Crucero CIMAR 7

4.1 ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA POBLACIONAL DEL ALGA ROJA BENTNICA GIGARTINA SKOTTSBERGII EN FIORDOS Y CANALES DEL PACFICO SUR
Enrique A. Martnez M.1 y Andrs Mansilla2 1 Pontificia Universidad Catlica de Chile, 2 Universidad de Magallanes

INTRODUCCIN Entre los recursos renovables de la dcimoprimera regin, se encuentran varias especies de algas. Gigartina skottsbergii (Luga Roja) es una especie de alga altamente cotizada por su elevado contenido de carragenanos (>70%) segn Piriz y Cerezo (1991). Estos compuestos de las paredes celulares de algunas algas rojas son polisacridos sulfatados con muchos usos, que incluso han demostrado tener actividad anti-viral contra el virus del SIDA (Baba et al., 1988, Mitsuya et al., 1988). Gigartina skottsbergii se distribuye entre las regiones XI y XII en Chile continental, pero su explotacin comercial se ha desplazado hacia el sur, debido a la merma de las poblaciones de la parte norte de su distribucin. Por ello el inters de conocer ms de las poblaciones en la XI y XII regiones, especialmente de su diversidad gentica poblacional, densidad, demografa y ambientes ms habitados por esta especie. Particularmente, cuando la presin de explotacin puede reducir las poblaciones y su diversidad gentica. Adems la historia de esta especie ha sido afectada sin duda por eventos catastrficos del pasado, incluyendo los ciclos glaciales-interglaciales del Pleistoceno, con consecuencias evidentes en la vegetacin terrestre (Allnut et al., 1999). En consecuencia, los objetivos del muestreo realizado en este proyecto del Crucero Cimar-Fiordo 7 son: PRIMERA ETAPA (Crucero 26 Junio-18 Julio 2001): 1. Colectar en el mximo de estaciones posibles del Crucero Cimar-Fiordo 7 muestras de Gigartina skottsbergii. (mediante dragas y/o buceo). 2. Determinar la proporcin de fases reproductivas en cada estacin de muestreo, mediante mtodo de Resorcinol-Acetato. 3. Correlacionar la presencia de Gigartina skottsbergii con variables fsico-qumicas (profundidad, salinidad, turbidez, temperatura y nutrientes). 4. Determinar la variabilidad gentica poblacional en las muestras usando los partidores RAPD polimrficos ya probados para la especie (Series Operon B1, X7 y D20). 5. Colectar simultneamente muestras en el estrecho de Magallanes, frente a Punta Arenas, incluyendo baha Intil (Objetivo especfico a desarrollar por el Co-Investigador de la Universidad de Magallanes, Dr. Andrs Mansilla). 6. Comparar la diversidad gentica y datos poblacionales obtenidos en los fiordos y canales frente a Aysn con la obtenida en el estrecho de Magallanes. El presente reporte contiene informacin preliminar de todos estos objetivos, incluyendo datos tomados de muestras obtenidas por el co-investigador del proyecto desde la zona de Punta Arenas en la XII regin.

125

Crucero CIMAR 7

MATERIALES Y MTODOS Muestreo Las muestras de individuos maduros e inmaduros fueron tomadas mediante buceo desde las localidades de baha Intil, baha Chilota, puerto Yartou en Punta Arenas y desde diferentes sitios de muestreo del Crucero Cimar-Fiordo 7 a lo largo del canal Moraleda y senos hacia la vertiente oriental del canal (Tabla I). En estas ltimas muestras fue posible obtener datos adicionales de densidad de plantas, biomasa y salinidad de los sitios de buceo. Tratamiento de las muestras Las muestras una vez colectadas fueron separadas segn sexo o fase (plantas cistocrpicas, tetraspricas y juveniles inmaduros), medidas en su largo y ancho mximo y pesadas. Submuestreos con trozos limpios (sin endfitos o epfitos) de 2x2 cm fueron lavados con agua destilada, secados en papel gofrado y guardados en tubos de 15 mL con Silica para anlisis de laboratorio. Anlisis de laboratorio Discriminacin de fases haplo-diploides Todas las muestras de tejidos inmaduros fueron molidas en nitrgeno lquido y separadas en dos tubos de 1,5 mL. Un tubo para prueba de Acetal-Resorcinol (Garbary y De Wreede 1988) que reconoce mediante los polisacridos de pared celular el tipo de fase (color rojo para gametofitos haploides y claro o amarillento para esporofitos). El otro tubo se guard a 20 C para anlisis de ADN. Anlisis de diversidad gentica El ADN de los tejidos molidos fue extrado mediante buffer CTAB (3%) (ver mtodo en Anexo 1), diluido en agua ultra pura y cuantificado en espectrofotmetro a longitudes de onda de 260 y 280 nm. A una muestra preliminar de individuos haploides de dos localidades del sector del canal Moraleda (isla Traigun, estero Odger, punta Garrao y punta Leopardo) y dos localidades de Punta Arenas (Puerto Yartou y baha Intil) (n=14 individuos por sector) se amplific su ADN por RAPD-PCR con los partidores B1, X8 y D20 de la serie Operon (ver detalles de la amplificacin en Anexo 1). Los patrones de bandeo de 5 L del producto PCR se visualizaron en electroforesis en geles de agarosa al 2%, teidos con Bromuro de Etilo y corridos a 80 mV durante 2 horas. RESULTADOS Los resultados por objetivo son los siguientes: 1. Colectar en el mximo de estaciones posibles del Crucero Cimar-Fiordo 7 muestras de Gigartina skottsbergii. (mediante dragas y/o buceo): Se colect 93 individuos en el sector del canal Moraleda y 165 individuos en el sector de Punta Arenas. 126

Crucero CIMAR 7

2. Determinar la proporcin de fases reproductivas en cada estacin de muestreo, mediante mtodo de Resorcinol-Acetato. De los 93 individuos del canal Moraleda haba 54 maduros. De stos, 45 eran gametofitos y slo 9 eran esporofitos. De los 39 individuos inmaduros haba 4 esporofitos y 35 gametofitos. Lo anterior hace un total de 86% de individuos gametofticos. En Punta Arenas de los 165 individuos haba 50 plantas maduras (27 gametofitos y 23 esporofitos). De las inmaduras, 22 eran tetrasporfitos y 93 eran gametofticas, lo cual hace un total de 73% de individuos gametofticos en Punta Arenas. 3. Correlacionar la presencia de Gigartina skottsbergii con variables fsico-qumicas (profundidad, salinidad, turbidez, temperatura y nutrientes). Las salinidades superficiales registradas en las zonas de muestreo de Gigartina skottsbergii fluctuaron entre 17,1 y 30,5 pp mil. La menor salinidad a la que se observ G. skottsbergii fue de 20,9 pp mil. Las profundidades de colecta variaron entre 2 y 6 metros, habiendo descendido hasta 20 metros. La abundancia mxima de Gigartina skottsbergii no super los 630 g por 0,25 m2. Existe en una muy baja densidad de no ms de 16 individuos por m2. Lo mismo existe una en correlacin negativa entre la biomasa promedio por individuo y la densidad de los mismos (Fig. 1). 4. Determinar la variabilidad gentica poblacional en las muestras usando los partidores RAPD polimrficos ya probados para la especie (Series Operon B1, X8 y D20). 5. Comparar la diversidad gentica y datos poblacionales obtenidos en los fiordos y canales frente a Aysn con la obtenida en el estrecho de Magallanes. Para la muestra preliminar de individuos, se amplific con los 3 partidores escogidos (Fig. 2). Se amplific un total de 23 loci. Los patrones de bandeo son muy similares entre los individuos del canal Moraleda y del sector de Punta Arenas, con polimorfismo muy bajo. El polimorfismo de los 23 loci fue de 17,4% en el canal Moraleda y de 26% y 30% en los dos sectores de Punta Arenas. A pesar del bajo polimorfismo, la distancia gentica de Nei agrupa a los 14 individuos del canal Moraleda separadamente de los del sector Punta Arenas (Fig. 3). 6. Colectar simultneamente muestras en el estrecho de Magallanes, frente a Punta Arenas, incluyendo baha Intil (Objetivo especfico a desarrollar por el Co-Investigador de la Universidad de Magallanes, Dr. Andrs Mansilla). Ver puntos anteriores. CONCLUSIONES PRELIMINARES Los datos colectados apuntan a una mayor diversidad en la zona de Punta Arenas, desde el punto de vista de mayor proporcin de individuos esporfticos en las poblaciones muestreadas y tambin por una mayor diversidad gentica (polimorfismo de loci RAPD). Estos datos sugieren entonces una reduccin paulatina de la diversidad hacia el lmite norte de la distribucin de la especie. Por otra parte, la baja densidad y biomasa de individuos en la zona del canal Moraleda y senos interiores sugieren que ya sea por las bajas salinidades de algunos sectores o bien por eventos histricos del pasado glacial, la vertiente oriental del canal Moraleda se puede considerar una zona pobre para esta especie y de alto riesgo ante una potencial explotacin comercial. Est pendiente una prospeccin hacia la

127

Crucero CIMAR 7

zona de canales expuestos al ocano Pacfico. La zona de Punta Arenas tiene poblaciones ms densas y ello explica su actual rgimen de explotacin. Las biomasas no pudieron ser evaluadas en esta oportunidad, debido a las malas condiciones climticas del muestreo del invierno de 2001 en la zona. REFERENCIAS Allnutt, T. R., Newton, A. C., Lara, A., Premoli, A., Armesto, J. J., Vergara, R., & Gardner, M. 1999. Genetic variation in Fitzroya cupressoides (alerce), a threatened South American conifer. Mol. Ecol. 8: 975-987. Baba, M., R. Pauwels, J. Balzarini, J. Arnout, J. Desmyter & E. De-Clercq, 1988. Mechanism of inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on replication of human immunodeficiency virus in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 6132-6136. Garbary, D. J., & De Wreede, 1988. Life history phases in natural populations of Gigartinaceae (Rhodophyta): quantification using resorcinol. In Loban, C.S., Chapman, D. J. & Kramer, B. P. (Eds.) Experimental Phycology, a laboratory manual. Cambridge University Presss, Cambridge. pp. 174-178. Mitsuya, H., D. J. Looney, S. Kuno, R. Ueno, F. Wong-Staal & S. Broder, 1988. Dextran sulfate suppression of viruses in the HIV family: inhibition of virion binding to CD4+ cells. Science 240: 646-649. Piriz, M. L. & Cerezo, A. S. 1991. Seasonal variation of carrageenans in tetrasporic, cystocarpic and sterile stages of Gigartina skottsbergii S. et G. (Rhodophyta, Gigartinales). Hydrobiologia 226: 65-69. Sernapesca 2000. http://www.sernapesca.cl

Log (Biomasa/ind)

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,5

y= -0.8902x + 2.2113 R2 = 0.6929

1,5

Log (Densidad)

Figura 1. Relacin (logartmica) de biomasa y densidad de plantas de Gigartina skottsbergii en la vertiente oriental del canal Moraleda, senos y fiordos vecinos.

128

Crucero CIMAR 7

D20---> Canal Moraleda M

500pb

Punta Arenas

TC

B1---> Canal Moraleda Punta Arenas

TC

X8--->

Canal Moraleda TC

Punta Arenas

Figura 2. Amplificacin de ADN de 14 individuos haploides de la zona del canal Moraleda y de 14 de la zona de Punta Arenas, usando partidores D20,B1 y X8. C=Control, T= Tetraasporofito, M= Marcador de peso molecular. El segundo individuo con partidor D20 no amplific.

129

Crucero CIMAR 7

0.200

0.150

0.100

0.050

0.000

1 17% 2 100% 3 73% 4

Figura 3. rbol de distancias genticas de Nei (1972) para dos grupos de individuos del canal Moraleda (1 y 2) y dos grupos de individuos del sector de Punta Arenas (3 y 4). Los nmeros en los nodos indican porcentaje de soporte para1000 rplicas de muestreo.

130

Crucero CIMAR 7

ANEXO 1
PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN de Gigartina skottsbergii 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Se tom 50 L de cada muestra y se pusieron en un tubo autoclavado de 1,5 mL. Se agreg a cada tubo 600 L de buffer de lisis (Tris-Base, EDTA, NaCl, Acetato de Potasio), 60 L de Twin 20 10%, 6 L de Proteinasa K 20 ng/L. Se agitaron en vortex y luego en agitador a temperatura ambiente por una hora. Se puso las muestras en hielo 20 min. Se centrifugaron las muestras 10 min a 20 C a 14.000 rpm. Se recuper el sobrenadante (aprox. 500 L) de cada muestra y se puso en tubos autoclavados de 1,5 mL. Se agreg 500 L de Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamlico en la relacin 25:24:1 y se homogeneizaron las muestras manualmente por 5 min. Los tubos con las muestras se centrifugaron 4 min a 14.000 rpm a 10 C. Se recuper el sobrenadante de cada muestra (aprox. 500 L) y se puso en tubos autoclavados de 1,5 mL. A cada muestra se le agregaron 500 L de Cloroformo: Alcohol isoamlico en la relacin 24:1, y se homogenizaron manualmente por un minuto. Se centrifugaron los tubos 2 minutos a 14.000 rpm, 10 C. Se recuper el sobrenadante (aprox. 400 L) en tubos autoclavados de 1,5 mL. Se agreg a cada tubo, el doble del volumen recuperado en el paso anterior, de etanol absoluto fro (20 C). Se dejaron las muestras a 20 C toda la noche. A la maana siguiente se centrifugaron las muestras 25 min a 14.000 rpm, y a 10 C. Se recuper el pelett y se lav con 200 L de etanol 70% (4 C). Se centrifugaron las muestras 5 min a 11.000 rpm. Se sec el pellet y luego se resuspendi en 30 L de agua ultrapura.

PROTOCOLO RAPD-PCR CICLO RAPD-PCR. 94 C ..... 5 min 94 C ........1 min 38 C ..... 1 min 72 C ..... 1 min 30 s 35X 72 C ..... 10 min 4 C ..... infinito. Producto Taq Tampn Mg++ dNTPs Primer DNA Agua Vol. total Stok Vol/20 5 U/l 10 X 50 mM 2,5 mM 10 M 10 ng/L L en 20 L 0,25 2 0,8 1,6 3 2 10,35 20 Concentracin final 1,25 U/rx 1X 2 mM 200 M 1,5 M 20 ng/rx -

131

Crucero CIMAR 7

Tabla I. Estaciones de buceo de julio de 2001, en las que se encontr Gigartina skottsbergii en el Crucero Cimar-Fiordo 7 y en Punta Arenas. LUGAR CANAL MORALEDA Pto. Francs (I. Trnsito) I. Traigun Estero Odger Pta. Leopardo Pta. Garrao TOTAL PUNTA ARENAS Baha Chilota Baha Intil Puerto Yartou TOTAL
a

POSICIN (Lat S/Long W)

Ind. colectados

44 45 46 46 46

37 25 10 30 20

S, S, S, S, S,

73 73 73 73 73

35 44 40 49 43

W W W W W

0a 20 41 15 19 95

53 29' S, 70 38 W 53 46' S, 70 28 W 53 29' S, 70 15 W

50 50 100 200

: Individuos visualizados con robot de Dr. Matas Gorny pero no colectados.

132