Escherichia coli

a- La bacteria. E. coli es una de las especies bacterianas ms minuciosamente estudiadas, y no solamente por sus capacidades patognicas, sino tambin como sustrato y modelo de investigaciones metablicas, genticas, poblacionales y de diversa ndole (Neidhardt, 1999). Forma parte de la familia Enterobacteriaceae (Ewing, 1985). Ella est integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, mviles con flagelos peritricos o inmviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una proporcin G+C de 39 a 59% en su DNA. Se trata de bacterias de rpido crecimiento y amplia distribucin en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales. En conjunto, la importancia de las enterobacterias en patologa humana puede cuantificarse constatando que constituyen el 50% aproximadamente de todos los aislamientos clnicamente significativos en los laboratorios microbiolgicos, y hasta el 80% de todos los bacilos Gram negativos identificados. Integran tambin esta familia otros gneros que se consideran en otros captulos por su asociacin con infecciones intestinales, como son Salmonella, Shigella y Yersinia. E. coli es la especie tipo del gnero Escherichia. Incluye grmenes generalmente mviles, que producen cido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azcares. Producen reaccin positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como nica fuente de carbono y energa, pero s en caldo acetato. Son H2S, ureasa y fenilalanina negativos, pero en general son indol positivos y decarboxilan la lisina (Tabla 1). Se clasifican en ms de 170 serogrupos O segn las caractersticas antignicas de su LPS, y en serotipos por la combinacin de antgenos O y H flagelares. Otros antgenos presentes en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su clasificacin o identificacin. E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del nio, y establece con el husped una relacin estable de mutuo beneficio (Drasar y Hill, 1974). Como integrante de la flora normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de contaminacin fecal cuando est presente en el ambiente, agua y alimentos, junto con otros similares agrupados bajo la denominacin de "bacterias coliformes". Estas son enterobacterias que pertenecen al gnero Escherichia y a otros relacionados como Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia, y que tienen en comn la capacidad de fermentar la lactosa en un lapso no mayor de 48 horas, con produccin de cido y gas. Son grmenes de gran ubicuidad y capacidad de proliferacin, y a la vez de fcil cultivo e identificacin, y por lo tanto muy tiles como indicadores de contaminacin, pero no son enteropatgenos como grupo (como tampoco lo es 49

E.coli), y por lo tanto su presencia en alimentos, ambiente o pacientes no certifica la etiologa de una infeccin intestinal o un brote de ETA. Es necesario hilar ms fino. E. coli puede ser causa de enfermedad endgena en pacientes debilitados o en situacin de alteracin de la pared intestinal (peritonitis, sepsis, etc.), pero las infecciones entricas provocadas por este germen no son causadas por las cepas que habitan normalmente el intestino, sino por lneas especialmente patgenas en esta localizacin (Nataro y Kaper, 1998, Tabla 2), que se transmiten por va fecaloral de persona a persona o a travs del agua y alimentos, y que pasaremos a describir. Las caractersticas de las afecciones que producen se presentan comparativamente en la Tabla 3. En los grficos 1 y 2 se muestra la frecuencia de estos grmenes como agentes de enteritis.

TABLA 1. CARACTERISTICAS GENERALES DE E. coli

Morfologa y tincin Movilidad Relacin con el O2 Requerimientos nutricionales Medio OF Catalasa Oxidasa Nitratos a nitritos Glucosa Lactosa Arabinosa RM VP KCN Citrato Acetato Ureasa H2S Fenilalanina Indol Lisina decarboxilasa
(+) = amplia mayora de cepas positivas

Bacilos Gram (+) Peritricos

Aerobios Anaerobios Facultativos

No exigentes F + + + AG (+) AG + AG + + + (+)

50

TABLA 2.

ESCHERICHIA COLI Patgeno entrico

> Enterotoxignicos (ETEC) > Enteropatgenos clsicos (EPEC) > Enteroinvasores (EIEC) > Productores de toxina de Shiga STX (STEC) > Enteroagregativos (EAEC)

TABLA 3. TOXIINFECCIONES ALIMENTARIAS PRODUCIDAS POR E. coli PATOGENO ENTERICO

Virotipo

Tiempo de Incubacin

Vmitos

Clicos

Diarrea

Fiebre

ETEC y EPEC

12 72 h

+/-

Lquida

EIEC

12 72 h

+/-

Lquida o Inflamatoria

EAEC

12 72 h

+/-

Lquida o Mucosa

+/-

STEC O VTEC

72120 h

Con sangre

-/(+)

51

GRAFICO 1.

PATOGENOS ASOCIADOS CON DIARREA INFANTIL 1990/1994 n=224 nios

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 88

42 19

19

16 8 7 5 3 1 1

GRAFICO 2.

PATOGENOS ASOCIADOS CON DIARREA INFANTIL 1997/2000 n = 112 nios

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 11 8 6 3 5 11 20 41 42

52

b- E. coli como patgeno intestinal. EPEC y STEC. Epidemiologa Las cepas de Escherichia coli patgeno entrico, y en particular los enteropatgenos clsicos (EPEC) son la causa principal de diarrea en los pases pobres, y llevan a la muerte de cerca de un milln de nios por ao. Tambin son en nuestro medio las bacterias ms frecuentemente asociadas con diarrea infantil. Ello es as tanto si se examinan los procesos agudos como los persistentes, si se estudia la situacin en la comunidad o en nios hospitalizados. Nuestros estudios etiolgicos en los ltimos 15 aos (1987, 1990-94 y 1997-2000) sealan esta frecuencia, que es similar en otros pases de la regin. (Montano y col, 1991; Gadea y col., 1998; Ferrari y col.,1998; Torres y col., 2001) Los serogrupos O:111, O:119 y O:55 son los ms comnmente aislados localmente en el conjunto de los cultivos EPEC. Otros serogrupos, como O:142, O:26, O:126, O:86 , etc., son identificados en forma ms espordica. Los pacientes afectados por estos grmenes son habitualmente nios de nivel socio-econmico deficitario, usuarios de servicios pblicos de Salud. EPEC afecta especialmente a nios menores de dos aos y, dado que la dosis infectante estimada para esta edad es reducida (aunque no conocida con precisin) se transmite habitualmente por va fecal-oral, a travs de manos contaminadas, fomites, alimentos, etc., a partir de enfermos, infectados inaparentes o convalescientes que pueden excretar grmenes por hasta 2 semanas. Estas bacterias son sin embargo capaces de afectar, con menos frecuencia, a nios mayores o adultos, y de provocar brotes de ETA tipo gastroenteritis con diarrea lquida no inflamatoria, por consumo en comn de alimentos con altos inculos de microorganismos (108 a 1010). Estos episodios pueden ser revisados en la literatura internacional (Costin y col., 1964; Viljanen y col., 1990), pero no han sido identificados en nuestro pas hasta el momento. Un virotipo especial de E. coli, capaz de producir toxinas similares a la toxina de Shiga, ha sido recientemente renominado STEC (por Shiga Toxin E. coli, es decir, E. coli productor de toxina de Shiga) y se considera causante de patologa grave, en especial en nios, como la colitis hemorrgica (CH) y el Sndrome Urmico Hemoltico (SUH) (Paton y col. 1998; Miliwebsky y col. 1999). El reconocimiento de STEC como una clase diferente dentro de los E. coli patgenos entricos result de 2 observaciones epidemiolgicas claves. La primera ocurri en 1983 durante la investigacin de brotes de enfermedad intestinal caracterizados por dolor abdominal severo y diarrea acuosa seguida por diarrea con sangre. Esta enfermedad se asoci al consumo de hamburguesas poco cocidas en restoranes de comidas rpidas. En los cultivos de materias fecales de los pacientes estudiados se encontr E. coli O157:H7. (Wells y col. 1983). La segunda observacin fue informada en 1985, cuando se public la asociacin de casos espordicos de Sndrome Urmico Hemoltico con la presencia de citotoxinas libres en materias fecales y aislamiento de VTEC (E. coli verotxico, productor de toxina activa sobre clulas Vero) de las heces de estos pacientes (Karmali et al, 1985). 53

Los estudios de brotes y casos espordicos de infeccin por STEC (VTEC) mostraron que el espectro de manifestaciones clnicas incluye la infeccin asintomtica, la diarrea lquida, la diarrea con sangre, y complicaciones graves como la CH, el SUH y el prpura trombtico trombocitopnico PTT (Karmali, 1989). La colitis hemorrgica se manifiesta por dolor abdominal y diarrea acuosa seguida de diarrea con sangre que se asemeja a una hemorragia digestiva baja, que se confunde y a veces se asocia con invaginacin intestinal, y que cursa generalmente sin fiebre, sin elementos inflamatorios abundantes (leucocitos fecales) y con imgenes radiolgicas caractersticas. El SUH est definido por la trada: anemia hemoltica, trombocitopenia y falla renal aguda, precedidas habitualmente por diarrea con sangre. Es una enfermedad sobre todo infantil, que aparece como casos espordicos o brotes, frecuente en el Ro de la Plata, especialmente en Argentina (Gianantonio y col. 1973; Elliott y col., 2001) La dosis infectante de STEC es reducida, de pocos cientos de grmenes casi como en Shigella, y es frecuente la transmisin de persona a persona como en la infeccin por EPEC del lactante (Rivas et al. 1999), pero los animales, especialmente los bovinos, son considerados el reservorio ms importante de VTEC, y el origen habitual de los brotes en el mundo. Los alimentos o subproductos animales (carne mal cocida o manipulada, agua, leche o jugos contaminados con heces animales) son los vehculos de transmisin al ser humano ms frecuentes. La informacin precisa sobre la distribucin y caractersticas de las infecciones humanas por STEC y sobre las variantes regionalmente prevalentes son de gran valor como gua para el control de calidad de los alimentos (Shinagawa y col. 2000; Chinen et al., 2001; Breuer y col. 2001; Olsen et al. 2002) La notificacin del SUH no ha sido obligatoria en Uruguay hasta el presente ao 2002. No obstante, estudios conjuntos realizados en aos recientes por microbilogos y pediatras permiten estimar que su incidencia se aproxima a 5/100.000 nios menores de 5 aos (unos 15 casos nuevos por ao). No se han registrado brotes epidmicos. La enfermedad ocurre raramente en los meses de invierno, y se reconoce con mxima frecuencia de noviembre a marzo. La padecen nios que en promedio han tenido una edad de 11 meses, de nivel socio-econmico aceptable y estado nutricional normal, que viven habitualmente en poblaciones chicas del Interior o zona suburbana de Montevideo, pero no en zonas rurales. Desarrollan en general una enfermedad diarreica aguda, frecuentemente con sangre (Figura 1), seguida de sntomas y signos de SUH. Son derivados habitualmente a los servicios peditricos de Montevideo donde se cuenta con cuidados intensivos y atencin nefrolgica. Los signos y sntomas ms comunes de la misma son los de afectacin hematolgica, renal y del sistema nervioso central (Figura 2). Se requiere dilisis en ms de la mitad de los casos, y ms de 4 cada 5 pacientes evolucionan a la recuperacin completa. Pueden persistir hipertensin arterial, alteraciones neurolgicas o pueden quedar secuelas importantes en el parnquima renal, que exigen dilisis o transplante. Se reconoce actualmente la importancia del seguimiento prolongado de los pacientes, por la posible progresin en el largo plazo de las lesiones. La muerte es un evento raro durante la fase aguda del padecimiento. La hemos comprobado en uno de 32 nios estudiados localmente con esta patologa. 54

La prevencin basada en el conocimiento epidemiolgico y la educacin juega un papel primordial en el control de estas infecciones. En el manejo del paciente, la antibioterapia es de dudoso valor , y puede favorecer la progresin de la infeccin, cuando es realizada con cotrimoxazol.

ANTECEDENTES
de 25 casos de SU H 1989/95

2 4

17
DIARREA C/SANGRE DIARREA S/SANGRE OT ROS SIN ANT ECEDENT ES

FIGURA 1.

SIGNOS Y SINTOMAS en 25 nios con SUH 1989/95

12 11

25

14 12

19

ANEMIA OLIGOANURIA CONVULSIONES EDEMAS DNS-COMA HTA

FIGURA 2. 55

EPEC y STEC. Caractersticas moleculares y patogenia. Estos 2 tipos patognicos de E. coli comparten algunos atributos de virulencia, y poseen caractersticas diferenciales que explican sus propiedades patognicas diferentes. Las cepas de EPEC no producen enterotoxinas clsicas (enterotoxina termolbil LT, o termoestable ST) y muestran invasin de clulas eucariotas con menor intensidad y frecuencia que Shigella y E.coli enteroinvasor (EIEC). Producen en el intestino proximal lesiones de tipo " attaching and effacing" (AE, fijacin y borramiento), caracterizadas por contacto ntimo con los enterocitos, alteracin secundaria de su citoesqueleto, borramiento de sus microvellosidades superficiales con formacin de pedestales, y modificacin de sus flujos de agua e iones. Genes cromosmicos y plasmdicos codifican los productos que intervienen en estas lesiones (Donnenberg, 1999 y 2000). La primera etapa patognica es la formacin de microcolonias sobre la superficie del enterocito, proceso reconocido "in vitro" como adherencia localizada (LA) en cultivo de clulas Hep-2 o Hela. El fenmeno LA est mediado por el bundle-forming-pilus (BFP), fimbria tipo IV que es similar en cuanto a estructura y secuencia aminoacdica a los pili TCP de Vibrio cholerae. Si bien BFP no es esencial para las lesiones de tipo AE, es responsable de la adherencia inicial a las clulas eucariotas. El gen bfpA est localizado en un plsmido de alto peso molecular (50-60 MDa) denominado EPEC adherence-factor (EAF). Los genes necesarios para la formacin de lesiones de tipo AE por EPEC estn contenidos dentro de una "isla de patogenicidad" cromosmica de 35-kb llamada locus of enterocyte effacement (LEE). Este "cassette" gentico es muy similar en organizacin y secuencias a otros hallados en posicin cromosmica o plasmdica en diversos patgenos entricos como Salmonella, Shigella o Yersinia. Varias de estas "islas" incluyen genomas de fagos, o codifican receptores para bacterifagos, que pueden a su vez codificar factores de virulencia. En EPEC, LEE incluye los genes esp, esc, sep, eae, tir y otros, que codifican las protenas bacterianas EspA, EspB, EspD y varias otras, la regulacin de su produccin y los sistemas de secrecin o translocacin de las mismas. La expresin de estas protenas es mxima a 37C y en condiciones similares a las encontradas en el tubo digestivo, lo que sugiere que estn vinculadas a la virulencia de estas cepas. Ellas son en su mayora transferidas al exterior bacteriano por un sistema de secrecin tipo III (mediado por chaperonas y asociado al contacto o proximidad entre bacterias y clulas eucariotas) codificado por los genes esc y sep. Los sistemas de secrecin tipo III son reconocidos por su importante papel en la patogenia de otras infecciones causadas por bacterias Gram negativas, como Yersinia enterocolitica (Hueck, 1998; Hartland y col., 2000) Algunas de las protenas codificadas por LEE y exportadas fuera de la membrana son secretadas al exterior celular y operan en la superficie epitelial; otras forman estructuras o puentes proteicos que vinculan la clula procariota y la eucariota, y otras por fin son translocadas al interior de las clulas epiteliales a travs de esos puentes recientemente descritos. La translocacin de estas protenas es esencial para la traduccin de seales al interior de la clula eucariota, aunque su rol en la patognesis no est totalmente definido. Ellas 56

promueven un contacto ntimo entre la bacteria y la clula husped. La intimina, una protena de membrana externa de 94-kDa., codificada por el gen eae, se une a una protena de 90 kDa. localizada en la membrana de la clula eucariota. Este receptor es en realidad de origen bacteriano y se denomina Tir (Translocated intimin receptor). Tir es translocada a partir de la bacteria a la membrana de la clula husped, donde es fosforilada en uno o ms residuos de tirosina y funciona como receptor para la intimina. La intimina purificada tambin se une a 1 integrinas, lo que sugiere que puede fijarse a ms de un receptor sobre la clula epitelial. Aunque las integrinas no estn presentes en la superficie apical de los enterocitos, s se encuentran en la superficie apical de las clulas M que recubren las placas de Peyer. De esta asociacin EPEC-clulas epiteliales, y en especial Tir-intimina resulta una serie de cambios; el ms fuerte ocurre en la estructura celular con la formacin de los pedestales de actina. Tir fosforilada y unida a intimina se fija a la protena celular Nck, y sta a su vez recluta la actividad de las protenas integrantes de la familia vinculada al Sndrome de Wiscott-Aldrich (WASP), las cuales a su vez activan el complejo Arp2/3, estimulando la formacin de conglomerados de actina, y la polimerizacin de la misma en filamentos que se organizan determinando el borramiento de las microvellosidades y la formacin de pedestales que sostienen las bacterias adheridas y ligadas al citoesqueleto (Daniell y col., 2001; Gruenheid y col., 2001; DeVinney y col, 2001) Secundariamente se producen alteraciones de los niveles intracelulares de inositol-fosfato, con alteracin de los canales inicos y modificacin de los niveles de calcio, que tambin parecen jugar un papel en la patogenia de la enteritis por EPEC. Las clulas Hep-2 infectadas con EPEC muestran elevaciones significativas de los niveles intracelulares de Ca++; a su vez cuando los niveles intracelulares se mantienen constantes luego de la infeccin se evita o retarda la formacin de lesiones AE (Tabla 4). El estudio molecular de nuestras cepas locales EPEC ha mostrado que la casi totalidad de los cultivos O55, O119 y O111 son eae y bfp positivos en PCR. La asociacin es menos estrecha en otros serogrupos, pero en conjunto confirma la utilidad del estudio antignico por aglutinacin para la identificacin inicial de estas bacterias (Tabla 5). Como peculiaridad significativa, debemos mencionar que en la ltima dcada, muchos de estos cultivos han revelado ser resistentes a mltiples antimicrobianos, e incluso en algunos casos a cefalosporinas de tercera generacin por produccin de beta-lactamasas de espectro expandido de tipo PER-2 (Varela y col. 2001). Las cepas STEC o VTEC son un grupo heterogneo de lneas celulares de E. coli capaces de producir verotoxinas, es decir citotoxinas (toxina de Shiga y sus variantes) activas sobre clulas Vero de rin de mono, segn observacin original de Konowalchuk y col. en 1977. Las cepas STEC tanto de origen humano como animal pertenecen a un amplio espectro de serotipos O:H y se ha descrito la produccin de VTs (verotoxinas) en ms de 40 serogrupos. El serotipo O157:H7 es el ms frecuentemente aislado en casos de CH y SUH en U.S.A. y en otros pases desarrollados. Los E.coli de este serogrupo, a diferencia del resto, no utilizan habitualmente el sorbitol; por lo tanto son fciles de reconocer en medios slidos que contienen ese azcar, como el agar MacConkey sorbitol. 57

STEC resiste la acidez gstrica, ingresa al intestino y adhiere a las clulas del colon, a diferencia de EPEC, que lo hace en el delgado. Se atribuye esta caracterstica diferencial a la presencia de adhesinas fimbriales o de membrana distintas a las de EPEC (y an en estudio), y a las diferencias de composicin de las protenas responsables de los fenmenos A/E de fijacin y borramiento, que son inducidos por estos grmenes de modo similar a los enteropatgenos clsicos. Las cepas VTEC producen enterohemolisinas, proteasas y otros productos txicos. El mayor atributo de virulencia, y la caracterstica que define a este virotipo, es la produccin ya mencionada de citotoxinas STX o VT. Las Verotoxinas son una familia de citotoxinas activas sobre distintas lneas celulares, relacionadas antignica y funcionalmente con la toxina de Shiga producida por cepas de Shigella dysenteriae. Pertenecen a 2 grupos antignicos diferentes: el grupo 1 incluye a las VTs neutralizadas por anticuerpos anti toxina de Shiga; el grupo 2 incluye aquellas STX que no son neutralizadas por dicho antisuero. Al igual que otras toxinas bacterianas de naturaleza proteica, las STX estn formadas por 2 subunidades: una subunidad A (activa) y cinco subunidades B (binding), responsables de la unin de la toxina con su receptor funcional. Los receptores de STX en las clulas eucariotas sensibles a su accin citotxica son glicolpidos complejos como Gb3 o Gb4. Una vez unidas al receptor funcional, las VTs son internalizadas por endocitosis y translocadas al citoplasma de la clula, donde la subunidad A es clivada en 2 fragmentos, A1 y A2. El fragmento A1 es transportado en sentido inverso en el aparato de Golgi y alcanza su sitio blanco que es el ribosoma. La toxina cliva un residuo adenina de la unidad ribosmica 28S, produciendo la inhibicin del factor de elongacin 1, que es responsable de la inhibicin de la sntesis proteica en la clula blanco. Las verotoxinas son sumamente activas tambin sobre los ribosomas bacterianos, pero no tienen acceso normalmente a las clulas procariotas (Suh y col., 1998). Estas citotoxinas son sintetizadas en la luz intestinal por STEC. Los grmenes no ingresan a las clulas epiteliales ni al medio interno. Las toxinas, en cambio, son transportadas a travs de las clulas epiteliales del intestino, que no poseen receptores funcionales en cantidad significativa, promueven la secrecin por estas y otras clulas de Interleuquina 8 y otras citoquinas, promueven el aflujo de polimorfonucleares y otros fenmenos inflamatorios, y ejercen su efecto txico sobre las clulas endoteliales de la microvasculatura intestinal y sistmica, rica en receptores especficos. STX 2 y sus variantes, principales protagonistas de los casos de SUH, se fijan pobremente sobre los endoteliocitos entricos, pero tienen una capacidad txica mucho mayor que STX1, capacidad que se expresa a distancia sobre otros parnquimas como el renal o el neural, ricos tambin en receptores. Se cree actualmente que las STX son transportadas en la sangre y llegan a los tejidos blanco adhiriendo a receptores singulares de los leucocitos neutrfilos que operan como transportadores de estas protenas txicas (Jacewicz y col., 1999; Thorpe y col., 1999; Hurley y col., 1999; Stephan y col., 1999). Las islas de patogenicidad LEE de STEC son similares a las de EPEC, pero contienen decenas de genes adicionales, que incluyen los correspondientes a fagos temperados que codifican la sntesis de las citotoxinas caractersticas: STX1, STX2, sus variantes o ambos tipos. Las secuencias de los genes comunes a EPEC y STEC son diferentes, sobre todo cuando codifican productos 58

patognicos que intervienen en interacciones de alteracin y defensa especfica con el husped, como la intimina. Se interpreta que las LEE de STEC derivan de las de EPEC, por incorporacin y recombinacin horizontal de extensos segmentos, bajo la presin selectiva de esas interacciones. Se han encontrado cepas de EPEC O55 genticamente muy similares a otras de O157, e incluso portadoras de genes fgicos incompletos o circunstancialmente no expresados (Perna y col., 1998; Elliot y col., 2000). Ver Tabla 5. En nuestro medio, la investigacin sobre clulas Vero de toxinas Shiga libres en materias fecales, y los ensayos de amplificacin pool PCR y de Southern Blot realizados sobre coprocultivos primarios (Tabla 5) han revelado infeccin por STEC en hasta 50% de los casos de SUH. En una primera etapa, 1989-90, investigamos E. coli O157 con resultado negativo, y verotoxicidad en materias fecales, que fue positiva en 4 de 11 casos. En un segundo perodo, 1994-96, disponiendo de medios ms avanzados (PCR, sondas de ADN), detectamos infeccin por STEC en la mitad de los casos, pero fue igualmente negativa la bsqueda de E. coli O157. En el perodo presente, con mejores recursos y organizacin, y con un programa de estudio precoz de los nios en etapa de diarrea con sangre, estamos logrando certificar la identidad de los grmenes responsables de esta afeccin, a pesar del intenso tratamiento antimicrobiano a que son sometidos estos nios, que interfiere habitualmente con la recuperacin del germen causal. En uno de los casos el germen STEC identificado fue una cepa de E. coli sorbitol positiva y lisina negativa, serotipo O111:H-, productora de VT1,VT2 y enterohemolisina, eae+ y ampliamente sensible a los antibiticos. En otros casos de SUH con aislamiento positivo, se trataba de variantes de E. coli O26 y O145, sensibles, sorbitol, lactosa y lisina positivas, eae+ y tambin formadoras de citotoxinas. El serogrupo O157 ha sido aislado slo una vez en nuestro pas, de un caso reciente de SUH.

59

TABLA 4. FACTORES DE VIRULENCIA DE VIROTIPOS DE E. coli PATGENO ENTERICO

STEC Adhesinas EPEC ETEC EIEC EAEC

+ de membrana
o fimbrial

++ BFP LA ++ (delgado)

++ Fimbriales
factores de colonizacin

+ de membrana
(efecto como Shigella, mediadores proteicos)

+ Fimbrial

Efecto A/E
Mediadores proteicos

++ (Colon)
Hemolisina Proteasas ++ de Shiga efecto sistmico

Enterotoxinas Citotoxinas Invasividad Induccin de inflamacin Area gentica de patogenicidad Plsmido(s) de virulencia LPS (antgenos O)

++ LT y ST

+ mucosa
(+)

(+)

+
LEE Cromosmica y bfp plasmdica Genes plasmdicos ++ (uno o varios) Muchos: (O:128, O:51, O:104, etc.) Isla de patogenicidad plasmdica ++ (220Kb) O:124 O:29

/+
Genes cromosmicos y plasmdicos

LEE Cromosmica y fgica

++
O:111 O:26 (O:157)

++
O:111 O:55 O:119. Otros

+
Varios: (O:8, O:15, O:78, O:89)

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Otros virotipos de E. coli como causa de ETA. ETEC, EIEC, EAEC. ETEC (E. coli enterotoxignico) es un tipo patognico de esta especie que agrupa cepas capaces de producir enterotoxinas proteicas termolbiles (LT) o termoestables (ST), las cuales no se ingieren preformadas ni ingresan al medio interno, sino que se forman y ejercen su accin localmente sobre la mucosa intestinal, promoviendo hipersecrecin de agua y electrolitos. La toxina lbil tiene una estructura y una funcin muy similares a la toxina de Vibrio cholerae; ST es un pequeo polipptido de mayor jerarqua como factor patognico, dado que son principalmente las cepas productoras de ST, o de LT y ST, pero no las que producen slo LT las que se asocian con alteraciones intestinales (Reis y col, 1982). ETEC se localiza sobre las clulas epiteliales del intestino delgado por medio de fimbrias proteicas de diversa composicin antignica y estructural, y all produce sus toxinas que adhieren a receptores celulares, ingresan a los epiteliocitos y modifican su funcin dando lugar a una diarrea lquida, sin fiebre ni inflamacin de la mucosa. Tanto los genes responsables de la produccin de toxinas como los que codifican las adhesinas bacterianas estn localizados sobre plsmidos transferibles, por lo cual esta variante patognica de E. coli incluye a numerosos serotipos que han sido capaces de incorporar esos componentes del genoma procariota (Tabla 4). ETEC es agente de diarrea aguda del nio en regiones pobres, y tambin de enfermedad espordica o epidmica de origen alimentario, que los microbilogos del hemisferio Norte llaman diarrea del viajero. En cualquier caso, las dosis infectantes son relativamente altas, y los vehculos habituales de infeccin son el agua y los alimentos contaminados que permiten la sobrevida y multiplicacin de los grmenes. En nuestro pas, ETEC es el virotipo de E. coli que sigue en frecuencia a EPEC como agente de diarrea aguda en los nios. No ha sido adecuadamente investigado como causante de casos o brotes de ETA. Su investigacin requiere la demostracin en las cepas de genes codificantes de toxinas (por PCR o sondas gnicas) o de las enterotoxinas por ELISA (Svennerholm y col., 1985). Ver tabla 5. EIEC (E. coli enteroinvasor) es una variante patognica comn en pases vecinos, especialmente Brasil, pero aislada pocas veces en nuestro pas pese a la vigilancia sistemtica de muchos aos. Producen infeccin por transmisin persona a persona, y tambin brotes de origen alimentario o hdrico. Se trata de cepas metablicamente muy similares a Shigella (habitualmente lactosa negativos o tardos, anaerognicos, inmviles, lisina negativos: Silva y col., 1980) poseedoras como Shigella de un gran plsmido de virulencia (Lan y col. 2001) y capaces de provocar diarrea lquida o inflamatoria, aunque en dosis infectivas significativamente mayores, del orden de 106. Pertenecen a ciertos serogrupos caractersticos, lo que junto a sus propiedades metablicas tpicas permite identificarlos (Tabla 4). Localmente hemos producido antisueros para el diagnstico de EIEC por procedimientos de aglutinacin y por Elisa dirigido a sus protenas de membrana externa caractersticas (Tabla 5). Hemos obtenido aislamientos de cepas O124 y O29, en nios con diarrea aguda. 61

EAEC (E.coli enteroagregativo) es un conjunto de cepas de esta especie originalmente agrupadas por su modo peculiar de adherencia entre s y a clulas eucariotas en cultivo, segn observaciones originales de Craviotto, Scaletsky y Nataro (Mathewson y Cravioto, 1989). Esta adherencia y la colonizacin del intestino delgado por EAEC son mediadas por fimbrias codificadas en plsmidos (Tabla 4). La deteccin mediante sondas marcadas o PCR de las secuencias de estas adhesinas, y la observacin del patrn de fijacin caracterstico sobre clulas Hep-2 son los mtodos ms tiles de identificacin de estos cultivos (Tabla 5). EAEC produce una reaccin inflamatoria con formacin de mucus y segrega toxinas proteicas propias que contribuyen al dao epitelial (Okeke y Nataro, 2001). El resultado es una diarrea lquida o mucosa, con escasa fiebre o vmitos, que en muchos casos se vuelve persistente (de duracin superior a 14 das), como ha sido descrito en nios de Brasil, de Mjico y de otras regiones (Fang y col., 1995). En nuestro pas, nuestros estudios iniciales realizados con sondas marcadas con digoxigenina y ensayos de PCR desarrollados en el Laboratorio de Referencia de E. coli en Lugo, Espaa, revelan la presencia de estos grmenes en algunos casos de gastroenteritis infantil. Los datos requieren todava confirmacin y organizacin, pero muestran que el grupo microbiano merece atencin localmente. EAEC ha sido reconocido como causa tambin de "diarrea del viajero" (Adachi y col., 2001) y de brotes de enfermedad de origen alimentario (Smith y col., 1994), pero estos aspectos no han sido explorados todava en Uruguay. c- Las perspectivas La jerarqua conocida o sospechada de estos patgenos en nuestro medio impone profundizar su estudio. Es importante determinar la distribucin en los tipos patognicos principales de los distintos atributos de virulencia mencionados, sus variantes genticas y la posible naturaleza clonal de los aislamientos segn serotipos o lapsos identificables. Interesa tambin conocer las vinculaciones entre esas variantes genticas y las caractersticas de la poblacin husped, su nivel de vida, higiene y salud, y la presencia de anticuerpos detectables en los distintos grupos humanos. En cuanto a la epidemiologa de las toxiinfecciones alimentarias, se requiere adelantar varios pasos en la identificacin de este grupo de agentes etiolgicos. Se trata de saber si los "coliformes" asociados con algunos brotes corresponden a cepas de E. coli patgeno entrico, y de avanzar en el conocimiento de sus caractersticas y distribucin. Para esto es necesario poner en juego una metodologa compleja de laboratorio que slo puede implementarse localmente mediante el esfuerzo cooperativo de personas e instituciones, en el marco del convenio existente entre la Facultad de Medicina y el Ministerio de Salud Pblica, y de la colaboracin intrauniversitaria.

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Identificacin de Virotipos E. coli E. coli enteropatgeno (EPEC) *Serotipificacin *PCR para genes bfp, eae E. coli enterotoxignico (ETEC) *Elisa para toxinas LT y ST *PCR o sondas E. coli productor de tox. Shiga (STEC) *Fermentacin del sorbitol y serologa *PCR pool o de barrido *Verotoxicidad de filtrados fecales *Elisa o PCR de colonias, confirmatorio *Antitoxinas en suero por neutralizacin E. coli enteroinvasor (EIEC) *Bioqumicas, serogrupo *Confirmacin por Elisa o Srny E. coli enteroagregativo (EAEC) *Sondas de DNA-digoxigenina
TABLA 5.

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