AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FSFORO APARTIR DE CUATRO SUELOS DE LA PROVINCIA DE CHIMBORAZO

ESTEBAN ANDRES GUZMAN ESTRADA.

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TTULO DE INGENIERO AGRNOMO

ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD RECURSOS NATURALES

ESCUELA INGENIERA AGRONMICA

RIOBAMBA ECUADOR

2011

DEDICATORIA

La presente investigacin la dedico a todas las personas que han contribuido con mi formacin tanto a nivel personal como acadmico.

La dedico a las personas autodidactas que se esfuerzan por conseguir y formar el conocimiento de una manera espontanea.

AGRADECIMIENTO

Un sincero agradecimiento a toda mi familia que ha contribuido de una manera activa para alcanzar mis expectativas en la vida.

Agradezco al departamento de Ciencias Biolgicas en especial al Doctor Carlos Rodrguez por abrirme las puertas para realizar la investigacin as como de bridarme sus conocimientos y experiencia en el campo de la microbiologa.

iv

TABLA DE CONTENIDO LISTA DE TABLAS....v LISTA DE GRFICOS......xii LISTA DE ANEXOS..................xiii

Nmero

CAPITULO

Pg.

I. II. III. IV V. VI. VII. VIII. IX X

TTULO INTRODUCCIN REVISIN DE LITERATURA MATERIALES Y MTODOS RESULTADOS DISCUSIN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

1 1 5 17 26 37 39 40 43 45

LISTA DE CUADROS

Nmero Tabla 1

Descripcin

Pg.

Intervalos de suficiencia de la concentracin de nutrientes en 14 tejidos vegetales.

Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5

Esquema del anlisis de varianza del ensayo preliminar. Caractersticas generales de las muestras de suelo. Esquema del anlisis de varianza para el experimento principal. Esquema del anlisis de varianza para la eficacia de solubilizacin de fsforo insoluble.

19 20 22 25

Tabla 6

Nmero de ufc/g de posibles bacterias solubilizadoras de fsforo del experimento preliminar.

26

Tabla 7

Anlisis de varianza para el nmero de ufc/g de suelo en el ensayo preliminar.

27

Tabla 8 Tabla 9

Parmetros fsicos qumicos de las muestras de suelos.

27

Nmero de unidades formadoras de colonias por gramo de suelo 28 y suelo seco (ufc/g).

Tabla 10

Anlisis de varianza para el nmero de unidades formadoras de colonias de bacterias por gramo de suelo seco (ufc/g) expresados en log base 10.

29

Tabla 11

Porcentajes de bacterias solubilizadoras de fsforo en los platos de aislamiento.

30

Tabla 12

Porcentajes de bacterias solubilizadoras de fsforo en los platos

30

vi

de aislamiento. Tabla 13 Anlisis de varianza para el porcentaje de solubilizadores, en el 31 aislamiento selectivo. Tabla 14 Anlisis de varianza para el ndice de solubilizacin de bacterias 33 aisladas del suelo. Tabla 15 Separacin de medias para el nmero de UFC/g de suelo del 34 aislamiento selectivo.

vii

LISTA DE GRFICOS

Nmero Grfico 1 Grfico 2 Grfico 3

Descripcin Nmero de ufc/g de suelo seco por sitio de recoleccin Nmero de aislamientos por sitio de recoleccin Nmero y porcentaje de bacterias solubilizadoras de fsforo por sitio de recoleccin.

Pag. 29 32 33

Grfico 4

Nmero de bacterias segn la forma de la clula y reaccin de Gram.

36

viii

LISTA DE ANEXOS

Nmero Anexo 1 Anexo 2 Anexo 3 Anexo 4

Descripcin Medios de cultivos Procedimiento para la tincin de gram. Datos experimentales. Cdigos de almacenamiento y resultados de solubilizacin de las bacterias.

Pg. 46 48 50 52

Anexo 5

Caracterizacin microscpica.

59

I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FSFORO APARTIR DE CUATRO SUELOS DE LA PROVINCIA DE CHIMBORAZO.

II.

INTRODUCCION.

El fsforo

es un macroelemento esencial para las plantas

porque forma parte de

compuestos orgnicos esenciales, como aquellos que le transportan energa en las clulas (ATP), hasta los nucletidos, que son componentes importantes de los cidos nuclecos (ADN y ARN). Una deficiencia de fsforo en un cultivo puede provocar un crecimiento lento, poco desarrollo del sistema radicular, y una coloracin atpica en las hojas, por lo que influye directamente en la produccin normal de la planta. El fsforo en el suelo se presenta en diversas formas. La forma inorgnica puede estar en forma soluble (H 2 PO 4 ), o como formas insolubles asociadas a minerales y adsorbidos en las superficies de xidos de hierro y aluminio hidratados. El fsforo orgnico forma parte de diversos compuestos, principalmente fosfatos de inositol y cidos nucleicos. Gran porcentaje de los suelos de la provincia de Chimborazo son usados para la explotacin agrcola, tanto en la zona andina como en la zona subtropical. Estos suelos presentan un bajo contenido de fsforo y alto grado de formacin de compuestos

insolubles, principalmente fosfatos triclcicos y fosfatos de hierro. La adicin de fertilizantes fosfatados tiene una baja eficiencia debido a la rpida insolubilizacin de los mismos. Una forma de movilizar el fsforo insoluble del suelo es a travs de la participacin de microorganismos que tienen la capacidad de solubilizar el fsforo. Algunos producen

cidos orgnicos, lo que permite solubilizar el fosfato insoluble. Otro mecanismo usado por los microbios involucra la produccin de fosfatasas, las que mediante procesos enzimticos transforman el fsforo en molculas asimilables para las plantas.

A.

JUSTIFICACION.

La utilizacin de fertilizantes qumicos de fuente mineral, con poca eficiencia en el suelo, provoca un incremento en los costos de produccin debido a su alto precio y a las altas dosis que se deben usar para contrarrestar la cantidad de fertilizante que no llega a estar disponible para las plantas. Adems las repercusiones en el medio ambiente se incrementan, por la acumulacin de compuestos insolubles y sales, que pueden afectar

gravemente los suelos, y por ende el desarrollo de la agricultura.

El desarrollo de la biotecnologa microbiana ha permitido que varios grupos de microorganismos comiencen a ser usados como alternativas vlidas en el proceso de produccin agrcola. Un ejemplo de ello es el uso de microorganismos capaces de solubilizar fsforo en el suelo, los que podran ser usados para movilizar fsforo insoluble y de esa manera hacerlo disponible al sistema radicular de las plantas. Estos microbios podran convertirse en una alternativa vlida para la agricultura, al disminuir el uso de fertilizantes fosfatados y estimular la produccin ms limpia de vegetales.

El presente estudio pretende aislar, caracterizar e identificar microorganismos del suelo que tengan la capacidad de solubilizar fsforo mediante la produccin de cidos

orgnicos. La posibilidad de encontrar alternativas validas ms limpias en la produccin agrcola, justifica ampliamente la ejecucin de estudios como el que se pretende realizar. No solamente se obtendrn productos de mejor calidad, sino que tambin se estar

cuidando el medio ambiente, al disminuir el uso indiscriminado de fertilizantes.

B.

OBJETIVOS.

1.

Objetivo general.

Aislar y caracterizar bacterias solubilizadoras de fsforo de cuatro suelos de la provincia de Chimborazo.

2.

Objetivos especficos.

a.

Seleccionar un medio de cultivo adecuado para el aislamiento de bacterias

solubilizadoras de fsforo.

b.

Determinar la poblacin y porcentaje de bacterias solubilizadoras de fsforo presentes

en cuatro suelos de la provincia de Chimborazo.

c. vitro.

Establecer la eficiencia de solubilizacin de fsforo insoluble en condiciones in

d. fsforo

Caracterizar microscpicamente las bacterias eficientes en la solubilizacin del

C.

HIPOTESIS.

1.

Hiptesis nula.

Ninguna de las bacterias aisladas en cultivo puro es capaz de solubilizar fsforo insoluble.

2.

Hiptesis alternante.

Al menos una de las bacterias aisladas es capaz de solubilizar fsforo insoluble.

III.

REVISION DE LITERATURA.

A.

GENERALIDADES.

Los microorganismos y los productos del metabolismo celular intervienen en forma muy activa en la formacin y estabilizacin de la estructura del suelo, lo que tiene un efecto directo sobre el desarrollo de las plantas. La funcin ms importante que realiza la poblacin microbiana del suelo es la transformacin de la materia orgnica, animal o vegetal, como resultado de la actividad de las bacterias, hongos, y otros microorganismos (Garassini, 1967). La diversidad de microorganismos que se encuentran en el suelo es muy importante, ya que de ellos depende la transformacin de los componentes orgnicos e inorgnicos (Higuera, 2001). Ciertos microbios que se desarrollan cerca de las races de las plantas, en los que estn incluidos algunos grupos de bacterias, hongos y actinomicetes, elaboran elementos nutritivos, especialmente nitrgeno y fsforo, que son utilizados por las mismas races para nutrir la planta (Garassini, 1967).

B.

EL FSFORO EN EL SUELO.

La cantidad total de fsforo en el suelo puede ser alta, sin embargo este puede estar presente en forma indisponible o en formas que estn solo disponibles fuera de la rizsfera. En algunos suelos, ms del 80% del fsforo aplicado al suelo se vuelve inmvil, y por lo tanto no asimilable para la absorcin por parte de las plantas. Entre el 20 al 80% del fsforo del suelo est en forma orgnica, el remanente se puede encontrar en la fraccin inorgnica, contenido en cerca de 170 formas minerales de fsforo (Schachiman 1997).

El fsforo se halla en el suelo como fluoropatita finamente dividida, hidroxiopatita, o cloropatita, o en combinacin con partculas de suelo. Tambin se halla en combinacin con el humus y otras fracciones orgnicas (Tisdale, 1988). El fsforo aparece en el suelo bajo la forma de ortofosfatos en ciertos minerales, como los fosfatos de calcio insolubles, as como adsorbidos en las superficies de los xidos de hierro y aluminio hidratados. Las plantas absorben el fsforo casi exclusivamente en forma de in H 2 PO- 4 (Moorby, 1982).

El suministro a las plantas depende del equilibrio y tasa de liberacin de los iones H 2 PO- 4 , de los compuestos de calcio, hierro y aluminio, a los cuales se encuentra ligado, y de la materia orgnica en descomposicin. Cuando se agrega al suelo una forma soluble como el fosfato monoclcico (Ca(H 2 PO 4 ) 2 ), rpidamente se convierte en la forma di clcica CaHPO 4 , que queda absorbida en los minerales arcillosos. Esto lleva a que se mantenga una concentracin de iones H 2 PO- 4 en la solucin del suelo de 0.003 a 3 mg/Kg, dependiendo del tipo de suelo (Moorby, 1982).

1.

Fsforo activo.

El fsforo activo es el que se encuentra en la fase slida, y es fcilmente descargado a la solucin del suelo, en donde es absorbido por las plantas. Conforme la concentracin de fosfatos en la solucin decrece, parte del fsforo activo es descargado a la solucin. Debido a que la cantidad de fsforo es muy pequea, el fsforo activo es la principal fuente de fsforo disponible para las cosechas (Busman, 2002). De la facilidad con que el fsforo activo pueda ser liberado a la solucin del suelo depende de que un suelo sea frtil o no con respecto al fsforo. El fsforo activo puede contener una cantidad de fsforo inorgnico, el que esta adsorbido en sitios activos de la superficie de las partculas de suelo. Este fsforo reacciona con elementos como el calcio, y aluminio, para formar algunos slidos solubles. Por otro lado, tambin puede contener fsforo orgnico que es fcilmente mineralizado. (Busman, 2002).

2.

Fsforo fijado en las arcillas y los xidos de hierro y aluminio.

El fsforo fijado puede contener compuestos fosfatados inorgnicos que son muy insolubles y compuestos orgnicos que sean resistentes a la mineralizacin por

microorganismos presentes en el suelo. Esta fuente de fsforo puede permanecer en el suelo por muchos aos sin estar disponible para las plantas y no aporta a la fertilidad del suelo (Busman, 2002).

Los compuestos fosfatados inorgnicos que forman parte del fsforo fijado, se presentan en forma de cristales, y son menos solubles que aquellos compuestos que forman parte de reservorio de fsforo activo (Busman, 2002). Los iones fosfato pueden fijarse al complejo arcilloso hmico, y en particular sobre las arcillas, por medio de un puente de calcio. El suelo deja en reserva una parte del H 2 PO- 4 de los abonos y lo devuelve despus a la solucin del suelo a medida que la planta va agotando esta solucin por la adsorcin de una parte de dichos iones. Los iones PO 4 = fijados en la arcilla clcica son fcilmente recuperables. La cantidad de H 2 PO- 4 adsorbido depende del contenido de arcilla, de su capacidad de cambio y del pH, es decir, de la cantidad de iones Ca++ presentes (Guerrero, 2006). Existen tambin en el suelo hidrxidos de hierro y aluminio, especialmente en los suelos cidos, que se comportan como coloides electropositivos, pudiendo fijar iones PO 4 =. Este tipo de fosfatos pasan despus a la solucin del suelo, pero ms lentamente que los que se fijan sobre la arcilla. Por eso se dice que son menos cambiables. Aunque el H 2 PO- 4 absorbido no supone ms que una parte pequea del H 2 PO- 4 total, constituye la mayor parte del H 2 PO- 4 asimilable o cambiable. Dependiendo del suelo este puede alcanzar de 500 a 3.000 kg/Ha (Guerrero, 2006).

3.

Fsforo en la solucin del suelo.

La cantidad de fsforo en la solucin del suelo es muy pequea, pudiendo encontrar una fraccin de una libra por acre (1,118 Kg /Ha). El fsforo de la solucin puede presentarse usualmente en forma de ortofosfato, y constituye el reservorio ms importante para las plantas (Busman, 2002). La concentracin de las soluciones en forma de H 2 PO- 4 es muy pequea, de 0,2 a 0,5 mg/litro, es decir, que para un terreno con 30 cm de profundidad, supondra de 200 a 500 gramos de H 2 PO- 4 por hectrea. En los suelos ricos se puede alcanzar y sobrepasar un miligramo por litro, mientras que en los suelos pobres la riqueza puede bajar hasta 0,1 mg/litro (Moorby, 1982).

4.

Factores que afectan la solubilidad de fsforo en el suelo.

Existen varios factores que influyen en la solubilidad del suelo. Por ejemplo, suelos con una alta cantidad de arcilla fijan ms fsforo que aquellos que contienen menos arcilla. Los suelos con contenidos altos de ciertas arcillas como la caolinita, xidos e hidrxidos de Fe y Al (comunes en las regiones del mundo con alta precipitacin y temperatura), y arcillas amorfas como alfana, imogolita y complejos humus-AI (comunes en suelos formados de ceniza volcnica), retienen o fijan ms fsforo que otros suelos. Sin embargo, sin importar el tipo de arcilla presente, el fsforo aplicado al suelo pasa rpidamente a formas menos disponibles (Gros, 1986). La poca de aplicacin tambin constituye otro factor. Cuando mayor sea el tiempo que el suelo, mayor es la posibilidad de fijacin. En suelos de alta fijacin, el cultivo debe usar el fsforo antes que la fijacin saque el fsforo de la solucin del suelo. En otros tipos de suelo, el fsforo puede estar disponible por aos. Este perodo crtico durante el cual la planta puede utilizar efectivamente el fsforo aplicado determina la poca de fertilizacin (Gros, 1986).

Por otro lado, el oxgeno (O2) es necesario para el crecimiento de las plantas y para la absorcin de nutrientes. Tambin es esencial para la descomposicin microbiolgica de la materia orgnica del suelo. En un suelo bien aireado, la liberacin del fsforo como producto de la descomposicin, ser mayor que en un suelo poco aireado (Gros, 1986). La compactacin reduce la aireacin y el espacio poroso en la zona radicular. Esto reduce la absorcin de fsforo y el crecimiento de la planta. La compactacin tambin reduce el espacio del suelo en el cual penetran las races de la planta, limitando de esta forma su acceso completo al fsforo del suelo. El hecho de que el fsforo se mueve a distancias muy cortas en la mayora de los suelos incrementa los problemas ocasionados por un crecimiento radicular restringido y la limitada absorcin debido a la compactacin (Gros, 1986). El incrementar la humedad del suelo a niveles ptimos hace que el fsforo este ms disponible para las plantas. Sin embargo, el exceso de humedad reduce el O 2 , lo que limita el crecimiento de las races y hace lenta la absorcin de fsforo (Gros, 1986).

Los suelos que han recibido por varios aos ms fsforo que la cantidad removida en los cultivos presentarn un incremento en los niveles de disponibilidad de fsforo lo suficiente para reducir su aplicacin. Es importante el mantener altos niveles de fsforo en el suelo para mantener una produccin ptima de los cultivos (Gros, 1986).

Las temperaturas ideales para un buen crecimiento de la planta afectan muy poco la disponibilidad de fsforo. Las altas temperaturas estimulan la descomposicin de la materia orgnica. Sin embargo, las temperaturas muy altas o muy bajas pueden restringir la absorcin. Por esta razn las plantas responden a las aplicaciones de arranque en suelos fros y hmedos, aun cuando los niveles de P en el suelo sean altos (Gros, 1986). La aplicacin de otros nutrientes puede estimular la absorcin de fsforo. El calcio en suelos cidos y el azufre en suelos alcalinos parecen incrementar la disponibilidad de fsforo igual que lo hace el amonio (NH 4 +). Sin embargo, la fertilizacin con zinc, en un cultivo que est al borde de una deficiencia de P, parece restringir aun ms la absorcin de P (Gros, 1986).

10

Existe una dependencia muy estrecha entre el pH del suelo y la presencia de formas asimilables y formas bloqueadas de fsforo para la nutricin vegetal. En los suelos de pH cido, el fsforo asimilable suele presentarse en forma de fosfatos de hierro y aluminio. En los suelos de pH neutro, en cambio, existen fosfatos de calcio soluble, pero con un pH superior a 7.5 aumentan las formas insolubles del fsforo, no son asimilables por las plantas (Cuerda, 2000).

C.

FORMAS DE SOLUBILIZACION DEL FSFORO EN EL SUELO.

1.

Produccin de cidos orgnicos

Los cidos orgnicos actan sobre compuestos insolubles de fosfato inorgnico como el fosfato triclcico, fosfato diclcico, hidroxiapatita y roca fosfrica. cidos orgnicos de bajo peso molecular como el oxlico, ctrico, lctico, y succnico, se producen en el suelo como resultado de la descomposicin de la materia orgnica. La cantidad y tipo de cidos orgnicos depende de los diferentes grupos de microorganismos. Los cidos orgnicos permiten que haya solubilizacin debido a que su presencia cambia los valores de pH hasta valores cidos, en donde el nmero elevado de protones provoca, por competencia en los sitios de adsorcin del fsforo, el cambio de las cargas superficiales de los adsorbentes, dando como resultado la solubilizacin (Catalina, 2008). Los cidos orgnicos forman complejos solubles con iones de metales como el calcio (quelatos), aluminio y hierro que estn asociados a fsforo insoluble, haciendo que el fsforo quede en forma disponible, reduciendo la adsorcin (Rincn, 2008).

11

2.

Oxidacin y reduccin del fsforo.

Los estados de oxidacin del fsforo van desde el -3 (fosfina) hasta el +5 (ortofosfato). Los microorganismos pueden realizar stas transformaciones cuando al utilizar el fosfito lo transforma en fosfatos en el interior de la clula. Este proceso puede ser reprimido por inhibidores biolgicos tales como tolueno. A travs de este proceso se provoca la solubilizacin del fsforo al reaccionar con los iones del suelo (Hyland et al, 2005).

3.

Mineralizacin.

Los microbios pueden convertir el fsforo orgnico a H 2 PO- 4 o HPO= 4 , que son formas disponibles para las plantas. El fsforo orgnico puede ser mineralizado como subproducto de la descomposicin de la materia orgnica, o mediante la accin de enzimas especificas que son reguladas por la demanda de este nutriente (Picone y Zamuner, 2002).

4.

Produccin de fosfatasas.

En la rizosfera, la presencia de un gran depsito de fsforo orgnico, el cual no puede ser utilizado por las plantas, enfatiza el papel de la flora microbiana en la produccin de diferentes enzimas pertenecientes al grupo de las fosfatasas. Estas estn involucradas en la mineralizacin del fsforo, y al parecer estn reguladas por la expresin de varios genes (Catalina, 2008). Las fosfatasas pueden ser sintetizadas, tanto por las races de las plantas (producen fosfatasas cidas), como por ciertos grupos de bacterias y hongos capaces de producir fosfatasas cidas y alcalinas (Ridge et al, 1974).

12

Aunque gran parte de la actividad mineralizadora del fsforo orgnico ha sido atribuida a las micorrizas, es posible encontrar microorganismos asociados al proceso de descomposicin de materia orgnica, que tambin realizan este proceso mediante la produccin de fosfatasas. El potencial de las enzimas producidas por estos organismos en la mineralizacin de compuestos orgnicos de fsforo es de gran importancia ecolgica (Rincn, 2008).

Existen tres tipos de fosfatasas: cida, alcalina y las fosfatasas con alta especificidad por el sustrato. Muchas de stas han sido identificadas en una gran variedad de hongos. Dada la importancia de esta caracterstica de la flora mictica, su presencia en la zona de la rizosfera resulta de gran valor para el crecimiento de las plantas (Catalina, 2008).

D.

FISIOLOGIA DEL FSFORO EN LA PLANTA.

El fsforo es un componente esencial de las plantas, alcanzando concentraciones (en forma de H 2 PO- 4 ) entre el 0,5 al 1% de la materia seca. Se encuentra, en estado mineral, y en forma de compuestos orgnicos fosforados como fosfolpidos, fitina, nucletidos y cidos nuclicos (Milthope, 1982).

El papel fundamental del fsforo en la transferencia de energa ha sido bien comprobado, tanto en la formacin de ATP durante la respiracin celular, y fotosntesis, como en la formacin del NADPH+H+, necesarios para la sntesis de nueva materia orgnica. Como el nitrgeno, el fsforo es un factor de crecimiento muy importante, existiendo una fuerte interaccin entre stos dos elementos, sobretodo durante las fases iniciales de crecimiento (Milthope, 1982).

13

El desarrollo radicular se ve favorecido por una buena provisin de fsforo a la siembra, por lo que es necesario aadir una pequea cantidad de P 2 0 5 , especialmente en suelos pobres. En trminos generales, puede decirse que es un elemento regulador de la vegetacin y, por tanto, un factor de calidad. Favorece precisamente los periodos de vegetacin que son crticos para el rendimiento del cultivo como germinacin, fecundacin, maduracin y movimiento de las reservas (Milthope, 1982).

El fsforo es absorbido por las races y transportado por el xilema a las hojas jvenes. La concentracin del fsforo inorgnico en el xilema es de un milimol. En plantas que presentan deficiencia, la concentracin es de 7 milimoles, mientras que en plantas con un crecimiento normal, la concentracin es de 125 micromoles de fsforo inorgnico. El fsforo tambin puede ser translocado por el floema, desde las hojas, hacia los sitios de crecimiento rpido y las races. En plantas con dficit de fsforo inorgnico, el suministro de fsforo a las zonas de crecimiento es realizado mediante la movilizacin del fsforo guardado en las hojas viejas, y translocado hacia las hojas jvenes y races en crecimiento. Este proceso involucra tanto el consumo del fsforo almacenado, y el desdoblamiento del fsforo orgnico a inorgnico (Schachiman, 1997).

Una provisin insuficiente de fsforo se manifiesta en anlisis de partes de la planta como son las hojas y semillas, los que generalmente muestran contenidos bajos en relacin a la concentracin ideal (suficiencia) del elemento en los tejidos vegetales (Tabla 1). Las carencias de P 2 0 5 se ponen de manifiesto por un follaje de color verde oscuro, casi azulado, y por las tonalidades amarillentas y prpuras, y el secado de la punta de las hojas. Las deficiencias de fsforo para las plantas traen consecuencias negativas, ya que el cultivo presenta retrasos en el crecimiento, fecundaciones defectuosas, movimientos anormales de las reservas y retrasos en la maduracin. Todo esto provoca reducciones en las cosechas con una disminucin notoria de la calidad (Milthope. M, 1982).

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Tabla 1. Intervalos de suficiencia de la concentracin de nutrientes en tejidos vegetales.

Contenido (% en peso seco. Especie (rgano) N Trigo (toda la parte area) Maz (hoja madura) Remolacha (hoja madura) Tomate (hoja madura) Algodn (hoja madura) Alfalfa (hoja madura) Manzana (hoja madura) Naranja (hoja madura) 3-4.5 2.7-3.5 4-6 4-5.5 3.6-7 3.5-5 2.2-2.8 2.4-3.5 0,3-0,5 0,4-0.7 0.35-0,6 0.4-0.65 0.3-0.5 0.3-0.6 0,18-0,30 0.15-0,30 P 2.9-3.8 2.5-3.5 3.5-6 3.0-6.0 1.7-3.5 2.5-3.8 1.1-1.5 1.2-2.0 K

FUENTE: (Azcn V, 2003)

E.

MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FSFORO EN EL SUELO.

15

1.

Bacterias solubilizadores de fsforo.

Se establece dos tipos de bacterias que solubilizan el fsforo. Unas lo hacen a partir de formas orgnicas y las otras de formas inorgnicas. Bacillus megaterium , Bacillus mesentericus y Pseudomonas putida solubilizan las formas orgnicas del fsforo y las transforman a fosfatos asimilables por las plantas (Higuera, 2002). Formas inorgnicas son solubilizadas por bacterias de los gneros Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Aerobacter, Bacillus, Enterobacter, Erwinia, Rhizobium, y Serratia (Niklitschek, 2000).

2.

Hongos solubilizadores de fsforo.

Entre los hongos solubilizadores de ortofosfato se encuentran Penicillium implicatum, Penicillium vtreo-viridae, Paecilomyces, Aspergillus nger, Aspergillus fumigatus, Scopulariopsis, Moniliella, y Mortierella (Yerly, 2004). Por otro lado, fosfatos triclcicos son trasformados por Trichoderma aureoviride, y Aspergillus aculeatus. Finalmente, el fosfato de hierro es solubilizado por Aspergillus oryzae, Paecilomyces, Gongronella butleri, y Fusarium oxysporum. (Vera, 2002).

3.

Actinomicetes y levaduras como solubilizadores de fsforo.

Levaduras del gnero Saccharomyces y Rhodotorula son capaces de transformar fsforo orgnico (Higuera, 2002). Dentro de los actinomicetes, representantes del gnero Streptomyces han demostrado la produccin de fosfatasas, principalmente durante los procesos de descomposicin de materia orgnica.

16

F.

METODOS PARA DETERMINAR LA SOLUBILIZACIN DE FSFORO IN VITRO.

1.

Halo de solubilizacin.

Consiste en extraer de un cultivo puro, una parte de una colonia, para posteriormente colocar el inculo en cajas petri que contengan el medio propuesto (Sundara, 1963)

solubilizacin se determina estableciendo la presencia de un halo alrededor de la colonia, luego de un perodo de incubacin de 14 das a 28C. Para medir el ndice de

solubilizacin (I.S.) se procede a realizar la lectura del dimetro de la colonia y luego del dimetro del halo formado por el microorganismo para establecer mediante una frmula la eficacia relativa de solubilizacin por parte de los microorganismos estudiados (Premono et al, 1996).
Dc + Dh Dc

Eficiencia de solubilizacin =

Donde: Dc = Dimetro de la colonia (mm) Dh = Dimetro del halo de solubilizacin (mm)

2.

Mtodo de cuantificacin de actividad enzimtica.

El mtodo

cuantifica la produccin de fosfatasas producida por los microorganismos

fosfato solubilizadores. Para esto, se emplea el mtodo de p-nitrofenilfosfato, en donde el compuesto fosfatado es trasformado a orto fosfato. La concentracin del producto de la hidrlisis es proporcional a la actividad de la fosfatasa (Dik et al, 2000; Otalora, 2003).

17

17

IV.

MATERIALES Y METODOS

A.

ENSAYO PRELIMINAR.

Un ensayo preliminar se realiz para determinar la metodologa a seguir en el aislamiento selectivo de solubilizadores de fsforo a partir de muestras de suelo. Para ello se us una muestra de la coleccin de suelos del Departamento de Ciencias Biolgicas de la Facultad de Recursos Naturales. El suelo fue recolectado de la rizsfera de una plantacin de babaco. Se utiliz un medio de cultivo con glucosa y sales minerales, suplementado con una fuente

insoluble de fsforo (fosfato triclcico (Ca 3 (PO 4 ) 2 ); Anexo 1). El pH del medio de cultivo fue ajustado a 7, para finalmente proceder a esterilizar a 121C por 20 minutos. Previo al vertido del medio estril en cajas petri, se aadi nistatin a una concentracin final de 75 ug/ml, para evitar el crecimiento de hongos. El medio fue vertido en cajas petri estriles, y a la mitad de ellos se aadi prpura de bromocresol (15 ml/litro de una solucin stock al 0.04% w/v) y la otra mitad sin la adicin de ste compuesto. La adicin del prpura de bromocresol se realiz para identificar colonias que produzcan cidos orgnicos, y por lo tanto cambien el pH.

Cambios de prpura a naranja indicaron disminucin del pH debido a la protonizacin causada por la presencia de los cidos orgnicos.

La muestra de suelo fue usada para preparar diluciones seriadas. Para ello, se pesaron 10 gramos, los que fueron colocados en una botella con 90 mililitros de agua de llave estril (dilucin 1/10). La suspensin de suelo fue agitada por 45 minutos. Una vez trascurrido ste tiempo, se prepararon las diluciones hasta llegar a 1/106. Cien microlitros de las diluciones 1/102, 1/103, 1/104, 1/105, y 1/106 fueron colocados y extendidos por cuadruplicado, sobre la superficie de las cajas petri que contenan los dos tipos diferentes de medio de cultivo. Los platos se incubaron por 15 das a 25C.

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Una vez transcurrido el tiempo se conto el nmero de colonias y se determin el nmero de unidades formadoras de colonias por gramo de suelo (ufc/g), para esto se tomaron las cajas que presenten entre 30 y 300 colonias, y se calcul el valor usando la siguiente frmula: UFC/g suelo = Donde N FD Nmero de colonias. Dilucin en la cual se conto N (Ejemplo: si N se conto en la dilucin 1/1000, FD NxFDxVt VixS

=1x103) Vt Vi S Volumen de la dilucin 1/10, en mililitros. Volumen inoculado en mililitros. Cantidad de suelo utilizado para preparar la dilucin 1/10.

Se identifico tambin el nmero de colonias que fueron capaces de producir cido.

1.

Anlisis estadstico.

Se uso un diseo completamente al azar (DCA), con 4 repeticiones. Se compar los dos tipos diferentes de medios de cultivo (a1: medio de cultivo ms prpura de bromocresol; a2: medio de cultivo sin prpura de bromocresol). La variable evaluada fue el nmero de ufc/g suelo. El esquema del anlisis de varianza se presenta en la Tabla 2. En caso de existir diferencias significativas entre los tratamientos, la separacin de medias se realizo mediante la prueba de Tukey al 5% de significancia.

19

Tabla 2. Esquema del anlisis de varianza del ensayo preliminar. Fuente de variacin Tratamientos Error Total (t 1) t (r 1) (r x t) - 1 Grados de libertad 1 6 7

B.

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION PRELIMINAR DE POSIBLES BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FOSFORO

1.

Recoleccin y Caracterizacin de las Muestras de Suelo.

Las muestras fueron recolectadas de cuatro lugares diferentes de la provincia de Chimborazo, tal como se reporta en la Tabla 3. En cada sitio, con la ayuda de un barreno estril, se recolectaron los primeros 10 a 15 centmetros de suelo. Las muestras fueron trasferidas aspticamente a frascos estriles para su trasporte. Una vez en el laboratorio, se procedi a homogeneizarlas mediante el uso de un mortero y pistilo, esterilizados con alcohol al 70%. Las muestras homogeneizadas fueron almacenadas en nuevos frascos estriles hasta su utilizacin en los experimentos de aislamiento selectivo.

20

Tabla 3. Caractersticas generales de las muestras de suelo. Tratamiento A1 A2 Lugar de Recoleccin San Andrs Hacienda Tunshi Tipo de Suelo Arenoso Franco arenoso Observaciones Pastos, superficie plana. Suelo arado, rastrojo,

superficie inclinada. A3 Campus ESPOCH Arena franca Cultivo de brcoli, superficie plana. Cultivo de A4 Cai Limoso horizonte B. maz, presenta

Presencia de

cutanes. Cima de loma.

2.

Determinacin de caractersticas fsico qumicas de los suelos.

a.

pH.

Se pesaron 20 gramos de suelo, los que se colocaron en un vaso de precipitacin. Cincuenta mililitros de agua destilada fueron aadidos, para luego proceder a mezclar por cinco minutos con la ayuda de una cuchara. Finalmente las muestras fueron dejadas en reposo por media hora. Una vez transcurrido este tiempo se procedi a tomar varias lecturas con la ayuda de un pHmetro. El valor final fue el promedio de las observaciones anotadas.

21

b.

Porcentaje de humedad y materia orgnica.

Para la determinacin del porcentaje de humedad se

peso previamente una cpsula de

porcelana a la que se aadi 5 g de cada una de las muestras (Peso 1). Estas fueron colocadas posteriormente en la estufa a 105C por 24 horas. Al trmino de este tiempo se dejo enfriar y se determin el peso seco de la muestra (Peso 2). El porcentaje humedad se calcul con la siguiente frmula:

% H=

Peso 1Peso2 Peso 2

x100%

El suelo seco procedente de la estufa fue usado para determinar el contenido de materia orgnica. En un crisol se coloc una cantidad conocida de suelo seco (Peso 2). El crisol con suelo fue trasladado a una mufla y dejado all a 400C por 24 horas. Luego de transcurrido el tiempo se dejo enfriar y se calcul el peso final del suelo (Peso 3). El porcentaje de materia orgnica se determin usando la siguiente frmula:

% M.O=

Peso 2Peso3 Peso 3

x100%

3.

Determinacin de la posible poblacin Bacteriana de solubilizadores de fsforo.

Los resultados del ensayo preliminar permitieron establecer una metodologa para el aislamiento de posibles bacterias solubilizadoras de fsforo, presentes en suelos recolectados en la provincia de Chimborazo. Para ello se decidi realizar diluciones seriadas de los suelos,

22

hasta llegar a la dilucin 1/108, inocular 100 uL de las diluciones 1/104, 1/105, 1/106, 1x107, y 1x108, por cuadruplicado, en el medio de cultivo que se reporta en el Anexo 1, y sin la adicin de prpura de bromocresol. El pH del medio fue ajustado a 7, y luego de la esterilizacin a 121C, el medio fue enfriado para aadir nistatin a una concentracin final de 75 ug/ml. Los platos inoculados fueron incubados a 25C por ocho das. Transcurrido este tiempo se procedi a contar el nmero de colonias presentes en los platos de aislamiento y el nmero de colonias que presentaron solubilizacin visible del fosfato del medio de cultivo (presencia de halo). Con esos datos se calcularon el nmero de ufc/g suelo seco, para cada una de ellas, usando la frmula descrita anteriormente, tomando en cuenta el valor de humedad. Tambin se calcul el porcentaje de bacterias solubilizadoras de fsforo al dividir el nmero de colonias con halos alrededor, para el nmero total de colonias presentes en el planto, y el resultado transformado a porcentaje.

a.

Anlisis estadstico para la determinacin de la poblacin de las posibles bacterias solubilizadoras de fsforo.

Se estableci un diseo completamente al azar (DCA), con 4 repeticiones. El nico factor en estudio fue el lugar en el que las cuatro muestras de suelo fueron recolectadas en la provincia de Chimborazo (Tabla 4). Las variables evaluadas fueron el nmero de unidades formadoras de colonias por gramo de suelo (ufc/g suelo, y el % de bacterias solubilizadoras. El esquema del anlisis de varianza se presenta en la Tabla 3. Finalmente, en los casos en los que se encontr diferencias significativas entre los tratamientos, se realiz la separacin de medias mediante la prueba de Tukey al 5% de significancia.

23

Tabla 4. Esquema del anlisis de varianza para el experimento principal. Fuente de variacin Tratamientos Error Total (t 1) t (r - 1) (r x t) - 1 Grados de libertad 3 12 15

4.

Aislamiento,

purificacin

almacenamiento

de

las

posibles

Bacterias

solubilizadoras de fsforo.

a.

Aislamiento y purificacin.

Los platos que presentaron crecimiento visible y diversidad de colonias de bacterias se escogieron para proceder con el aislamiento y purificacin de las cepas. Con la ayuda de un palillo estril se tomo una colonia, para inocularla mediante estra simple en platos tetrapetri que contenan agar nutritivo (AN). Los platos fueron incubados a 28C por 72 horas.

Aquellos cultivos que estaban puros fueron repicados en estra compuesta en nuevos platos con AN estril. Aquellos que visualmente se hallaban contaminados fueron repicados hasta obtener cultivo puro

b.

Almacenamiento.

Para todas las bacterias puras, se procedi a realizar suspensiones de clulas para su conservacin a largo plazo. Para ello se procedi a transferir dos o ms colonias de bacterias

24

en cultivo puro, a un criovial que contena 750 ul de una solucin de glicerol al 20% (v/v). Finalmente, los tubos fueron colocados en un congelador a -20C para su conservacin a largo plazo.

5.

Caracterizacin microscpica de los microorganismos solubilizadores de fsforo.

a.

Caracterizacin microscpica.

Los microorganismos fueron usados para preparar muestras que se observaron bajo el microscopio. Se determin tamao y forma de la clula bacteriana, y tincin de Gram, (Anexo 2).

C.

DETERMINACIN DE LA EFICACIA DE SOLUBILIZACIN DE LAS BACTERIAS AISLADAS.

La determinacin de la eficacia de solubilizacin se realiz en el mismo medio de aislamiento usado en los experimentos anteriores (Anexo 1), el que luego de la esterilizacin fue vertido en cajas tetrapetri. En cada divisin se procedi a inocular 10 ul de la suspensin de bacterias almacenadas a -20C. Las inoculaciones se repitieron cuatro veces. Posteriormente, los platos fueron incubados a 28C por 8 das. Finalmente, luego de transcurrido el tiempo de incubacin, se procedi a medir el dimetro de la colonia y del halo de solubilizacin, en caso de existir. Con sta prueba se logr identificar microorganismos que probablemente tienen el potencial de solubilizacin de fsforo insoluble en el suelo. La eficiencia en la solubilizacin se determin mediante la siguiente frmula:

25

Eficiencia de solubilizacin =

Dimetro de la colonia(mm) + Dimetro del halo(mm) Dimetro de la colonia(mm)

1.

Anlisis estadstico de la determinacin de la eficacia de solubilizacin.

Se us un diseo completamente al azar, con cuatro repeticiones. El factor en estudio fue la eficiencia de solubilizacin del fsforo insoluble en el medio de cultivo. El esquema del anlisis de varianza se muestra en la Tabla 5. La nica variable evaluada fue el porcentaje de eficiencia de solubilizacin de fsforo, que presentaron los diferentes microorganismos que crecieron en los medios. El nmero de tratamientos se determin en funcin del nmero de microorganismos aislados y purificados. Finalmente, la separacin de medias fue realizada mediante la prueba de Tukey al 5% de significancia.

Tabla 5. Esquema del anlisis de varianza para la eficacia de solubilizacin de fsforo insoluble. Fuente de variacin Tratamientos Error Total (t 1) t (r - 1) (r x t) - 1 Grados de libertad 99 300 399

26

V.

RESULTADOS

A.

ENSAYO PRELIMINAR

El nmero de ufc/g de suelo se muestra en la Tabla 6. El anlisis de varianza

mostr

diferencias significativas entre los tratamientos (Tabla 7). El coeficiente de variacin del ensayo fue 10,60%. La separacin de medias mostr que el tratamiento a2 (medio de aislamiento sin prpura de bromocresol), permiti el crecimiento de un mayor nmero de colonias en los platos de aislamiento. En el tratamiento a1, el color del medio nunca cambi, por lo que no se pudo identificar colonias de bacterias que utilicen cidos orgnicos como posible mecanismo de solubilizacin. Debido a que en el tratamiento a2 se obtuvo un mayor nmero de colonias, y a la imposibilidad de identificar produccin de cido mediante el cambio de color del medio debido a la presencia del indicador, se procedi a usar el medio de cultivo sin prpura de bromocresol para los experimentos posteriores.

Tabla 6. Nmero de ufc/g de posibles bacterias solubilizadoras de fsforo del experimento preliminar Tratamiento a1 a2 Descripcin Medio + prpura de bromocresol Medio prpura de bromocresol ufc/g 4.1625 x 108 5.8725 x 108

27

Tabla 7. Anlisis de varianza para el nmero de ufc/g de suelo en el ensayo preliminar. Fuente de variacin

g. l

SC 5.8482 x 1016 1,6970 x 1016 7.5451x 1016

CM 5.848 x 1016 2.828 x 1015

Fc 20.678

Probabilidad 0.0039**

Tratamientos 1 Error Total 6 7

B.

CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE LAS MUESTRAS

Los resultados del contenido de humedad, materia orgnica y pH de las muestras compuestas de los suelos agrcolas se encuentran en la Tabla 8. Los valores para el contenido de humedad presentaron valores entre 6,2% en el suelo recolectado en San Andrs hasta 30,8% en Ca. Por otro lado, se determin un pH alcalino (8,68) para la muestra recolectada en la ESPOCH. Las muestras de San Andrs (6,29) y Tunshi (7,3) presentaron valores neutros, mientras que en los suelos de Ca se encontr un pH ligeramente acido, con un valor de 5,7. En lo referente a la materia orgnica, los valores en general pueden ser considerados como bajos, ya que los valores variaron entre 0.5% (San Andrs) hasta 2.25% (Ca). Tabla 8. Parmetros fsicos qumicos de las muestras de suelos. Lugar de muestreo pH Humedad% Materia orgnica (%)

San Andrs Tunshi ESPOCH Ca

6,29 7,30 8,68 5,70

6,2 9,2 9,8 30,8

0,50 1,06 0,75 2,25

28

C.

DETERMINACION DE LA POBLACIN Y PORCENTAJE DE POSIBLES

BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FOSFORO.

1.

Determinacin del nmero de unidades formadoras de colonias.

Los datos totales obtenidos en los experimentos se encuentran en el Anexo 3. En la Tabla 9 se muestran los valores del nmero de ufc/g de suelo seco, por sitio de recoleccin. Como se

puede observar en la Grafico 1, el mayor nmero de ufc/g se obtuvo en los suelos recolectados en Ca, mientras que la poblacin ms baja fue determinada para el suelo recolectado en Tunshi. Por otro lado, el anlisis de varianza del logaritmo (base 10) del nmero de ufc/g de suelo seco, mostr diferencias altamente significativas entre los tratamientos (Tabla 10). La prueba de Tukey separ las medias en dos niveles (Tabla 11), en donde el nivel mximo fue alcanzado por la poblacin encontrada en Ca con 1.63 x 108 ufc/g de suelo seco, mientras que la menor fue la de Tunshi (6.02 x 107). El coeficiente de variacin del experimento fue de 2.09%.

Tabla 9. Nmero de unidades formadoras de colonias por gramo de suelo y suelo seco (ufc/g). Tratamiento a1 a2 a3 a4 ID Lugar San Andrs Tunshi ESPOCH Ca ufc/g 8,39 x 107 5,47 x 107 8,46 x 107 1,13 x 108 Ufc/g suelo seco 8,95 x 107 6,02 x 107 9,38 x 107 1,63 x 108

29

1,80E+08

1,40E+08 1,20E+08 1,00E+08

8,95E+07

8,00E+07 6,00E+07 4,00E+07 2,00E+07 0,00E+00

San Andrs

Tunshi

6,02E+07

ESPOCH

9,38E+07

Cai

Grafico 1. Nmero de ufc/g de suelo seco por sitio de recoleccin

Tabla 10. Anlisis de varianza para el nmero de unidades formadoras de colonias de bacterias por gramo de suelo seco (ufc/g) expresados en log base 10. Fuente de variacin Tratamientos Error Total g. l 3 12 15 SC 0.380 0.207 0.587 CM 0.127 0.017 Fc Probabilidad

7.338 0.005**

1,63E+08

1,60E+08

30

Tabla 11. Separacin de medias mediante la prueba de Tukey para el nmero de ufc/g de suelo seco. Tratamiento Lugar Recoleccin A4 A1 A3 A2 2. Ca San Andrs ESPOCH Tunshi ufc/gramo de suelo seco 1,63 x 108 8,95 x 107 9,38 x 107 6,02 x 107 Rango a ab ab b

Porcentaje de solubilizadores.

El porcentaje de bacterias solubilizadoras de fsforo presente en los platos de aislamiento se muestran en la Tabla 12. El anlisis de varianza para el porcentaje de bacterias solubilizadores determin que no existen diferencias significativas entre los tratamientos (Tabla 13). El

coeficiente de variacin fue del 9,29%.

Tabla 12. Porcentajes de bacterias solubilizadoras de fsforo en los platos de aislamiento. Tratamiento Lugar Recoleccin a1 a2 a3 a4 San Andrs Tunshi ESPOCH Ca Porcentaje (%) 83,31% 76,35% 89,44% 90,07%

31

Tabla 13. Anlisis de varianza para el porcentaje de solubilizadores, en el aislamiento selectivo. Fuente de variacin Tratamientos Error Total g. l 3 12 15 SC 533.044 756.873 1289.018 CM Fc Probabilidad

177.681 2.817 0.0842 ns 63.073

D. AISLAMIENTO, PURIFICACIN Y ALMACENAMIENTO DE LAS POSIBLES BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FSFORO

A partir de los platos de aislamiento se logr aislar y purificar 126 cultivos de bacterias, las que fueron depositadas en la coleccin de cultivos del Departamento de Ciencias Biolgicas de la Facultad de Recursos Naturales de la ESPOCH, desde el cdigo DCB-1631 al DCB1756 (Anexo 4), para su almacenamiento a largo plazo. En la Grafico 2 se muestra el nmero de cultivos por sitio de recoleccin. El mayor nmero fue obtenido a partir de la muestra compuesta de suelo recolectada en Ca (42 cultivos), mientras que el nmero ms bajo de aislamientos correspondi a los suelos de la ESPOCH (17 cultivos).

32

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

42 33 34

17

San Andrs

Tunshi

ESPOCH

Cai

Grafico 2. Nmero de aislamientos por sitio de recoleccin

E.

DETERMINACION DEL INDICE DE SOLUBILIZACION DE FOSFORO

INSOLUBLE

Los dimetros de colonia y halos, as como el ndice de solubilizacin alcanzado por las bacterias se muestran en el Anexo 4. De las 126 bacterias aisladas a partir de los suelos, solo 100 mostraron crecimiento y produccin del halo de solubilizacin. La Grafico 3 muestra los resultados del nmero de bacterias solubilizadoras por sitio de recoleccin. El mayor nmero fue obtenido a partir de los suelos recolectados en Tunshi (29), seguido por San Andrs (28), Ca (27) y por ltimo la ESPOCH. Sin embargo, el mayor porcentaje de solubilizadores fue para los aislamientos obtenidos de la ESPOCH (94%), y el ms bajo fue de Ca (64%).

33

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

1 15

28

29

16 27

Nmero de no solubilizadores Nmero de solubilizadores

San Andrs

Tunshi

ESPOCH

Cai

Grafico 3. Nmero y porcentaje de bacterias solubilizadoras de fsforo por sitio de recoleccin.

Por otro lado el anlisis de varianza mostr diferencias

altamente significativas entre los

tratamientos (Tabla 14). El coeficiente de variacin fue de 10.53%. La separacin de medias mediante Tukey al 5%, permiti obtener 6 niveles de significancia (Tabla 15). La bacteria DCB-1661 fue la que present el ndice de solubilizacin ms alto (5.050), mientras que el nivel ms bajo fue calculado para la bacteria DCB-1644, con un ndice de solubilizacin de 2.003.

34

Tabla 14. Anlisis de varianza para el ndice de solubilizacin de bacterias aisladas del suelo. Fuente de variacin Tratamientos Error Total g. l 99 SC 135.350 CM 1.367 0.059 Fc Probabilidad

23.101 0.00 **

300 17.754 399 153.104

35

Tabla 15. Separacin de medias para el ndice de solubilizacion de las bacterias aisladas.
CODIGO DCB1661 DCB1648 DCB1709 DCB1739 DCB1647 DCB1653 DCB1687 DCB1659 DCB1740 DCB1690 DCB1668 DCB1634 DCB1711 DCB1707 DCB1695 DCB1708 DCB1632 DCB1691 DCB1755 DCB1645 DCB1725 DCB1719 DCB1726 DCB1754 DCB1688 DCB1649 DCB1667 DCB1700 DCB1671 DCB1724 DCB1662 DCB1638 DCB1664 DCB1696 DCB1705 DCB1704 DCB1720 DCB1733 DCB1676 DCB1702 DCB1748 DCB1655 DCB1670 DCB1694 DCB1689 DCB1657 DCB1722 DCB1735 DCB1680 DCB1640 NIVEL INDICE SOLUBILIZACION SIGNIFICANCIA 5.050 A 4.730 AB 4.213 BC 4.032 BCD 3.977 BCD 3.870 CD 3.730 CD 3.650 CD 3.240 DE 2.563 EF 2.560 EF 2.545 EF 2.428 F 2.400 F 2.360 F 2.340 F 2.338 F 2.325 F 2.300 F 2.298 F 2.270 F 2.257 F 2.250 F 2.233 F 2.205 F 2.193 F 2.183 F 2.178 F 2.162 F 2.162 F 2.150 F 2.148 F 2.145 F 2.142 F 2.142 F 2.140 F 2.140 F 2.140 F 2.138 F 2.138 F 2.138 F 2.135 F 2.125 F 2.125 F 2.120 F 2.118 F 2.118 F 2.118 F 2.117 F 2.115 F CODIGO DCB1650 DCB1631 DCB1678 DCB1717 DCB1703 DCB1665 DCB1701 DCB1749 DCB1675 DCB1693 DCB1756 DCB1732 DCB1746 DCB1658 DCB1747 DCB1753 DCB1684 DCB1673 DCB1742 DCB1738 DCB1663 DCB1681 DCB1750 DCB1651 DCB1660 DCB1654 DCB1683 DCB1639 DCB1656 DCB1686 DCB1685 DCB1697 DCB1721 DCB1646 DCB1633 DCB1741 DCB1642 DCB1712 DCB1718 DCB1744 DCB1706 DCB1714 DCB1745 DCB1752 DCB1641 DCB1643 DCB1743 DCB1698 DCB1652 DCB1644 INDICE SOLUBILIZACION 2.115 2.102 2.100 2.100 2.098 2.097 2.095 2.095 2.092 2.092 2.092 2.090 2.090 2.087 2.087 2.085 2.080 2.077 2.077 2.072 2.070 2.070 2.070 2.068 2.065 2.063 2.063 2.055 2.055 2.055 2.053 2.053 2.053 2.050 2.047 2.047 2.045 2.045 2.045 2.045 2.040 2.040 2.040 2.040 2.030 2.030 2.030 2.027 2.017 2.003 NIVEL SIGNIFICANCIA F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F

36

F.

CARACTERIZACION MICROSCOPICA DE LOS AISLAMIENTOS

De las 100 bacterias que demostraron capacidad de solubilizacin de fsforo en condiciones in vitro, ochenta presentaron una forma bacilar, mientras que 20 fueron identificadas como cocos (Grafico 4). As mismo, los resultados de la reaccin de gram determinaron que la mayora de las bacterias fueron gram positivas (95), mientras que solamente cinco fueron gram negativas. Las dimensiones de cada bacteria y datos relacionados a la caracterizacin microscpica se muestran en el Anexo 5.

4
80 70 60 50 40 30 20 10 0

76

Gram Gram +
1 19

Bacilo

Cocos

Grafico 4. Nmero de bacterias segn la forma de la clula y reaccin de Gram.

37

VI.

DISCUSION.

Las bacterias solubilizadoras de fsforo presentan caractersticas morfolgicas diversas. Pueden ser gram positivas o gram negativas, mostrar caractersticas bacilares o cocoides. Principalmente se hallan presentes en abonos y suelos ricos en materia orgnica. Estas bacterias intervienen en ciclo del fsforo, transformando formas insolubles a formas asimilables en la rizosfera. Los mecanismos relacionados a la solubilizacin estn relacionados a la produccin de cidos orgnicos y enzimas extracelulares, y a la incorporacin del fsforo en la clula bacteriana por medio de su metabolismo.

El presente estudi se enfoc a la identificacin de bacterias con posible capacidad de solubilizacin de fsforo insoluble, que posteriormente puedan ser usadas como biofertilizanrtes en agricultura. Para ese fin, se logr determinar un medio de aislamiento que permita la fcil identificacin de estas bacterias, en los mismos platos. Fundamentalmente se uso en la composicin del medio, una forma de fosfato insoluble (fsfato triclcico), el que obligatoriamente debi ser solubilizado por las bacterias para permitir su crecimiento. As mismo, en el experimento preliminar se uso prpura de bromocresol en el medio, como indicador de cambios de pH, para identificar rpidamente a aquellas bacterias que solubilicen fsforo mediante la produccin de cidos orgnicos. Sin embargo, en el procedimiento final, sta idea fue descartada, ya que no existi evidencia de cambios de pH, e incluso, la presencia del colorante impidi observar los halos de solubilizacin.

Ya en el experimento central, los nmeros de posibles bacterias solubilizadoras fueron altos, ya que en todos los suelos se encontraron poblaciones mayores a 1 x 107 ufc/g de suelo. Posiblemente la presencia de materia orgnica, y el hecho de que todos eran suelos dedicados a agricultura, con posibles adiciones de fertilizacin fosfatada, influy en ste aspecto. El pH

38

no influy en la poblacin, a pesar de existir diferencias evidentes entre los valores obtenidos de los diferentes suelos. Tambin es evidente que stas caractersticas fisicoqumicas, no influyeron en el porcentaje de solubilizadores, ya que no se encontraron diferencias estadsticas entre los suelos estudiados. En todo caso, el porcentaje de solubilizadores es alto.

Por otro lado, el ndice de solubilizacin arroj resultados interesantes, ya que 100 de los 126 aislamientos demostraron poseer mecanismos para solubilizar fsforo insoluble, lo que indica que prcticamente ms del 80% de los cultivos presentaron sta caracterstica. De stos, cinco cultivos (DCB-1661, DCB-1648, DCB-1709, DCB-1739, y DCB-1647), se ubicaron en los dos primeros niveles de significancia estadstica, por lo que deberan ser utilizados para estudios posteriores de eficiencia de solubilizacin en maceta y finalmente en campo. Tambin es posible notar que 88 cultivos se ubicaron en el ltimo nivel de significancia, lo que posiblemente nos indica la presencia de muchas bacterias solubilizadoras en el suelo, pero que no tienen una eficiencia muy grande dentro del proceso. Esto podra explicar por qu, a pesar de encontrarse una fraccin alta de solubilizadores en el suelo, no son suficiente para brindar a las plantas la provisin de fsforo necesario para su desarrollo normal. En la gran mayora de cultivos extensivos, es necesario una o varias fertilizaciones de fsforo, para evitar problemas de deficiencia.

Es evidente que ste estudio ha permitido obtener resultados alentadores relacionados a la bsqueda de bacterias eficientes en la solublizacin de fsforo. El potencial que ste tipo de bacterias poseen podra ser usado en la elaboracin de un bioproducto til para agricultura, el mismo que sera beneficioso, no solamente para los agricultores, debido a la disminucin de costos de fertilizantes, sino tambin al ambiente porque evitara la acumulacin de fertilizantes en el suelo, favoreciendo as a la conservacin del medioambiente.

VII.

CONCLUSIONES.

A.

Ciento veinte y seis bacterias fueron aisladas en cultivo puro, de las cuales solamente

100 presentaron solubilizacin del fosforo insoluble del medio de cultivo.

B.

En los cuatro suelos estudiados se encontr una poblacin relativamente alta de posibles

bacterias solubilizadoras de fsforo. La poblacin ms alta fue obtenida en Ca, mientras que Tunshi present la poblacin ms baja.

C. 5.05.

La bacteria DCB1661 present el mayor ndice de solubilizacin in vitro con un valor de

D. La mayor parte de los aislamientos presentaron forma bacilar con tincin gram positiva.

VIII. RECOMENDACIONES.

A. Realizar nuevos muestreos en zonas diferentes para ampliar la coleccin de bacterias solubilizadoras de fosfatos insolubles.

B. Probar en condiciones de campo las solubilizadora.

bacterias que mostraron mayor capacidad

C. Introducir los medios de cultivo diferenciados en los estudios microbiolgicos de suelos del departamento para establecer la diversidad microbiana que presentan.

IX. RESUMEN.

La presente investigacin propone: aislar y caracterizar bacterias solubilizadoras de fosforo a partir de cuatro suelos de la provincia de Chimborazo, se realizaron

aislamientos selectivos con la utilizacin de un medio especfico para estas bacterias, en el laboratorio de Ciencias Biolgicas de la facultad de Recursos Naturales. Se utiliz un diseo completamente al azar con cuatro repeticiones para la evaluacin del nmero de unidades formadoras de colonia por gramo de suelo que presentaron las cuatro muestras, se realiz la purificacin, almacenamiento, evaluacin del ndice de solubilizacin de las bacterias y posterior caracterizacin microscpica. Dando como resultado el aislamiento de 100 bacterias solubilizadoras de fosforo a partir de 4

muestras compuestas las que fueron purificadas y almacenadas en crio preservacin en la coleccin de microorganismos, se obtuvo tambin 6 niveles de significancia para los ndices de solubilizacion de las bacterias estudiadas, la de mayor ndice fue la bacteria 1661con 5.05. La evaluacin del nmero de ufc por gramo de suelo tuvo diferencias significativas siendo el suelo de Ca el mejor segn la prueba de Tukey. En la caracterizacin microscpica se pudo constatar la presencia mayoritaria de bacterias de forma bacilar Gram positiva. Concluyendo que en los cuatro suelos estudiados presentaron una poblacin relativamente alta de posibles bacterias solubilizadoras de fsforo. La poblacin ms alta fue obtenida en Ca. La bacteria DCB1661 present el mayor ndice de solubilizacin in vitro con un valor de 5.05. Se recomienda introducir medios de cultivo diferenciados en los estudios microbiolgicos de suelos del departamento para establecer la diversidad microbiana que presentan.

X. SUMARY.

The present investigation proposes to isolate and to characterize solubilization phosphorus bacteria from four types of lands from Chimborazo Province.

Selective isolations were done with the use of a specific way for these bacteria in the biological sciences laboratory of the natural resources faculty. A design completely at random was used with four repetitions for the evaluation of the number of colony fomer units by gran of lands that presented the four samples. The purification,storage and index avaluation were done of the bacteria solubilization and later microscopic characterization.

Giving as result the isolation of 100 solubilization phosphorus bacteria from $ compound samples, that were purified and stored in raising preservation in the collection of microorganisms; also 6 levels of significance were obtained for the

indices of solubilization of the studie bacteria, the one with greatest index was bacterium 1661 with 5,05. The evaluation of the number ufc by granm of ground had significant differences, being the ground of cai the best one according to the Tukey test. In the microscopic characterization, the majority presence of bacteria could be stated of vacillate form gram positive. It is concluded that the four studied grounds presented a relatively high population of possible solubilization phosphorus bacteria. The highest population was obtained in cai. Bacterium DCB1661 showed the greatest solubilization index in vitro with a value of 5.05. it is recommended to introduce differentiated farming means in the microbiological studies of the department lands to establish their microbial diversity.

43

XI.

BIBLIOGRAFIA

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45

21. HYLAND C. KETTERINGS Q. DEWING D. STOCKIN R. CZYMMEK K. 2005. Phosphorus basics.

46

XII.

ANEXOS

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ANEXO 1 MEDIOS DE CULTIVO

47

Tabla 1. Medio de cultivo a1 para el aislamiento selectivo de bacterias solubilizadoras de fosforo en el ensayo preliminar. Componentes del medio Glucosa Cloruro de sodio Fosfato tribsico Nitrato potasio MgSO 4 . 7H 2 O MnSO 4 . 2H 2 O Sulfato de hierro Agar
Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

Cantidad para 1Lt de medio 4gr 0,2gr 2,5gr 2gr 2,5mg 2,5mg 2,5mg 15gr

Tabla 2. Medio de cultivo a2 para el aislamiento selectivo de bacterias solubilizadoras de fosforo en el ensayo preliminar.

Componentes del medio Glucosa Cloruro de sodio Fosfato tribsico Nitrato potasio MgSO 4 . 7H 2 O MnSO 4 . 2H 2 O Sulfato de hierro Agar Purpura de bromocresol
Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011

Cantidad para 1Lt de medio 4gr 0,2gr 2,5gr 2gr 2,5mg 2,5mg 2,5mg 15gr 0,1gr

48

ANEXO 2 PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION DE GRAM.

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Procedimiento para la tincin de gram. 1. Recogemos una muestra de bacterias con un palillo estril de la caja petri de cultivo puro. 2. Colocamos el inoculo en un porta objetos y realizamos un frotis. 3. Secamos el frotis y luego fijamos la muestra pasndola por el mechero. 4. Colocamos violeta de cristal en la placa y dejamos reposar por un minuto. 5. Posteriormente se realiza un lavado con agua destilada, para luego colocar alcohol yodado en la muestra y dejamos reposar por 5 minutos. 6. Colocamos safranina por 2 minutos. 7. Transcurrido este tiempo lavamos con agua destilada y posteriormente dejamos que la placa se seque para llevarla al microscopio para su observacin. 8. Clulas con coloracin prpura fueron consideradas como gram positivas y aquellas coloreadas de rosado o rojo, como gram negativas.

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ANEXO 3 DATOS EXPERIMENTALES

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Tabla 1. Nmero de unidades formadoras de colonia por plato petri en el aislamiento selectivo.

MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES UFC. /POR PLATO PETRI. Muestra Dilucin r1 r2 r3 r4 10000 60 116 72 125 San Andrs 100000 22 36 17 23 San Andrs 10000 42 61 62 78 Tunshi 100000 25 41 37 28 Tunshi 10000 78 111 62 125 ESPOCH 100000 10 37 8 29 ESPOCH 10000 166 138 95 102 Ca 100000 26 38 21 29 Ca
Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

Tabla 2. Datos totales del aislamiento selectivo (ufc/gr de suelo). MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES UFC/gr de suelo Muestra Dilucin r1 r2 r3 r4 San Andrs 10000 5,40E+07 1,04E+08 6,48E+07 1,13E+08 San Andrs 100000 1,98E+08 3,24E+08 1,53E+08 2,07E+08 10000 3,78E+07 5,49E+07 5,58E+07 7,02E+07 Tunshi 100000 2,25E+08 3,69E+08 3,33E+08 2,52E+08 Tunshi 10000 7,02E+07 9,99E+07 5,58E+07 1,13E+08 ESPOCH 100000 9,00E+07 3,33E+08 7,20E+07 2,61E+08 ESPOCH 10000 1,49E+08 1,24E+08 8,55E+07 9,18E+07 Ca 100000 2,34E+08 3,42E+08 1,89E+08 2,61E+08 Ca
Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

52

ANEXO 4 CODIGOS DE ALMACENAMIENTO Y RESULTADOS DE SOLUBILIZACION DE LAS BACTERIAS

53

Tabla 1. Dimetro de la colonia, halo e ndice de solubilizacin. C. DIAMETRO DE LA DIAMETRO DEL INDICE DE ALMACENAMIENT COLONIA HALO DE SOLUBILIZACION. O SOLUBILIZACION R1 R2 DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB 1631 1632 1633 1634 1638 1639 1640 1641 1642 1643 1644 1645 1646 1647 1648 1649 1650 1651 1652 1653 4,5 5,3 7 8 3 3 7 8,5 3 6 R3 4,5 7,2 8,8 4 3,5 6 7 6 R4 R1 5 10 10 5 5 10 7 4 R2 5,2 10 7,2 4 3,4 6,3 7,5 5,3 8,6 R3 5,5 10 12 8 6,5 6,5 R4 5,5 11 11 7,6 6,5 7,5 R1 R2 R3 R4

2,11 1,98 2,22 2,10 2,43 2,43 2,39 2,10 1,88 1,85 2,36 2,10 2,33 2,33 3,00 2,52 2,20 1,57 2,86 1,96 2,02 2,05 2,08 2,07 1,70 1,94 2,44 2,38 2,02 2,06 2,02 2,02 2,03 1,69 2,40 2,06

6,8 3,6 7 8 6 9 6 7 5,1 8,2

5,9 6 10 5 8 16 23 8 5

10,1 11 6,1 6,1

12,5 8,2 16 23

11,5 9,5

16,5 16 23,2 23 5,1 19 9 7 4 8 12 13 6

16,5 17

16,5 16,5 2,03 2,06 2,00 2,03

23,1 23,3 23,1 23,1 2,00 2,01 2,00 2,00 7,5 9 8,5 19 27 23 6 9 17 2,47 1,83 2,76 2,13 2,06 2,08 2,00 2,06 3,75 4,00 3,78 4,38 4,83 4,97 4,29 4,83 2,20 1,85 2,63 2,09 2,07 2,06 2,13 2,20 2,01 1,71 2,42 2,13

5,1 9 18 8 6 5 7 12 13 18 8 6 6,5 8 17 13

7,5 7,5 18 8 6 19 22 23

19,5 19 24 25

23,8 23 5,5 8,5 6,5 9

5,5 6 7,5 7,5 15 13

12,1 12,1 17

13,1 13,5 13,1 13,1 2,01 2,04 2,01 2,01 17 17 16 3,91 3,83 3,83 3,91

5,5 6

5,5 16

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

54

Tabla 1. Continuacin. DCB 1654 11 DCB 1655 5,1 DCB 1656 13 DCB 1657 7 DCB 1658 6,5 DCB 1659 5 DCB 1660 6 DCB 1661 0,5 DCB 1662 5,3 DCB 1663 5 DCB 1664 6,5 DCB 1665 5,5 DCB 1667 6 DCB 1668 11 DCB 1670 4,7 DCB 1671 6,6 DCB 1673 6 DCB 1675 5 DCB 1676 5,5 DCB 1678 5,5 DCB 1680 6 DCB 1681 7 17 6 10,8 8,5 7,8 5 6 0,5 6,2 5 7,5 5,5 6 11 5,2 11 7,8 7 8 5,5 6,5 11 11 5,5 13 6,9 6,5 5 6 0,5 5,3 5 6,7 5,5 6 11 4,7 6,6 6 5 5,5 5,5 8,5 8 15 5,1 13 7 9 5 6 0,5 6 5 6,5 6,5 6 11 5 8,5 7,5 6,5 7,5 5,5 9 11 11,5 11,5 16 6 13 7,5 7,1 13 6,1 2 6 5,3 7 6 7 17 5 8,1 6,5 5,5 6,5 6 7 7,5 6 14 7,5 7,2 14 6,5 2,1 6,1 5,5 7 6,2 7,3 17,5 5 8,5 6,5 5,5 6,8 6,2 7,3 7,5 6,5 16 6 2,05 1,68 2,45 2,07 2,18 2,00 2,18 2,18 1,88 2,04 2,45 2,07 2,23 2,11 3,60 3,60 2,08 2,08 5,00 5,00 2,32 2,17 2,06 2,06 2,19 2,38 2,09 2,08 2,17 2,17 2,55 2,55 2,28 2,20 2,59 2,06 2,33 2,07 2,40 2,08 2,45 2,07 2,09 2,09 2,12 2,06 2,44 2,09

11,5 13,5 2,00 2,30 10 8 13 6,5 2 7 5,3 8 6 7 17 6 7,5 10 13 6,5 2 7 5,3 9 7 7 17 6 2,07 1,88 2,09 1,92 3,60 3,80 2,02 2,08 5,00 5,20 2,13 1,98 2,06 2,10 2,08 1,93 2,09 2,13 2,17 2,22 2,55 2,59 2,06 1,96 2,23 1,77 2,08 1,83 2,10 1,79 2,18 1,85 2,09 2,13 2,17 2,12 2,07 1,68

10,5 9 8 7 8 6 9,5 8 7 8 6 9,5

11,5 12

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

55

Tabla 1. Continuacin. DCB 1683 5,9 DCB 1684 6,5 DCB 1685 10 DCB 1686 5 DCB 1687 6 DCB 1688 7 DCB 1689 5 DCB 1690 5 DCB 1691 5 DCB 1693 9 DCB 1694 5,5 DCB 1695 5,5 DCB 1696 5 DCB 1697 9 DCB 1698 7,8 DCB 1700 8 DCB 1701 5,5 DCB 1702 10 DCB 1703 8 DCB 1704 5 DCB 1705 5 DCB 1706 5 5,9 7 12 5 6 8,5 5,5 5 5 11 5,5 5,5 6 9 10,5 8 7,5 10 10,5 5 6 5 5,9 6,5 10 5 6 7 5 5,5 5 12 5,5 5,5 5 7,5 7,8 8 6 10 8 5 5 5 5,9 8 12 5 5,5 9 5,5 5 5 13 6 5,5 6 12 10 11 5 10 11 5 6 5 6,2 7 11 5,2 15 8 5,5 8 6,5 6,5 7,2 10 5,5 15 8,5 6 8 7 6,2 7,5 6,2 8,5 2,05 2,10 2,05 2,05 2,08 2,03 2,15 2,06 2,15 2,13 2,04 2,04 3,83 4,09 2,57 2,11 2,20 2,09 2,45 2,60 2,30 2,30 2,21 2,04 2,09 2,17 2,36 2,36 2,30 2,17 2,53 2,04 2,28 2,02 2,50 2,09 2,25 2,20 2,15 2,15 2,31 2,05 2,12 2,12 2,30 2,17 2,02 2,02

11,5 13,5 2,10 1,83 5,2 17 11 6 8 6,5 5,2 17 10 6 8 6,5 2,04 2,10 3,50 3,50 2,14 2,00 2,10 2,09 2,60 2,60 2,30 2,40

10,1 11 6 7,5 5,5 7,5 8 8,5 6 6,3 7,5 6 7,3 8,2 8,5 6,3

14,5 13,5 2,12 2,00 6 7,5 6,5 7 7,5 7 2,09 2,15 2,36 2,36 2,10 2,00

11,5 12,5 1,83 1,81 10 12 7,5 10,2 2,03 1,78 12 6 2,06 2,06 2,09 1,84

11,5 11 9 5,6 5,5 5,1 9,5 6 6 5,5

11,5 11,5 2,15 2,10 10,5 11,5 2,13 1,90 5,6 6,5 5,1 5,6 7 5,1 2,12 2,20 2,10 2,00 2,02 2,10

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

56

Tabla 1. Continuacin. DCB 1707 5 DCB 1708 6 DCB 1709 6 DCB 1711 4,1 DCB 1712 6,9 DCB 1714 15 DCB 1717 6 DCB 1718 5 DCB 1719 6 DCB 1720 5 DCB 1721 4 DCB 1722 7,5 DCB 1723 5,5 DCB 1724 4,9 DCB 1725 6,5 DCB 1726 4 DCB 1732 4,6 DCB 1733 7 DCB 1735 5 DCB 1738 7 DCB 1739 7 DCB 1740 5,1 5 6 5 6,2 8,5 15 6,5 5,8 7,5 6,5 5,2 9 5,5 6,3 8,8 4 4,6 7 10,5 7 5 5,8 5 6 5,5 4,1 6,9 15 6 5 6 5 4 7,5 5,5 4,9 6,5 4 4,6 7 5,2 7 6 5,3 5 6 6 5,5 9 15 7 6 7 5,5 4 8,5 5,5 6 11 4 4,6 7 7 7 5,5 5,5 7 8 12 5,5 7 7 8,2 12,5 6 7,5 7 8 23 8 8,5 7 8 25 8 9,5 2,40 2,40 2,40 2,40 2,33 2,37 3,00 3,50 2,34 1,97 2,01 1,88 2,33 2,33 5,18 5,17 2,95 2,45 2,23 2,06 2,03 2,03 2,17 2,07 2,20 2,08 2,50 2,43 2,60 2,09 2,28 2,03 2,33 2,18 2,09 2,09 2,33 2,08 2,77 2,09 2,25 2,25 2,09 2,09 2,14 2,14 2,63 2,07 2,07 2,07 4,00 4,64 3,26 3,91

15,5 16 6,5 5,1 7 5,1 4,1 8 6 5,9 8,1 5 5 8 6 7,5 16 7 5,1 7 5,5 4,5 8 6 5,9 8,5 5 5 8 6 7,5 16

15,5 15,5 2,03 2,07 7 6 9 8 5,1 10 6 6,5 7,5 6,5 10 6 4,1 10 6 6,5 2,08 2,08 2,02 1,88 2,17 1,93 2,02 1,85 2,03 1,87 2,07 1,89 2,09 2,09 2,20 1,94 2,25 1,97 2,25 2,25 2,09 2,09 2,14 2,14 2,20 1,57 2,07 2,07 3,29 4,20 2,98 2,81

11,5 12 5 5 8 8,5 7,5 18 12 5 5 8 7,5 7,5 20 16

10,1 10,5

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

57

Tabla 1. Continuacin. DCB 1741 5,9 DCB 1742 6,5 DCB 1743 7,9 DCB 1744 5 DCB 1745 7 DCB 1746 5,5 DCB 1747 5 DCB 1748 4,5 DCB 1749 6 DCB 1750 6 DCB 1752 5 DCB 1753 7,6 DCB 1754 5,8 DCB 1755 6 DCB 1756 6 6,8 8,5 7,9 6,5 10 5,5 6,3 5,8 9,5 9 5 11 5,8 8,5 9 5,9 6,5 7,9 5 7 5,5 5 4,5 6 6 5 7,6 6 6 6 7 7 7,9 6 9 5,5 6 5 8,5 8 5 10 6 14 8 6 7,1 8,1 5,1 7,1 6 5,5 5 6,5 6,5 5,1 8,2 6 8 6,1 6,2 7,1 8,1 5,1 7,3 6 5,5 5,3 7 6,5 5,5 8,4 6,2 8 6,5 7 8,5 8,1 6,5 9,5 6 6,5 6 9 8,5 5,1 11 8 12 9 7,5 7,5 8,1 6,5 9,5 6 6,5 6 9 8,5 5,1 2,02 1,91 2,19 2,07 2,09 1,84 2,03 2,03 2,02 1,78 2,01 1,73 2,09 2,09 2,10 1,87 2,11 1,91 2,08 1,74 2,08 1,72 2,02 2,10 2,31 2,07 2,03 2,03 2,30 2,08 2,36 2,06 2,09 2,09 2,30 2,08 2,33 2,20 2,50 2,06 2,42 2,06 2,02 2,02 2,45 2,05 2,33 2,50 3,00 1,93 2,50 2,13

10,5 2,08 1,76 9 13 9 2,03 2,07 2,33 1,94 2,02 1,72

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

58

Tabla 2. Grupos de color de las colonias aisladas. N. Micelio Areo 1 Manilla Reverso colonia Manilla B1,4,10,15,18,17,13,14,16, 3,8,19,20,21,23,24 25,26,29,28,31,38,43,44,57 ,58,59,63,67,87,88, 85,94,95,108,110,117,124. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Light buff Primrose Vellum Blanco Deep cream Light brown Canary yell. Apricot Beige Biscuit Medium sea Pale cream Golden Lemon Light straw Blanco Bold yellow Dark violet Apricot Light orang. Salmon Dove grey Light buff Primrose Vellum Manilla Deep cream Light Brown Can.yellow Light orang Beige Biscuit Grey Pale cream Yellow Lemon Light Straw Deep chrome Dark Violet Apricot . Light orang. Pink Dove grey Dove grey B2,7,11,49,46,47,48. B13,76,86,102,122. B5,9,39,65,93,98,116. B22,37,82. B30,39,53,64,68,81,109. B27,40. B35,112. B32,107. B42,78,114. B41,72,83,99,125. B51,123. B90,84,75,61,55. B30,56,73,91,96,105,123. B111,79,60. B62,70,97,100,106. B71. B118,74. B6. B32,107. B33. B50,54,89,120. B103. ID del microorganismo.

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

59

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ANEXO 5 CARACTERIZACION MICROSCPICA

60 Tabla 1. Caracterizacin microscpica. CODIGO DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB 1631 1632 1633 1634 1638 1639 1640 1641 1642 1643 1644 1645 1646 1647 1648 1649 1650 1651 1652 1653 1654 1655 1656 1657 1658 1659 1660 1661 1662 1663 1664 1665 1667 1668 1670 1671 1673 1675 T. gran Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Cocos + Cocos + Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo + Bacilo + Bacilo Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + Bacilo + Largo 1,5 1 1,5 1 1,5 1 1 1 1,5 1 1 0,6 Ancho. 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,3 1 0,5 1 1 1 1,5 1,1 1 1 1 1 1 1,1 1 6 6 6 1,5 2 6 2 1,1 1,2 1,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 0,5 0,3 0,3 0,3 1 0,3 0,3 0,5 0,2 0,5 0,3 1 Diametro

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

61 Tabla 1. Continuacin DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB 1676 1678 1680 1681 1683 1684 1685 1686 1687 1688 1689 1690 1691 1693 1694 1695 1696 1697 1698 1700 1701 1702 1703 1704 1705 1706 1707 1708 1709 1711 1712 1714 1717 1718 1719 1720 1721 1722 1723 Bacilo + Cocos + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Cocos + Cocos + Cocos + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Cocos + Cocos + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Cocos + Cocos + Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + 2 1,5 1,5 1,5 0,5 0,4 1 1 1 0,4 1 1 1,1 1 1,1 0,5 0,5 0,5 1 1 1,1 0,5 1,5 1 1 1 1,2 1 1 1 1 1 1 1 1 0,5 0,1 1 0,5 0,4 0,5 0,6 0,5 0,5 0,5 0,4 1 0,4 0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1,5 1,5 1 1 0,5 0,5 0,5 1 1 0,5 1 0,5

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.

62

Tabla 1. Continuacin.

DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB DCB

1724 1725 1726 1732 1733 1735 1738 1739 1740 1741 1742 1743 1744 1745 1746 1747 1748 1749 1750 1752 1753 1754 1755 1756

Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + Cocos + Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Cocos + Bacilo + Cocos Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo + Bacilo +

1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1,5 1 1 1,5 2 1

0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0,5 0,5 0,5 0 .5 0,5 0,5 1 1 0,5 0,5 1 1 0,5

Elaborado por: Esteban Guzmn, 2011.