Soluciones

Gradilla con 6 tubos de ensayo Eritrocitos humanos lavados en solucin. Salina isotnica Solucin de azul de metileno al 1.0% Cloruro de sodio en cristales (NaCl) Balanza granataria Por grupo: 1 Microscopio marca Leica. Procedimiento 1. Hacer los clculos para preparar una solucin de KCl al 3%. 2. Hacer los clculos para prepara una solucin de CaCl2 0.25 M se requieren 15 ml. 3. Calcular el volumen de H2SO4 se requiere para preparar una solucin 3N 40 ml volumen final. 4. Hacer los clculos correspondientes para comprobar que la solucin a 0.9% de NaCl es isotnica con respecto al plasma (ver pag. 92). Considerar que: a) El cloruro de sodio se disocia en solucin acuosa en los iones sodio y cloruro, por lo que la concentracin inica se duplica (1 mmol/l = 2 mosm/l). b) La presin osmtica normal del plasma es de 290-310 mosm/l. 5. Preparar 20 ml de una solucin de NaCl a 4.5% (etiquetar como solucin 1). 6. A partir de la solucin anterior, preparar 25 ml a 0.9% (solucin 2) y 50 ml a 0.045% (solucin 3). 7. Colocar en tres tubos de ensayo las diferentes soluciones de cloruro de sodio preparadas en los puntos 1 y 2. Con la ayuda de un gotero (dejando caer lentamente por las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos lavados. Mezclar con cuidado y dejar reposar a temperatura ambiente unos minutos. Valorar el grado de hemlisis que sufren los eritrocitos cuando se ponen en contacto con las diferentes soluciones. 8. Hacer los clculos necesarios para preparar otras soluciones, por ejemplo: 500 ml de etanol a 45 % (a partir de etanol a 96 %).Expresar en meq/l una concentracin de calcio de 11 mg/dl. Una solucin contiene 14

Objetivos Que el alumno: 1. Identifique la existencia de soluciones en los sistemas biolgicos. 2. Explique los clculos y procedimientos para preparar soluciones porcentuales, molares y normales, as como las diferentes diluciones de stas. 3. Presente ejemplos de soluciones utilizadas en medicina (solucin isotnica, Ringer, Darrow y Hartman). Responda a las siguientes preguntas: 1. Qu es una solucin? 2. Cuntas clases de soluciones existen? 3. Qu significan los siguientes trminos: mol, solucin molar y solucin normal? 4. Qu significan: v/v, p/v, p/p y ppm? 5. Cul es la composicin de las siguientes soluciones: solucin isotnica de cloruro de sodio, suero glucosado a 5%, Ringer-lactato? 6. Cules son los tipos de soluciones que existen in vivo? Mencionar ejemplos. 7. Qu es una solucin isotnica? 8. Qu es una solucin osmolar? 9. Cmo se calcula la osmolaridad de una solucin? 10. Qu les pasa a los eritrocitos cuando se ponen en contacto con soluciones salinas de diferente osmolaridad? 11. Qu se entiende por dilucin y dilucin seriada de las soluciones? Material Por equipo: 3 vasos de precipitado de 10 ml 3 pipetas de 1.0 ml 3 pipetas de 5.0 ml 3 pipetas de 10.0 ml

g de glucosa en 25 ml. Cul es la concentracin molar de la solucin? A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KCl y 126 g de glucosa (C6O6H12). Cunta agua habr que aadirles para que resulte un suero 0.4 osmolar? 9. Calcular la osmolaridad a partir de la composicin de algunas soluciones como Dextrosa a 10 % en solucin salina a 0.45%. Dextrosa a 5 % en solucin salina a 0.2 %. Hartman, Ringer y Darrow. 10. Hacer la dilucin y redilucin (dilucin seriada) de la solucin de azul de metileno como se muestra en el siguiente cuadro: DILUCIN SERIADA DE AZUL DE METILENO Tubo H2O Sol de azul Volumen de (ml) de metileno transferencia 1 2 0.5 ml* 2 2 0.5 ml 3 2 0.5 ml 4 2 0.5 ml 5 2 0.5 ml 6 2 0.5 ml
*Nota: para mezclar al hacer las diluciones se debe succionar y soplar con cuidado la pipeta en cada tubo varias veces antes de transferir la dilucin al siguiente tubo.

reimpresin de la 2a. ed. Mxico: Editorial Limusa; 2004. 3. Laguna J, Pia E. Bioqumica de Laguna. 5a.ed. Mxico: Editorial El Manual Moderno; 2002: p. 41-56. 4. Holum JR. Fundamentos de qumica general, orgnica y bioqumica para ciencias de la salud. Mxico: Editorial Limusa Wiley; 2001. 5. Farias GM. Qumica clnica. Dcima edicin Mxico: Editorial El Manual Moderno; 1999. 6. Bloomfield MM.Qumica de los organismos vivos. Mxico: Editorial Limusa; 1997.

Resultados 1. Expresar en forma ordenada los clculos efectuados para cada uno de los ejercicios. 2. Deducir el movimiento o no del solvente cuando se ponen en contacto eritrocitos con soluciones hipo, hiper e isoosmticas. 3. Calcular la dilucin y la concentracin de azul de metileno en cada uno de los seis tubos de la dilucin seriada (ver pg. 93). Asegrese que la coloracin obtenida disminuya gradualmente conforme avanza la dilucin. REFERENCIAS 1. Villazn SA, Crdenas CO, Villazn DO, Sierra UA. Fluidos y electrlitos. Mxico: JGH Editores; 2000. 2. Pea-Daz A, Arroyo BA, Gmez PA, Tapia IR, Gmez EC. Bioqumica. Undcima

INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA

1. Nunca use un adaptador entre el cable y la fuente de alimentacin. 2. Use siempre el microscopio sobre una superficie dura y estable. 3. Conecte el cable de alimentacin del microscopio a una toma de corriente con conexin a tierra. Se suministra un cable de tres terminales con toma a tierra. 4. Encienda el microscopio girando el interruptor de control de la iluminacin situado en la parte inferior izquierda del instrumento. 5. Coloque el interruptor de control de la iluminacin en el nivel ms bajo. El control de iluminacin le permite ajustar la intensidad de luz. 6. Abra completamente el diafragma de apertura del condensador girando el anillo hacia el extremo derecho. 7. Usando el botn de enfoque del condensador, suba el condensador hasta el extremo superior de su desplazamiento. Iluminacin critica nicamente: si el desplazamiento del condensador es excesivo, limtelo con el tornillo situado debajo de la platina hasta que la lente superior del condensador se encuentre debajo de la superficie de la platina. 8. Coloque la preparacin de la muestra con la muestra en la platina. 9. Gire el revlver hasta situar el objetivo 4 X en la posicin de trabajo. (pag X) 10. Suba la platina girando el mando de enfoque macromtrico hasta que observe la preparacin y, finalmente, enfoque la
9

muestra con precisin utilizando el mando de enfoque micromtrico. 11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de los ojos. 12. Al trmino del uso del microscopio retirar la muestra de la platina. 13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla a su posicin original si es necesario. 14. Colocar el revolver de los objetivos de manera que el objetivo de 4X sea el que quede en direccin de la lmpara. 15. Desconectar cable. el equipo y enrollar el

16. Limpiar la platina y oculares con un pao humedecido con metanol o con un limpia cristal comercial. 17. Colocar al microscopio la funda contra el polvo para mantenerlo en buenas condiciones fsicas y mecnicas. Partes del microscopio: 1) -Oculares. 2) -Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y 100X. 3) -Platina. 4).-Diafragma. 5) -Lmpara. 6).-Tornillo de la platina para desplazar la muestra. 7).-Interruptor de control de la iluminacin. 8).-Tornillo macromtrico. 9).-Tornillo micromtrico.
1 2 6 3 4

Prctica 2

Prctica 2

Regulacin del equilibrio cido-base despus del ejercicio muscular intenso y de la ingestin de bicarbonato de sodio

Objetivos 1. Al finalizar la prctica, el alumno constatar las actividades reguladoras del pulmn y el rin para mantener el equilibrio cido-base en condiciones que tienden a romperlo. 2. Mediante la determinacin del pH observar la variacin de la concentracin de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha realizado ejercicio muscular intenso. 3. Relacionar los resultados obtenidos con los cambios metablicos originados por el ejercicio muscular intenso. Conteste las siguientes preguntas: 1. Por qu es importante que se mantenga constante, dentro de ciertos lmites, el pH en el organismo? 2. Cules son las fuentes de iones H+ en el organismo? 3. Cules son los sistemas reguladores que facilitan la eliminacin del H+ producido en el organismo con el fin de mantener constante el pH sanguneo? 4. Cules son las reacciones de formacin del cido carbnico (H2CO3) a partir de CO 2 y H2O, y de su disociacin para formar el ion bicarbonato? Escrbalas. 5. Qu sistemas amortiguadores participan directamente en la regulacin del pH sanguneo? 6. Cules son los sistemas extrasanguneos que tienden a mantener el pH extracelular? Escriba la ecuacin de Henderson Hasselbalch aplicada al sistema y HCO3/H2CO3 y, con base en ella, conteste la siguiente pregunta: 1. Cmo participan el aparato respiratorio y el rin en el control del pH sanguneo? Material Diez probetas o vasos de precipitado. Orina. Potencimetro. Piceta. Mtodo Un alumno por equipo desayunar o comer normalmente (evitar ingestin de jugos cidos); despus har lo que se indica a continuacin: 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase prctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina. 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase prctica. 3. Orinar en un vaso de precipitado de 100 ml. Anotar el volumen de la muestra. 4. Ingerir 250 ml de agua. 5. Realizar ejercicio muscular intenso, como subir y bajar varias veces las escaleras de tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido por el profesor. 6. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, como en el inciso 3, hasta completar por lo menos cinco muestras. 7. A cada muestra se le determinar el pH inmediatamente despus de haber sido obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a aumentar debido a la prdida de dixido de carbono y a que el crecimiento bacteriano produce amoniaco a partir de la urea.

Anlisis de resultados Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las 5 muestras de orina, trazar una grfica de pH contra tiempo; interpretar los resultados y discutirlos en grupo. Segunda parte Objetivos 1. El alumno constatar el papel del rin en el mantenimiento del equilibrio cido-base en una situacin de alcalosis metablica provocada por la ingestin de bicarbonato de sodio. 2. Mediante la medicin del pH, observar la variacin de la concentracin de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha ingerido una carga de bicarbonato de sodio. Hiptesis Elabore la hiptesis apropiada. Material Orina. Solucin de bicarbonato de sodio a 3%. Potencimetro.

1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase prctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina. 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase prctica. 3. Orinar en una probeta de 100 ml. Anotar el volumen de la muestra. 4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de bicarbonato de sodio. 5. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, hasta completar por lo menos 5 muestras. 6. A cada muestra se le determinar el pH inmediatamente despus de haber sido obtenida. Anlisis de resultados Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las cinco muestras de orina, trazar una grfica de pH contra tiempo; interpretar los resultados y discutirlos en grupo. REFERENCIAS 1. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverte; 2004. 2. Montgomery R. Bioqumica: casos y texto. 6a. ed. Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4. 3. Villazn SA, Crdenas CO,Villazn

Mtodo

Prctica 3

Titulacin de un aminocido con una base y la aplicacin de la ecuacin de Henderson y Hasselbalch. Determinacin del pK1 y del pK2

Objetivos Que el alumno: 1. Experimente y entienda cmo se comporta un sistema amortiguador de pH. 2. Aprenda el uso de la ecuacin de Henderson-Hasselbalch. 3. Aprenda a calcular el pK de un par cidobase. 4. Mida el pH de diferentes sustancias y calcule su concentracin de H+. 5. Aplique estos conocimientos al estudio de las propiedades de los aminocidos. Para lograr lo anterior conteste las siguientes preguntas y planteamientos: 1. Qu es el pH de una solucin? 2. Qu es un sistema amortiguador cidobase y para qu sirve? 3. Cules son los sistemas amortiguadores ms importantes en biologa? 4. Escribir la ecuacin de HendersonHasselbalch. 5. Qu es el pK de un par cido base? 6. Por qu es importante la concentracin de H+ en los seres vivos? 7. Dibujar la frmula de la glicina, de la lisina, de la histidina y del cido asprtico e identificar a los grupos -amino y carboxilo de estos aminocidos, as como su radical, e indicar la naturaleza del mismo. 8. Qu les pasa a estos grupos funcionales cuando se someten a pH cido o bsico? 9. Se pueden usar los aminocidos como amortiguadores de pH? 10. Son los aminocidos buenos amortiguadores a pH de 7.0?

11. Cul es el punto isoelctrico de los aminocidos que tienen un grupo amino y un grupo carboxilo? 12. Cul es la carga elctrica de los aminocidos que tienen dos grupos carboxilo a pH de 7.0? 13. Cul es la carga elctrica de los aminocidos que tienen dos grupos amino a pH de 7.0? Material Cuatro vasos de precipitado de 100 ml. Pipeta de 1 ml (para el NaOH). Potencimetro. Piceta para enjuagar el electrodo. Glicina 0.025 mol/l pH 2. Lisina 0.025 mol/l pH 2. cido asprtico 0.025 mol/l pH 2. Histidina 0.025 mol/l pH 2. NaOH 1.0 mol/l. Mtodo 1. Poner 20 ml de la solucin de glicina en un vaso de precipitado de 100 ml. 2. Proceder a la medicin del pH. 3. Aadir 0.1 ml de NaOH 1.0 mol/l. Agitar el vaso y volver a medir el pH; anotar los resultados. 4. Repetir el paso 3 hasta llegar a un pH aproximado de 12. 5. Hacer lo mismo (pasos 1 a 4) para los otros tres aminocidos.

Anlisis de resultados 1. Hacer una grfica de pH vs volumen en ml de NaOH gastados luego de tomar en cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en 20 ml aumenta la concentracin de OH en 5 mM. 2. Localizar en la grfica el pI y los diferentes pK de los aminocidos. 3. Mediante la ecuacin de HendersonHasselbalch cuantificar la relacin entre cada par de especies ionizables de los aminocidos a diferentes pH. 4. Identificar a qu pH tienen poder amortiguador.

Medicin del pH y clculo de la concentracin de H+ en diferentes lquidos Mtodo 1. Pedir a los alumnos desde la clase anterior que traigan diferentes muestras, tales como leche, caf, refresco, orina, saliva, jugo de frutas, etctera. 2. Colocar los lquidos en un vaso de precipitado y medir el pH en el potencimetro. Anlisis de resultados Calcular la concentracin molar de H + en cada uno de las muestras estudiadas. REFERENCIAS 1. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverte; 2004. 2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioqumica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005

Prctica 4

Estudio de las protenas corporales

Objetivos 1. Aplicar los conocimientos generales sobre las protenas al estudio de las protenas corporales. 2. Conocer las alteraciones ms frecuentes de las protenas plasmticas y sus consecuencias. 3. Conocer los mtodos generales para el estudio de las protenas plasmticas. 4. Determinar la concentracin srica de protena total y de albmina e interpretar los resultados obtenidos. INTRODUCCIN Las protenas son polmeros lineales constituidos por los aminocidos, que se unen entre s por medio de enlaces tipo amida denominados enlaces peptdicos. Los polmeros compuestos por dos aminocidos forman un dipptido, por tres, un tripptido; cuando el nmero de aminocidos es mayor, oligopptidos y polipptidos o simplemente se denominan pptidos. Las protenas son molculas constituidas por una o ms cadenas polipptidicas. Las protenas pueden ser clasificadas en funcin de aspectos tan diversos como su composicin, su disposicin espacial, su funcin biolgica y su localizacin. Atendiendo a su localizacin dentro del organismo humano, las protenas pueden clasificarse en: Hsticas o tisulares, son las protenas de los tejidos.

Plasmticas o hemticas, son las protenas de la sangre. Aunque las protenas tisulares son de gran importancia en el organismo, las localizadas en la sangre (la hemoglobina en los eritrocitos y las protenas plasmticas), por su gran accesibilidad, proporcionan con facilidad informacin importante y, por lo tanto, son las ms utilizadas en el laboratorio clnico. Protenas plasmticas La sangre est constituida por formas celulares en suspensin (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) en un medio lquido llamado plasma. El plasma se obtiene cuando, inmediatamente despus de extraer la sangre, se le agregan anticoagulantes como oxalato, citrato, EDTA o heparina y se centrifuga. Si se recoge sangre sin anticoagulante y se deja que sta coagule, el lquido que se separa se llama suero. El suero carece de clulas y de factores de la coagulacin incluyendo la protena fibringeno, pues sta ha sido transformada en fibrina insoluble en el proceso de la coagulacin. El fibringeno constituye slo de 3 a 6% del total de las protenas en plasma. El agua constituye 92 a 93% del plasma o suero y en ella encontramos electrolitos, metabolitos, nutrientes, hormonas y protenas en una proporcin de 7 a 8%; de estos solutos presentes, las protenas son las que estn en mxima proporcin, aproximadamente 6 a 8 g/dl de suero y este valor es 0.2 a 0.4 g/dl mayor en plasma por la presencia de fibringeno.

Las protenas plasmticas son un grupo de ms de 100 molculas distintas con caractersticas y funciones muy diversas, aunque para fines prcticos el trmino "protena plasmtica" se usa para todas aquellas protenas cuya concentracin en el plasma sea mayor a 10 mg/dl y que cumplan con alguna funcin especfica dentro de l. Aproximadamente son 20 las protenas que cumplen con ambas definiciones. Todas estas protenas, a excepcin del fibringeno, se encuentran tanto en plasma como en suero. La mayora de las protenas plasmticas son sintetizadas por el hgado. Las protenas del plasma, al igual que otras protenas del organismo, son destrudas y reemplazadas constantemente, con una vida media de aproximadamente 10 das. Las funciones de las protenas plasmticas pueden agruparse en tres grandes grupos: de transporte como la transferrina, lipoprotenas y la albmina; de defensa del organismo en el ataque a agentes extraos o para limitar la respuesta inflamatoria, como las inmunoglobulinas, la a1-antitripsina, la haptoglobina y el complemento. Por ltimo, para mantener la presin onctica de la sangre, necesaria para prevenir prdidas de lquido del espacio vascular al intersticial: la albmina es el ejemplo ms importante de este grupo. Mtodos para el estudio de las protenas plasmticas El laboratorio clnico cuantifica en una muestra de suero las concentraciones de protena total y de albmina. A partir de estos datos, se calcula la fraccin globulina como la diferencia entre los dos resultados anteriores y la relacin albmina/globulina se calcula a partir de estos ltimos. La concentracin de otras protenas se determina por grupos (por ejemplo, las gamma-globulinas) o individualmente por mtodos inmunoqumicos (por ejemplo algunas hormonas o marcadores tumorales).

Las enzimas se estudian evaluando su actividad cataltica o su concentracin de masa mediante mtodos inmunoqumicos. Tambin es posible el estudio fraccionado de las protenas, para lo que se recurre a otros procedimientos ms precisos de gran ayuda clnica, como la electroforesis, la inmunoelectroforesis y la inmunodifusin radial de protenas plasmticas. Protena total La suma de las concentraciones de todas y cada una de las protenas presentes en el plasma se conoce como protenas totales y la cifra normal, en promedio, es de 7.1 g/dl, siendo las cifras lmite entre 6 y 8 g/dl. Las protenas totales estn integradas por albmina (ms de la mitad) y las globulinas; estas ltimas agrupan a todas las protenas que no son albmina. La concentracin de las protenas plasmticas en un momento determinado es el resultado de tres procesos: la velocidad de sntesis, el volumen del lquido en que se distribuyen y la velocidad de degradacin. En diversos estados patolgicos, estos procesos pueden superponerse. En la prctica, la determinacin de la concentracin de la protena total es un parmetro que slo refleja los cambios de las protenas ms abundantes, como la albmina y las inmunoglobulinas. La determinacin de protena total es til en el diagnstico de enfermedades del hgado, de los riones y de la mdula sea. En clnica se puede observar hiper o hipoproteinemias, pero tanto en unas como en otras, frecuentemente existe disminucin de la albmina casi nunca, aumento y generalmente aumento de globulinas, en alguna de sus fracciones. La determinacin de las protenas totales suele realizarse en el suero que carece de fibringeno y de cualquier anticoagulante que pueda diluir levemente las protenas en el plasma.

Albmina La albmina es la principal protena plasmtica y es sintetizada y secretada por el hgado a razn de 12 g al da. Supone alrededor de 25% de la produccin proteica heptica total y la mitad de toda su protena secretada. La albmina es una protena globular compuesta por 585 aminocidos en una sola cadena polipeptdica con 50% de -hlice y 15% de estructura , posee 17 puentes disulfuro y tiene una vida media entre 14 y 20 das. En el adulto normal se degradan diariamente 12 g de albmina que pueden proveer de aminocidos para la sntesis de otras protenas. Adems de esta funcin nutritiva, la albmina ayuda a conservar la distribucin normal de agua ya que produce cerca de 80% del efecto osmtico de las protenas plasmticas totales, debido a su alta concentracin y bajo peso molecular. La albmina interviene en el equilibrio cidobsico y se encarga tambin del transporte de varias sustancias como son los cidos grasos, la bilirrubina, varias hormonas e incluso algunos frmacos (sulfonamidas, penicilina G, aspirina, entre otras). Alteraciones en la concentracin de albmina . La ms comn es la disminucin en su concentracin o hipoalbuminemia. En general, la disminucin de 1 g de albmina srica equivale a una prdida de 30 g de protena tisular. Las principales causas de hipoalbuminemia son las enfermedades renales, la desnutricin por baja ingestin de protenas y la sntesis deficiente como consecuencia de la insuficiencia heptica, sobre todo en casos de cirrosis. La manifestacin clnica ms llamativa de la hipoalbuminemia es el edema. Las cifras normales de albmina son de 4.5 g/dl y las cifras lmite entre 3.5 y 5 g/dl. La relacin normal A/G es mayor de uno y es un indicador importante en algunos estados patolgicos. Una relacin A/G baja puede

obtenerse porque existe hiperglobulinemia, hipoalbuminemia o ambas. Separacin electrofortica de las protenas del suero Las tcnicas de electroforesis, enfoque isoelctrico y cromatografa de intercambio inico son algunas de las ms importantes para el estudio de las protenas basadas en su carga elctrica. En la electroforesis, si se colocan las protenas en un soporte (geles polimricos, almidn o papel) inmersas en una solucin amortiguadora a un pH determinado dentro de un campo elctrico, las protenas se desplazan hacia un polo cargado. En funcin de la relacin entre el pH del amortiguador y el pI de la molcula, sta se mover hacia el ctodo, hacia el nodo, o permanecer estacionaria (pH=pI), por influencia del campo elctrico externo. Cuando se realiza la electroforesis en papel o acetato de celulosa a pH 8.6, que es un pH significativamente superior al pI de las principales protenas plasmticas cuyo peso molecular oscila entre 66 000 y 700 000, las protenas estn cargadas negativamente y se mueven hacia el polo elctrico positivo. En funcin de su velocidad de desplazamiento, las protenas del suero se separan en cinco fracciones principales: albmina, globulina -1, globulina -2, globulina , fibringeno (para plasma solamente) y globulina (Fig. 5.1). La electroforesis no separa los componentes proteicos en sustancias qumicamente puras: algunas de estas fracciones representan decenas a cientos de protenas individuales y diferentes que slo tienen en comn la misma velocidad de desplazamiento electrofortico. Hay que tener en cuenta que la migracin a distinta velocidad en el campo elctrico, obedece a la forma y carga de la molcula y menos a su tamao o peso molecular. Las membranas de acetato de celulosa tienen la ventaja de ser qumicamente homogneas y

poder transparentarse, con lo que las sustancias que se separan pueden cuantificarse por densitometra, una vez teidas. Este aparato condujo histricamente a la separacin y clasificacin operacional de las protenas del plasma humano (Fig. 5.1). El rea de cada pico determina la concentracin de la protena que posee esa movilidad particular.

Tabla 5.1 Algunas protenas cuya concentracin se determina en el suero

NOMBRE DE LA PROTENA

g/L

PROPIEDADES Y FUNCIN

MOTIVO PARA LA PRUEBA

Albmina

35-50

Transporte de mltiples sustancias Inmunidad humoral Protena del complemento Implicada en la respuesta inmune Une y transporta vitamina D3 Fija la hemoglobina Promueve la adhesin celular, une fibrina Transporte de hierro Transporte de cobre

Desnutricin Hepatopata Neoplasias Inmunodeficiencias Mieloma Obstruccin biliar Lupus eritematoso Infecciones agudas

Ig G C3 Protena C reactiva Protena fijadora de vitamina D Haptoglobina Fibronectina

8-17 0.50.9 <0.005

0.20.55 0.53.2 0.250.4

Dao heptico grave Hemlisis Sndrome nefrtico Sepsis Leucemia Pancreatitis aguda Hemocromatosis malnutricin Dao heptico grave Sndrome nefrtico

Transferrina Ceruloplasmina

2.34.3 0.20.55

La electroforesis separa las protenas del suero en patrones que pueden ser altamente especficos para ciertas enfermedades como sucede en el mieloma, el sndrome nefrtico, la cirrosis o las quemaduras corporales extensas (Fig. 5.1). Protenas especficas Las protenas plasmticas de inters clnico pueden determinarse por procedimientos cuantitativos especficos que proporcionan una informacin clinica ms precisa que los mtodos anteriores. La cuantificacin se realiza mediante mtodos como la nefelometra, la turbidimetra y la inmunodifusin radial y mtodos de inmunoanlisis con reactivos marcados, como el radioinmunoanlisis, el enzimoinmunoanlisis, el fluoroinmunoanlisis y el luminoinmunoanlisis.

La tabla 5.1 describe algunas de las protenas cuya cuantificacin es de utilidad clnica. Alteraciones de las protenas plasmticas Dada la gran diversidad de funciones desempeadas por las protenas plasmticas en el organismo, son tambin muchas las alteraciones o disfunciones que pueden aparecer. Las alteraciones pueden clasificarse en: Alteraciones en la cantidad de protenas totales. Alteraciones en las fracciones obtenidas tras una electroforesis, disproteinemias. Presencia en el plasma de alguna Ig anormal y/o de alguno de sus fragmentos, paraproteinemias.

 Circulacin en plasma de Ig que precipitan al descender la temperatura. Crioglobulinemia. Defectos aislados de alguna fraccin. Material Gradilla con 6 tubos de ensayo 2 Pipetas de 5 ml, Pipetas automticas Puntas para pipetas automticas Reactivo de Biuret para determinacin de protena: tartrato de K-Na 15 mmol/l, yoduro de sodio 100 mmol/l, ioduro de potasio 15 mmol/l y sulfato de cobre 5 mmol/l. Espectrofotmetro a 540 nm. Solucin reactiva para albmina: verde de bromocresol a pH 4.2 Espectrofotmetro a 630 nm. Suero problema. Solucin estndar de protenas 7 g/dl. Solucin estndar de albmina 5 g/dl. Jeringa*, ligadura y torundas con alcohol. Precauciones. Evtese la hemlisis. La concentracin de las protenas del plasma se modifica por la postura, de forma que existe un incremento de entre un 10% y un 20% tras 30 minutos de pasar de la posicin acostada a la ortosttica. Adems la aplicacin de la ligadura para extraer la sangre puede producir un aumento significativo al cabo de unos minutos. En ambos casos, la modificacin se debe a un aumento del paso de lquido desde el compartimiento vascular hacia el intersticial. Mtodo Para la determinacin de protena total se utiliza el mtodo de Biuret modificado, el cual es de gran especificidad y precisin. Los polipptidos que contengan, por lo menos, dos enlaces peptdicos reaccionan con las sales de cobre en medio alcalino para formar un quelato coloreado (violeta) entre el ion Cu 2+ y los tomos de oxgeno del carbonilo y de nitrgeno de la amida del enlace peptdico. La concentracin de este complejo es proporcional a la concentracin de protena

total en la muestra. La absorbencia se determina a 540 nm con un blanco de reactivos. Preparar la siguiente serie de tubos: No. de tubo Estndar Suero problema Reactivo de Biuret 1. Blanco 1 ml 2. Estndar 25 l 1 ml 3. Suero problema 25 l 1 ml

Mezclar e incubar 15 min a temperatura ambiente. Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm. El color es estable durante 30 min. Clculo: ASuero X [Estndar g/dl] = [Protena Total g/dl] A Estndar Donde A es la absorbencia. El resultado se obtiene en g/dl. El mtodo es lineal hasta valores de 15 g/dl (150 g/l). Valores esperados: Recin nacidos 5.2 - 9.1 g/dl Nios (hasta 3 aos) 5.4 - 8.7 g/dl Adultos 6.0 - 8.0 g/dl Para la determinacin de albmina se requiere de la fijacin especfica del verde de bromocresol a esta protena a determinado pH producindose un cambio de coloracin, de amarillo verdoso a verde azulado. El cambio en la coloracin es directamente proporcional a la concentracin de albmina en la muestra. La absorbencia se determina a 630 nm con un blanco de reactivos.

Preparar la siguiente serie de tubos: No. de tubo Estndar Suero problema Reactivo de albmina 1. Blanco 2 ml 2. Estndar 10 l 2 ml 3. Suero problema 10 l 2 ml

Mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente. Leer frente al blanco de reactivos a 630 nm. El color es estable durante 60 min. Clculo: ASuero X [Estndar g/dl] = [Albumina g/dl] A Estndar Donde A es la absorbencia. El resultado se obtiene en g/dl. El mtodo es lineal hasta valores de 6 g/dl (60 g/l). Los valores mayores de 6 deben diluirse 1:2 con solucin salina. Valores esperado de 3.5 a 5 g/dl (50 g/l).

REFERENCIAS 1. Peters TJ. Clin Chem. 1968; 14: 1147. 2. Murray KR, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Bioqumica de Harper. 16a. ed. Mxico: Editorial El Manual Moderno; 2004. 3. Gonzlez de Buitrago JM. Bioqumica clnica. Madrid: McGraw-Hill Interamericana; 1999. 4. Laguna-Pia. Bioqumica. 4a. ed. Mxico: Salvat; 1990. Cap. 4. 5. Pacheco Leal D. Bioqumica mdica. Mxico: Editorial Limusa; 2004.

Prctica 5

Cintica enzimtica. Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de reaccin enzimtica
Objetivos El alumno: 1. Explicar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una reaccin enzimtica. 2. Calcular por mtodos grficos la velocidad mxima y la constante de Michaelis de una reaccin enzimtica. 3. Conocer los diferentes tipos de inhibidores que existen y estudiar su efecto sobre la Km y V mx. 4. Conocer aspectos bsicos de fotocolorimetra (ver pg, 115). Para lograr los objetivos de esta prctica contestar las siguientes preguntas: 1. Qu es la velocidad de una reaccin enzimtica? 2. Cmo se define la constante de Michaelis (Km) de una reaccin enzimtica? 3. Cmo se define la velocidad mxima (V mx) de una reaccin? 4. Para qu le sirve a un mdico la determinacin de la actividad de algunas enzimas? 5. Cules son las enzimas cuya determinacin tiene valor diagnstico? Hiptesis Si la velocidad de una reaccin enzimtica es proporcional a la concentracin del sustrato; cuando la concentracin del sustrato es muy alta, por lo tanto la enzima se satura y alcanza su velocidad mxima. La enzima que sirve de modelo en esta prctica es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa. Fundamento El mtodo se basa en el hecho de que la glucosa, en presencia del oxgeno del aire y con la participacin de la glucosa oxidasa, se oxida hasta cido glucnico. El perxido de hidrgeno que se forma en el curso del proceso se descompone mediante la peroxidasa. El oxgeno atmico que se desprende en esta ltima reaccin se combina con un cromgeno que se colorea al oxidarse. La intensidad de la coloracin del cromgeno oxidado es proporcional a la concentracin de glucosa. La glucosa oxidasa (-D-glucosa: oxgeno xidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso molecular de 160 000. Existe en forma dimrica y contiene dos moles de FAD como grupo prosttico por mol de enzima. La glucosa oxidasa es altamente especfica, hecho que ha permitido su empleo para el anlisis cuantitativo de glucosa. La reaccin consiste de dos pasos: 1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD

gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2 2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2 glucosa oxidasa-FAD + H2O2 La 4-gluconolactona se hidrata espontneamente dando cido glucnico. La reaccin global se expresa:
Glucosa oxidasa

Glucosa + O2

Acido glucnico + H2O2

La peroxidasa cataliza la transferencia de oxgeno del perxido a un aceptor que es cromgeno como la ortotoluidina, la ortodianisidina, la 2,2-azino-bis (3etilbencentiazolin-6-sulfnico) o la 4-aminoantipirina (y fenol) que se colorean al oxidarse. La reaccin se expresa: E+S ES E+P

Leer ambas series de tubos en el fotocolormetro; utilizar como blanco el tubo 1. Resultados (cuadro 5.2) 1. Clculo de la concentracin inicial de sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que la solucin de glucosa contiene 40 molas ml1. 2. La velocidad ser igual a las unidades Klett por .5 min-1 de incubacin. 3. Con los datos obtenidos completar el cuadro 5.2 y hacer las dos grficas en papel milimtrico. 4. Hacer una segunda grfica con los valores de 1/v vs 1/[S]. 5. Calcular el valor de la velocidad mxima (Vmx) y de la constante de Michaelis (Km) con y sin inhibidor. 6. Determinar el tipo de inhibidor de acuerdo con las grficas del punto anterior. 7. Analizar si los resultados obtenidos estn de acuerdo con la hiptesis planteada. REFERENCIAS 1. Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Revert; 2004. 2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioqumica. 4a. ed. Barcelona: Tubo Solucin de H2O Soucin de No. glucosa (ml) (ml) enzimas (ml) 1 0.0 1.0 3 2 dil 1:10 0.1 0.9 3 3 dil 1:10 0.25 0.75 3 4 dil 1:10 0.5 0.5 3 5 0.1 0.9 3 6 0.25 0.75 3 7 05. 0.5 3 8 1.0 0.0 3 Ediciones Omega; 2005.

Material y reactivos 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una. 1 Pipeta de 5 ml. 2 Pipetas de 5 ml. 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml. Fotocolormetro con filtro azul. Solucin estndar de glucosa 40 mmol/l y una dilucin 1:10 de sta para los tubos 2, 3 y 4. 2 frascos con solucin de enzimas: 41.6 Uml1 de glucosa oxidasa, 4.6 Uml1 de peroxidasa, ortodianisidina 0.21 mmol/l. Solucin de azida de sodio 400 mmol/l como inhibidor. Gotero con HCl. Mtodo I (con azida de sodio) 1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml preincubar 20 minutos la solucin de enzimas con 0.3 ml del inhibidor. 2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1). 3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para cada tubo al agregar la enzima. 4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos temperatura ambiente y de inmediato detener la reaccin agregando 3 gotas de HCl concentrado Considerar un intervalo de 30 segundos para cada tubo al agregar el HCl.

Mtodo II (sin inhibidor) 1.- Preparar nuevamente una serie de tubos como lo indica la tabla 1. 2.- Repetir los paos 3 y 4 del Mtodo I

3. Mathews CK, van Holde KE. Bioqumica. 3a. ed. Espaa: McGraw-Hill Interamericana; 2003. 4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.

Cuadro 5.2 Resultados

Concentracin de sustrato molas de glucosa inicial ml-1 ABCISAS (X) Velocidad de la reaccin unidades Klett 5 min-1 ORDENADAS (y) Velocidad de la reaccin con INHIBIDOR Unidades Klett 5 min -1

Tubo No

1 2 3 4 5 6 7 8

Cuadro 5.3 Resultados (inverso)

Tubo No.

Concentracin de sustrato molas de glucosa inicial ml-1 ABCISAS (X)

Velocidad de la reaccin unidades Klett 5 min-1 1/V ORDENADAS (Y)

Velocidad de la reaccin con INHIBIDOR 1/V Unidades Klett 5 min1 (Y)

1 2 3 4 5 6 7 8