05/06/2009

Mtodos analticos para determinacin de componentes polifenlicos del vino

Eduardo Boido 2009

Determinacin de polifenoles en los vinos

Vino contiene numerosas molculas fenlicas en cantidad variable. Difcil separar diferentes estructuras y dosificarlas por separado. Se calculan INDICES, proveen evaluacin global del contenido fenlico del vino. Permite clasificacin de vinos por su riqueza fenlica.

05/06/2009

Indice de Folin-Ciocalteu (IFC)

Reaccin xido-reduccin entre el reactivo de Folin-Ciocalteu (se reduce) y los polifenoles del vino (se oxidan). Reactivo Folin-Ciocalteu es una mezcla de cido fosfotngstico y cido fosfomolbdico (obtenido a partir de Na2WO4.2H2O y Na2MoO4.2H2O) Se reduce a una mezcla compleja de compuestos azules (de +6 a mezcla de estados +6/+5). Se mide absorbancia a 700 nm del color azul formado (mximo en torno a esa longitud de onda)

Indice de Polifenoles Totales (IPT)

Fundamento del mtodo Toma en cuenta la absorcin a 280 nm caracterstica de los ciclos bencnicos de la mayora de los fenoles. Procedimiento Centrifugar muestra a analizar Diluir el vino (100 veces tintos, 10 veces blancos) con H2O destilada. Ajustar cero contra agua destilada. Registrar la medida de absorbancia a 280 nm de la muestra previamente diluida. Clculos IPT = A280 x F
F = factor de dilucin

05/06/2009

Determinacin de antocianos
At = Al + Ac = Al + TA + TAT
At = antocianos totales Al = antocianos libres Ac = derivados de antocianinas (tanino-antociano directo o mediada por
acetaldehdo, tipo visitina y otros)

Ac = (TA + TAT) TA = fraccin decolorable con SO2 TAT = fraccin no decolorable

Mtodo de Di Stefano
Mtodo qumico basado en una propiedad caracterstica de los antocianos: variacin del color en funcin del pH.
OR 3 OH OH HO O OH OH rojo HO OR 5 O OH OH pseudobase - incolora OR3 OH OR 5

OH-

05/06/2009

Mtodo de Decoloracin con SO2

(cuantifica antocianos libres + derivados de antocianos decolorables)

Utiliza propiedad de los antocianos de combinarse en forma incolora con el ion bisulfito. SO2 + H2O H2SO3 H+ + HSO3anhdrido sulfuroso c.sulfuroso OR3
OH HO O OH OH rojo HO OR5 O SO 3H OH OH incolora

ion bisulfito
OR3 OH OR5

HSO3

Rojo polmero se determina por los pigmentos no decolorables con SO2

DAD1 E, Sig=520,16 Ref=off (E:\TAN03.D) mAU

Deteccin a 520 nm (rojo) Vino Jven

350

300

250

150

100

50

0 0 10 20 30 40 50 min

DAD1 E, Sig=520,16 Ref=off (E:\TAN98.D) mAU 12

Vino con 6 aos de crianza

10 8 6 4 2 0 -2 -4 0 10 20 30

petunidin

200

Derivados de antocianos
petunidin

40

50

min

05/06/2009

Vino jven
Derivados de antocianos

Antocianos

Vino con 6 aos de crianza

Antocianos

Derivados de antocianos

Medida del color en los vinos Vino Tinto

05/06/2009

Medida de color en el vino

Medir absorbancias a 420, 520 y 620 nm (elegir la celda de paso ptico adecuada, no se puede realizar dilucin) Intensidad Colorante (IC )= (A420 + A520 + A620) x F Matiz (T) = A420 / A520

1) 2)

Espacio CIElab

05/06/2009

L* = luminosidad del color a* = valores (-) indican verde y (+) rojo b* = valores (-) indican azul y (+) amarillo Expresados en coordenadas polares: H* = matiz C* = cromaticidad

Polifenoles en uvas
R1
6'

OH OH OH
3'

HO
6

1 8 O 2

B
2'

O OH

A
4

C
4

OH R1 OH OH

OH

R2 O

OH HO

Flavan-3-ol monomer
OH R1 R2 OH OH O OH OH R1 R2 OH OH O O OH R1 R2 OH HO O OH OH OH

OH HO O

OH R1=H or OH R2=OH or galloyl HO

Flavonol
OCH 3 OH HO O+ OCH3

OH R2

OH

OGlc OH

Proanthocyanidin

Anthocyanin
HO OH H HO HO O CO2H O H CO2H H OH HO OH OH H OH CO2H

Stilbene -resveratrol-

Hydroxycinnamic acid

Benzoic acid

05/06/2009

Taninos en uvas y vinos

OH HO O OH

OH OH OH HO O OH

OH OH OH HO O OH

Subunidades de extensin

OH OH OH HO O OH

OH OH OH

Subunidad terminal

HO

O OH

OH OH

Determinacin de taninos
Precipitacin de taninos y cuantificacin Dos tcnicas usando diferentes reactivos: 1- BSA, suero de albumina bovina 2- metilcelulosa
taninos

05/06/2009

Determinacin de taninos por precipitacin con metilcelulosa

Subunidades de los taninos

OH OH O OH OH OH OH

Catequina

OH

O OH

OH OH OH OH

Epicatequina

OH

O OH OH

OH OH

OH

O OH

Epigalocatequina
OH O

O OH

Epicatequina 3-O-galato
OH OH

05/06/2009

Catlisis cida con floroglucinol

Kennedy and Jones, 2001

Subunidad de extensin (electrfilo)

Unidad terminal

Kennedy and Jones, 2001

10

05/06/2009

Taninos de semilla
Gran impacto en la calidad del vino La calidad de estos taninos se origina en el viedo

Peso de semillas
45 30 Fresh weight Dry weight 40 25 Difference

Seed weight (mg)

35

Difference (mg)

20

30

25

15

20 10 15

10

5 03-Jan-00

17-Jan-00

31-Jan-00

14-Feb-00 28-Feb-00 13-Mar-00 27-Mar-00

Date

Kennedy et al. Aust. J. Grape Wine Res., 6:244-254 (2000)

11

05/06/2009

Evolucin de los taninos de semilla

20000 2000 Barossa Valley Shiraz (+6 months) 2001 Willamette Valley Pinot noir 1998 Napa Valley Cabernet Sauvignon

Procyanidin, nmol/berry

15000

Berry Weight SH: 1.2 g/berry PN: 1.3 g/berry CS: 1.1 g/berry
~73%

10000

5000

~54% ~45%

0 01-Jul

15-Jul

29-Jul

12-Aug

26-Aug

09-Sep

23-Sep

07-Oct

21-Oct

Date

Kennedy et al., 2002

Polyphenol development per seed Total subunit amount

Evolucin de los taninos de semilla

Polyphenol Biosynthesis Stage 1
procyanidin synthesis

Polyphenol Oxidation Stage 3 Stage 4

non-programmed oxidation

Stage 2

flavan-3-ol monomer programmed synthesis oxidation

Rate

Solute accumulation per berry

organic acids sugars and anthocyanins non-anthocyanin glucosides

Berry weight

Col 3 vs Col 6

01-Dec-99

01-Jan-00

01-Feb-00

01-Mar-00

01-Apr-00

01-Dec-99 Fruit set

24-Jan-00 Veraison

22-Feb-00 Maximum berry weight

21-Mar-00 Commercial ripeness

Kennedy et al. Aust. J. Grape Wine Res., 6:244-254 (2000)

12

05/06/2009

Desarrollo de las semillas

Envero

8 semanas entre envero y cosecha

Cosecha

3-Flavanoles
1200 Flavan-3-ols, nmol/berry C eC eCG C 65 54 52 50 48 % of Total eC eCG 27 8 43 3 46 2 48 2 51 1

600

19-Aug 05-Sep 19-Sep 07-Oct 18-Oct

400

200

0 19-Aug 5-Sep 19-Sep 7-Oct 18-Oct

Kennedy et al. Phytochemistry, 55:77-85 (2000)

13

05/06/2009

Taninos de cscara
Se hacen evidentes por la incorporacin de antocianos Variabilidad en la cantidad de extrables durante la madurez Variabilidad en la distribucin por tamao

Taninos en cscara
5000

4500

Skin tannin, nmol/berry

4000
Average Degree of Polymerization

30

28

76% 74%

26

3500

24

22

61%
20 18 13-Aug

3000

20-Aug

27-Aug

03-Sep

10-Sep

17-Sep

24-Sep

01-Oct

Date

2500 13-Aug

20-Aug

27-Aug

03-Sep

10-Sep

17-Sep

24-Sep

01-Oct

Date

Kennedy et al., 2002

14

05/06/2009

En resumen
Taninos de semilla Aumenta la oxidacin Reduccin del porcentaje de bajo peso molecular Disminuye la extractibilidad Cambios paralelos a los cambios de color Taninos de cscara Variable grado de polimerizacin media Incorporacin de pigmentos Incorporacin de pectina Extraccin variable Aumento en la proporcin de taninos de cscara respecto a los de semilla

cidos cinmicos en vinos y sus correspondientes esteres tartricos en uvas

15

05/06/2009

Determinacin de cinamil tartrico esteres en mostos

GRP

Deteccin a 320 nm

Flavonoles en uvas y vinos

R OH HO O OH OH O R'

kaemferol quercetina miricetina

16

05/06/2009

Determinacin de flavonoles

Stilbenos en uvas y vinos

17

05/06/2009

Determinacin de stilbenos

Columna: RP C18 Solvente A: Acetonitrilo Solvente B: Agua Deteccin: tiempo de retencin y espectro UV

Adrian et al, Am. J. Enol. Vitic., 2000

Determinacin de stilbenos

Columna: RP C18 Solvente A: Acetonitrilo Solvente B: Agua Deteccin: tiempo de retencin y espectro UV

Adrian et al, Am. J. Enol. Vitic., 2000

18

05/06/2009

Determinacin de procianidinas (HPLC/MS)

-Separar cscara y semillas - Semillas Homogenizar y extraer con metanol (HCl 1%) Rotaevaporar metanol Recoger con agua y liofilizar Reconstituir e inyectar - Cscara Homogenizar y extraer con metanol/agua (75:25) Rotoevaporar metanol Recoger con agua y liofilizar Purificar e inyectar HPLC-MSn Columna C18 de fase reversa 150 x 4,6 mm Solventes: A, cido actico 2,5% B, cido actico 2,5%-acetonitrilo (90:10, v:v) C: acetonitrilo Gradiente de elucin: desde 0 a 100% de B durante 5 min, desde 0 a 15% de C durante 25 min, desde 15 a 50% durante 5 min, e isocrtico 50% de C durante 5 min, con un flujo de 0,5 mL/min. La deteccin se llev a cabo a 280 nm (flavanoles)

Correlacin de fenoles totales con al capacidad antioxidante total de ruptura de cadena

(reactivo linoleato de metilo)

De Beer et al, Am. J. Enol. Vitic. (2004)

19