antgeno

positivo
ne g

C C

C positivo

C C

ati v

C C C
ne g

ati v

C C

C C

positivo

negativo

Fijacin del complemento: Como hemos visto en captulos anteriores, el complemento posee la capacidad de unirse a los complejos antgeno anticuerpo (fijacin). Esta capacidad es aprovechada en la prueba de fijacin del complemento. Metodolgicamente, la prueba se desarrolla en dos fases, una primera que es una reaccin antgeno anticuerpo en un medio lquido y una segunda consistente en la adicin de complemento, una hemolisina dependiente de complemento y eritrocitos. Si se ha producido reaccin antgeno-anticuerpo, es decir, si el suero analizado contena anticuerpos frente al antgeno, el complemento queda fijado y no puede activar la hemlisis de los glbulos rojos. Un ejemplo clsico de utilizacin de esta prueba es la perineumona bovina o la pleuroneumona porcina.

Pruebas de hemaglutinacin e inhibicin de la hemaglutinacin

Estas pruebas se basan en la capacidad de algunos patgenos (p.ej. el virus de la influenza) para causar la aglutinacin de los eritrocitos. Pueden utilizarse para detectar el patgeno (pruebas de hemaglutinacin) o los anticuerpos dirigidos contra las hemaglutininas del microorganismo (inhibicin de la hemaglutinacin). Suelen ser pruebas especficas de serotipo o subtipo y bastante sensibles. positivo
ne ga tiv

+
Suero

Inhibicin de la hemaglutinacin

Las pruebas de hemaglutinacin se utilizan con patgenos que poseen esta capacidad, generalmente virus. El ejemplo ms clsico es el diagnstico de la influenza.

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ELISA
Las pruebas inmunoenzimticas se basan en una reaccin antgeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte slido (normalmente una microplaca de plstico) a la que se ha adsorbido un antgeno o un anticuerpo. La prueba puede desarrollarse en diferentes modalidades pero en todas ellas la reaccin final se revela mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color. Se trata de pruebas muy sensibles y especficas a) ELISA indirecto
Aadir anti-inmunoglobulina conjugada a enzima (peroxidasa)

Aadir suero

Aadir sustrato y leer

Placa de ELISA tapizada con el antgeno

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b) ELISA de competicin
Aadir anticuerpo frente al antgeno conjugado al enzima

Aadir suero

Aadir sustrato y leer

Placa de ELISA tapizada con el antgeno

Suero positivo

Suero negativo

b) ELISA de captura
Aadir muestra Aadir anticuerpo deteccin

Placa de ELISA tapizada con un anticuerpo frente al patgeno

Revelar y leer

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Pruebas de inmunofluorescencia
Las pruebas de inmunofluorescencia pueden utilzarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un patgeno. En ambos casos la reaccin finaliza mediante la adicin de un anticuerpo conjugado a una sustancia fluorescente, habitualmente fluorescena. Estas pruebas son muy sensibles pero su interpretacin tiene un alto grado de subjetividad Inmunofluorescencia indirecta
suero

Portaobjetos en el que se ha fijado el microorganismo

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

Conjugado fluorescente

Las pruebas de inmunofluorescencia, en sus dos variantes, directa e indirecta, han sido muy utilizadas durante el siglo pasado aunque hoy en da han cado bastante en desuso debido al desarrollo de otros sistemas diagnsticos como el ELISA o las tcnicas de biologa molecular. La tcnica se basa en una reaccin antgeno-anticuerpo que se revela con la ayuda de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente. Ejemplos de este tipo de pruebas los encontramos en el diagnstico directo de la mayora de virus del sndrome respiratorio bovino.

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Pruebas de neutralizacin
Las pruebas de neutralizacin van dirigidas a la deteccin de anticuerpos capaces de bloquear los eptopos crticos del patgeno. Normalmente suelen tener una interpretacin biolgica correlacionada con la proteccin. Sin embargo, no suelen ser tiles para diferenciar respuestas entre animales infectados y vacunados ya que la matyora de vacunas inducen anticuerpos neutralizantes

+
Suero

+ Cultivo celular o inoculacin

Cultivo celular sin alteraciones

Las pruebas de neutralizacin y en particular las de neutralizacin vrica, son uno de los estndares habituales para medir los niveles de inmunidad protectiva frente a un patgeno. Normalmente la prueba se realiza en dos pasos, uno primero de incubacin del patgeno con el suero del animal a analizar y un segundo consistente en la inoculacin del patgeno en un cultivo celular o en un animal. Si el suero contena anticuerpos neutralizantes, se bloquea la capacidad infectiva del patgeno y; por lo tanto, no produce la infeccin del animal o del cultivo. Este mismo sistema puede utilizarse con toxinas o bacterias. A pesar de su utulidad, este mtodo ha cado en desuso fuera de la investigacin debido al tiempo quew requiere y a la dificultad de trabajar con animales experimentales o cultivos celulares.

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