UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUMICA, ING. QUMICA E ING. AGROINDUSTRIAL
Departamento de Qumica Analtica

LABORATORIO DE TOXICOLOGA: BIOTOXINAS MARINAS BIOENSAYOS EN RATN

INTRODUCCION

Las biotoxinas marinas son responsables de un nmero importante de enfermedades asociadas a los productos pesqueros. Entre ellas pueden citarse: la intoxicacin paralizante por moluscos (PSP), la intoxicacin diarreica por moluscos (DSP), la intoxicacin neurotxica por moluscos (NSP), la intoxicacin amnsica por moluscos conocida tambin como intoxicacin por cido domoico (ASP), la ciguatera y la tetradotoxina. En general, estas toxinas son producidas por algas del fitoplancton (diatomeas, dinoflagelados). Los moluscos bivalvos que se alimentan por filtracin de agua, incorporan el plancton y acumulan la toxina. En el caso del caracol de mar (no es filtrador sino predador), acumula la toxina al alimentarse con bivalvos txicos. El hombre al ingerir moluscos txicos manifiesta un cuadro de intoxicacin cuya gravedad depender de la cantidad de toxina ingerida. La toxina es resistente a altas temperaturas (resiste la coccin casera), estable en medio cido (vinagre, limn), no genera inmunidad y no se conoce antdoto. Los moluscos txicos no pueden identificarse por evaluaciones organolpticas ya que la toxina no altera su color, olor ni sabor. Desde el punto de la salud pblica, la clave de la determinacin es la concentracin de toxinas en los pescados o en los mariscos. Esto requiere el muestreo y el anlisis de animales indicadores o de animales representativos. Los mejillones son con frecuencia los animales indicadores de eleccin ya que manifiestan una captacin de toxinas ms rpida, pero se puede analizar otro marisco por razn de su importancia comercial o por la especificidad de la toxina implicada. La prueba ms universal es el bioensayo del ratn y en la mayora de los casos es la nica prueba legalmente admisible para la suspensin de la captura.

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MARCO TERICO
BIOTOXINAS MARINAS Uno de los primeros casos fatales de envenenamiento tras la ingestin de mariscos contaminados con toxinas de dinoflagelados en 1793 (British Columbia). En aquel entonces, a las tribus locales de la India no se le permita consumir mariscos cuando las aguas del mar se volvan fosforescentes debido a proliferaciones de dinoflagelados, este hecho fue atribuido a la presencia de ciertas toxinas alcaloides, hoy en da denominadas toxinas paralizantes paralytic shellfish poisoning (PSP) Con la tendencia actual de consumo de productos marinos, se podran producir intoxicaciones que pueden ser leves o de mayores consecuencias. Entre los mariscos que se alimentan con algas estn los mejillones, almejas, ostiones y los peces (Colwell, 1983; Liener, 1974; Shoptaugh, et al 1981). Cabe resaltar, que se pueden presentarse otros problemas y causas como las que se presentan en el Tabla.

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Entre las contaminaciones ms importantes de alimentos de origen marino por proliferacin de algas txicas, y de humanos consumidores de los mismos, se encuentran las intoxicaciones PSP, DSP (diarrhetic shellfish poisoning o envenenamiento por toxinas diarreicas) y ASP (envenenamiento por toxinas amnsicas). INTOXICACIN PARALIZANTE (PSP) Las toxinas paralticas (PSP) son compuestos que se acumulan en los mariscos que ingieren algas productoras de estas toxinas. La ingestin de estos mariscos contaminados por acumulacin de toxinas causa, en el ser humano, la intoxicacin paraltica por mariscos. Los sntomas de PSP pueden presentarse como un entumecimiento o picazn leve hasta la parlisis respiratoria completa, que en casos fatales, ocurre entre dos y doce horas despus de la ingestin. Las toxinas PSP son un grupo de 21 tetrahidropurinas estrechamente relacionadas (ver la Figura 2.1) cuya toxicidad difiere ampliamente. La ms txica es la saxitoxina (STX), la primera toxina PSP caracterizada qumicamente. Los dinoflagelados del gnero Alexandrium de zonas de clima tropical o templado son los principales responsables de la produccin de estas toxinas. 1. PROPIEDADES QUMICAS Los compuestos txicos del grupo PSP constituyen un grupo de compuestos solubles en agua con elevado carcter polar. Las toxinas PSP constituyen un grupo de compuestos de la tetrahidropurinas estrechamente relacionados, divididos en cuatro subgrupos: I. II. III. IV. Carbamato (STX, NeoSTX y las gonyautoxinas (GNTX1-4) N-sulfo-carbamoil (GNTX5-6, C1-4) Decarbamoil (dc-) (dcSTX, dcneoSTX, dcGNTX1-4); y Compuestos de desoxidecarbamoil (do-) (doSTX, doneoSTX y doGNTX1)

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Figura: Grupo de compuestos de la tetrahidropurinas 2. MTODOS DE ANLISIS Las toxinas PSP en los mariscos constituyen un peligro potencial, tanto para el ser humano como para los animales, por lo que es necesario contar con un mtodo rpido, sensible y especfico para determinar su presencia. El bioensayo en ratn es el mtodo tradicionalmente utilizado para determinar la presencia de toxinas PSP en mariscos. Sin embargo, la polmica en torno a la utilizacin de mamferos en ensayos, sumada a los problemas y limitaciones inherentes a su realizacin, han impulsado el desarrollo de otros mtodos, que incluyen ensayos farmacolgicos, inmunoensayos, ensayos qumicos o de separacin, y bioensayos alternativos (Mons et al., 1998). 2.1 Bioensayos Bioensayo En Ratn En la actualidad, la mayora de los programas de control de la toxicidad en mariscos an utilizan el bioensayo en ratn. El procedimiento fue desarrollado hace ms de 50 aos. La Asociacin de Qumicos Analticos Oficiales (AOAC) lo refin y normaliz para contar con un mtodo rpido y

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relativamente preciso para medir el contenido de toxinas PSP totales (Hollingworth y Wekell, 1990). El procedimiento consiste en inyectar 1 ml de extracto cido del marisco a ratones de 20 gramos y registrar el tiempo transcurrido hasta la muerte del animal. Si se trata de extractos muy txicos, se diluyen de forma de asegurar que la muerte ocurra en un perodo de entre cinco y 15 minutos. La toxicidad de la muestra se expresa en unidades ratn (UR) y se calcula segn las curvas de respuesta a las dosis obtenidas con estndares de STX. Una unidad ratn es la cantidad de toxina inyectada que causa la muerte de un ratn de 20 g en 15 minutos, equivalente a 0,18 g de STX. En la mayora de los pases, las pesqueras se cierran si las concentraciones alcanzan 400 UR/100 g de marisco. El lmite de deteccin del ensayo es aproximadamente 40 g de STX/100 g de tejido de marisco, con una precisin de 15-20 por ciento. Al respecto, se determin que un elevado contenido de sal en la muestra produce interferencias al inhibir los efectos txicos (Schantz et al., 1958). La acumulacin de zinc en las ostras causa la muerte en ratones en concentraciones que no constituyen una amenaza para la salud humana (Aune et al., 1998). Los resultados de extractos muy txicos son sumamente variables (Park et al., 1986). Las dificultades prcticas que presenta este mtodo son: Es necesario contar con una colonia de ratones de entre 19 y 22 g de peso y puede ocurrir que no se disponga de suficientes ratones en pocas de control intensivo; El lmite de deteccin del ensayo vara segn la cepa; La relacin entre el tiempo hasta la muerte y la concentracin de toxinas no es lineal; La determinacin exacta del tiempo hasta la muerte es muy trabajosa; y conlleva el sacrificio de un gran nmero de animales. A pesar de las dificultades mencionadas, el ensayo se ha utilizado con un amplio espectro de moluscos y crustceos, y contina siendo el mtodo oficial en la mayora de los pases que cuentan con reglamentacin para las toxinas PSP en productos marinos. 3. ORGANISMOS FUENTE Y HBITAT Organismos fuente Las toxinas PSP se encuentran en algunos gneros de dinoflagelados y en una especie de algas verdeazuladas. Las especies del gnero Alexandrium (conocido como Gonyaulax o Protogonyaulax) identificadas como contaminantes de los mariscos son: Alexandrium tamarensis, A. minutum (syn. A. excavata), A. catenella, A. fraterculus, A. fundyense y A. cohorticula. Otras especies de dinoflagelados, que tambin se identificaron como fuente de STX son Pyrodinium bahamense y Gymnodinium catenatum (Mons et al., 1998). La toxicidad de los dinoflagelados vara segn la mezcla de derivados de STX, cuya composicin difiere segn la especie que los produce y/o la regin en que se presentan.

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS 4. PRESENCIA Y ACUMULACIN EN FRUTOS DEL MAR Incorporacin y eliminacin de las toxinas PSP en los organismos acuticos

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La filtracin transporta las clulas y los quistes de dinoflagelados al esfago y al estmago de los moluscos bivalvos. La digestin, que ocurre en el estmago y en los divertculos, es el proceso por el cual las toxinas PSP se liberan y entran a los rganos digestivos. La mezcla de toxinas que se aloja en los tejidos del marisco vara segn el tipo de marisco del que se trate, la especie y la cepa del dinoflagelado en cuestin. La concentracin de las toxinas que componen la muestra vara con el tiempo y en funcin de otros factores, como las condiciones medioambientales. El 96 por ciento de la toxicidad total se encuentra en las vsceras del mejilln que constituyen solamente el 30 por ciento del peso del tejido total. En las almejas, las toxinas se acumulan rpidamente en las vsceras, para luego disminuir gradualmente. Luego de un perodo de latencia de cuatro semanas o ms, las toxinas se detectan principalmente en el sifn, aunque pueden alojarse en otras partes del animal, y su composicin vara con el tiempo (Mons et al., 1998). Varios autores estudiaron la toxicidad de los distintos tejidos de las vieiras observando las siguientes generalidades (Shumway et al., 1988): El msculo aductor no acumula toxinas y de hecho se ha probado que inactiva las toxinas presentes. La vieira de roca, Hinnites giganteus, es una excepcin ya que las concentraciones de toxinas alcanzaron 2 000 g/100 g de tejido. Los tejidos de las glndulas digestivas, el manto, las gnadas y las branquias retienen toxinas, variando la cantidad segn el tejido y la especie. La toxicidad de los diferentes tejidos vara con la estacin. Una vez absorbidas y distribuidas, las toxinas pueden transformarse 5. MARISCOS CON TOXINAS PSP Si bien la mayora de las especies de mariscos que se alimentan por filtracin son relativamente poco sensibles a las toxinas STX, el mecanismo y la respuesta de cada una de ellas difieren. En condiciones similares parece que, en general, los mejillones, por ejemplo, acumulan ms cantidad de toxinas PSP que las ostras. Los ensayos de alimentacin en el laboratorio demostraron que los mejillones consumen rpidamente concentraciones de Alexandrium iguales o mayores que las que causan el cese del bombeo y el cierre de las ostras. Los resultados de los estudios electrofisiolgicos con nervios aislados de bivalvos de la costa atlntica muestran que los de las ostras son sensibles a las toxinas, mientras que los del mejilln son relativamente poco sensibles (Mons et al., 1998). En zonas templadas, los mariscos asociados a casos de PSP son, principalmente, los moluscos bivalvos, es decir mejillones, almejas y en menor proporcin ostras, vieiras y berberechos. El Cuadro 2.1 presenta una lista completa de los mariscos en los que se detectaron toxinas PSP

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Varios mariscos no producen toxinas, pero s son capaces de almacenarlas al ingerir dinoflagelados txicos como Gonyaulax catenella, observndose los siguientes sntomas en un corto periodo de tiempo de haber ingerido al marisco: Temblores y entumecimiento en la boca, labios, lengua, tras la ingestin de especies contaminadas con PSP, extendindose al resto de la cara y cuello. Tambin se observa la sensacin de hormigueo en los dedos, piernas y brazos seguida de dolores de cabeza y mareos. Hay una falta de coordinacin muscular, problemas respiratorios y muerte por paro respiratorio (2-12 horas) La saxitoxina da lugar a una depresin en msculo cardiaco, as como a un bloqueo fisiolgico de los canales de sodio entre las membranas nerviosas. No se conoce antdoto para la intoxicacin; las toxinas son estables al calor; ya que por ejemplo, almejas procesadas a 116C pueden retener 50% de la toxina. La principal fuente de la intoxicacin es el consumo de bivalvos incluyendo mejillones, almejas, ostras.; sin embargo, algunos otros alimentos como cangrejo y peces, pueden ser responsables tambin de ese tipo de intoxicacin. Las intoxicaciones suaves en adultos se pueden dar a dosis de toxinas PSP entre 304-4.128 g/persona, mientras que las intoxicaciones severas entre 576 y 8.272 .g. 7. PREVENCIN DE LA INTOXICACIN POR PSP DEPURACIN El objetivo de los mtodos de eliminacin de las toxinas paralticas de los mariscos contaminados es reducir a un mnimo el tiempo durante el cual dichos mariscos no pueden comercializarse. El mtodo ms obvio es transferir los mariscos a aguas sin organismos txicos permitiendo que se autodepuren. Sin embargo, este mtodo es costoso y requiere muchas horas de trabajo. Las tasas de eliminacin de toxinas varan ampliamente segn la especie permaneciendo txicas algunas de ellas incluso durante varios meses, como las Crassostrea, Plactopecten y Spisula, entre otras. En el mejilln, el tiempo necesario para eliminar las toxinas tambin es variable. En 12 das, en agua salada sin dinoflagelados, a un temperatura entre 15 y 20 C, la toxicidad del mejilln, Mitylus edulis, disminuye en un 50 por ciento. En la almeja Saxidomus giganteus, el tiempo de eliminacin de las toxinas PSP es ms prolongado. Luego de la exposicin a dinoflagelados txicos es necesario un ao, o ms, para que esta especie elimine las toxinas (Mons et al., 1998). La tasa de eliminacin vara segn la estacin y parece que temperatura del agua bajas retardan la eliminacin. Sin embargo, an no se sabe con exactitud en qu medida la temperatura del agua afecta la tasa de absorcin y eliminacin de toxinas. Esta, adems, vara en funcin del lugar en el animal donde se alojaron las toxinas (las toxinas en el tracto gastrointestinal se eliminan ms rpidamente que las toxinas alojadas en los tejidos) y de la concentracin inicial o del pico de concentracin de toxinas. Se sabe que los mejillones acumulan las toxinas PSP ms rpido que otras especies de mariscos y que las eliminan rpidamente.

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS INTOXICACIN DIARREICA (DSP)

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La primera evidencia de la presencia de este tipo de enfermedad gastrointestinal asociada con el consumo de mejillones contaminados tras la ingestin de dinoflagelados tuvo lugar en Holanda (1960). Las intoxicaciones diarreicas solan dividirse en tres grupos: cido okadaico (OA) y derivados, dinophysistoxinas, pectenotoxinas (PTX) y yessotoxinas (YTX). Si embargo, debido principalmente a que no provocan toxicidad diarreica, los grupos PTX y YTX hoy da son considerados como un grupo aparte del complejo DSP. 1. PROPIEDADES QUMICAS En un principio, este grupo estaba compuesto por el cido okadaico (OA) y la dinophysistoxina-1 (DTX-1). Un nuevo componente DSP denominado DTX-4 ha sido descubierto recientemente. Las toxinas DSP son compuestos lipdicos de cadena larga conteniendo anillos polieter cclicos. Son solubles en acetona, cloroformo, cloruro de metileno y dimetilsulfxido. 2. TOXICOLOGA En los resultados obtenidos con el bioensayo con ratones se encontr una correlacin entre toxicidad de esos compuestos en humanos y efectos en ratones. El contenido de toxina requerido para producir enfermedades en humanos fue definido mediante unidades ratn. 1 Unidad ratn (UR) se define como la cantidad de toxina requerida para causarle la muerte a un ratn de 20 g durante un periodo de 48 horas. .La cantidad de toxina necesaria para causar intoxicaciones suaves en adultos es de 12 UR. Los sntomas de DSP comienzan despus de la ingestin de OA y DTX por encima de 40-50 .g por persona (adulto). Los pacientes se recuperan despus de unos cuantos das. La toxicidad crnica (promocin de tumores, mutagnesis) no puede ser estimada todava.

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS INTOXICACIN AMNSICA (ASP)

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Fue descubierta por vez primera en (Canad) 1987, despus de un episodio serio de intoxicaciones por mariscos. El mximo responsable de la intoxicacin amnsica es el cido domoico (AD), que fue inicialmente aislado de la micro alga Chondria armata por investigadores japoneses estudiando propiedades insecticidas de extractos de algas.

1. PROPIEDADES QUMICAS El cido domoico es un compuesto de origen natural, anlogo del acido glutmico, aislado del fitoplancton marino. Es un compuesto cristalino soluble en agua con propiedades tpicas de aminocido y su estructura es dependiente del pH, pudiendo dar lugar a cinco formas protonadas. 2. TOXICOLOGA .Los efectos txicos del cido domoico se establecieron tras estudios llevados a cabo utilizando ratas o monos. Tras la inyeccin intraperitoneal en ratones, esta toxina induce una sintomatologa conocida como scratching syndrome. .De los datos obtenidos en el incidente canadiense se estima que la concentracin de cido domoico en los marisco estaba en el rango de 300-1.000 mg/g y los individuos intoxicados podran haber ingerido entre 1-2 mg/Kg de la toxina. As, el consumo de 250 g de carne de mejillones con el mximo nivel de tolerancia corresponder a la ingestin de 0,1 mg AD/Kg peso de adulto. En la mayora de los mariscos el AD se acumula en los rganos digestivos.

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS DETALLES EXPERIMENTALES

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Lavar cuidadosamente el exterior del marisco con agua dulce. Abrir cortando el musculo aductor. Se lave el interior con agua dulce para eliminar, arenas y otras sustancias extraas. Se separan las carnes de las valvas. Se recogen los 150 a 200g y se colocan en un tamiz para dejar escurrir por 5 minutos. Se procesa en una licuadora hasta consistencia homognea. Preparacin del extracto acido Se coloca 100 gramos de material bien mezclado en un recipiente resistente al calor. Se aade solucin acuosa 0.1N de HCl : 100ml Se calienta la mezcla y se hierve suavemente durante 5 minutos Se deja enfriar Se toma pH del lquido. Debe ser menor de 4.5 con papel medidor del pH. Si se necesita aumentar el pH: utilizar una solucin 0.1 NaOH gota a gota. Si se necesita disminuir el pH: utilizar una solucin 5N HCl gota a gota. Se traslada la mezcla a una probeta graduada y se completa a 200ml con H2O pura o levemente acidulada. Se agita, se coloca en tubos de centrfuga y se centrifuga a 3000 rpm durante 5 minutos. El liquido sobrante es el extracto acido. Prueba en ratones Extracto acido de mejillones PH 3-4. Unidad ratn: cantidad de toxinas para matar un ratn de 20 gramos de peso en 15 minutos estandarizacin: tiempo de muerte 5-7 minutos. Se utiliza ratones sanos, hembra de 19-21 gramos, cepa CFI. Si pesan menos de 19 o ms de 21 gramos se aplican el factor de correccin de masa del mismo (tabla de SOMMER). Va intraperitoneal: 1 ml de extracto acido. Se anota el momento de inoculacin y el tiempo de muerte (ltimo movimiento respiratorio). Si el tiempo de muerte es menor a 5 minutos de varios ratones, se diluye con solucin fisiolgica acidulada pH 3 para obtener un tiempo de 5 a 7 minutos

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