investigacin bsica. CURSO Enfermedad de Chagas en el Banco de Sangre: pasado, presente y futuro investigacin bsica. Dra. Marikena Risso Investigadora Asistente de CONICET. Laboratorio de Estructura-Funcin e Ingeniera de Protenas, Fundacin Instituto Leloir. Dra. Paula Sartor Jefa de Laboratorio. Hospital Dante Tardelli, Pampa del Indio, Chaco. Becaria Ramn Carrillo, FCEN-UBA. Un poco de historia. Un poco de historia. En 1909 el mdico brasileo Carlos Chagas describi la presencia En 1909 el mdico brasileo Carlos Chagas describi la presencia de de T. T. cruzi cruzi en heces de insectos hematfagos durante una en heces de insectos hematfagos durante una campaa de lucha contra la malaria en el estado de Minas Gerais, campaa de lucha contra la malaria en el estado de Minas Gerais, Brasil Brasil Describi el ciclo biolgico, los hospederos vertebrados y Describi el ciclo biolgico, los hospederos vertebrados y vectores del parsito as como las manifestaciones vectores del parsito as como las manifestaciones vectores del parsito as como las manifestaciones vectores del parsito as como las manifestaciones clnicas agudas de la "enfermedad de clnicas agudas de la "enfermedad de Chagas Chagas--Mazza" y su posible impacto social Mazza" y su posible impacto social Dos veces nominado para el Dos veces nominado para el Premio Nobel de Medicina Premio Nobel de Medicina UBICACIN TAXONMICA UBICACIN TAXONMICA SUBREINO SUBREINO PROTOZOA PROTOZOA PHYLUM PHYLUM SARCONAST!GOPHORA SARCONAST!GOPHORA CLASE CLASE ZOONAST!GOPHORA ZOONAST!GOPHORA ORDEN ORDEN K!NETOPLAST!DA K!NETOPLAST!DA Algunos son causantes de parasitosis humanas: Algunos son causantes de parasitosis humanas: Generalidades de los kinetoplstidos Algunos son causantes de parasitosis humanas: Algunos son causantes de parasitosis humanas: Trypanosoma Trypanosoma cruzi cruzi, , Leishmania Leishmania spp spp. y . y Tripanosomas africanos todas ellas Tripanosomas africanos todas ellas zoonosis vectoriales zoonosis vectoriales Kinetoplasto: estructura subcelular que contiene DNA mitocondrial empaquetado Frotis sangre perifrica Giemsa T. cruzi Enfermedad de Enfermedad de Chagas Chagas:: Agente causal Agente causal Trypanosoma Trypanosoma cruzi cruzi Zoonosis vectorial endmica de la Argentina y Latinoamrica Zoonosis vectorial endmica de la Argentina y Latinoamrica Tripanosomiasis americana" Tripanosomiasis americana" Hospedero intermediario: : triatomineo triatomineo (vinchuca) (vinchuca) Hospederos definitivos Hospederos definitivos:: Hombre Hombre Namiferos domsticos y silvestres Namiferos domsticos y silvestres - Diferentes estadios morfolgicos asociados a distintas etapas del ciclo de vida - Flagelo unico presente en algunos estadios - Citoesqueleto compuesto de microtubulos que van a lo largo del soma Amastigote Epimastigote Tripomastigote tripomastigote sanguineo (infectivo- transmisin vertical y transfusional) tripomastigote metaciclico (infectivo- transmisin vectorial y por alimentos) amastigotes (multiplicativo-patogenia infectivo en transplantes) epimastigote (multiplicativo) Trypanosoma cruzi: CICLO DE VIDA vias de transmisin de T. cruzi vectorial Transplacentaria (infeccin congnita) Transfusional Transfusional Transplante de rganos Uso de drogas endovenosas Oral (por ingesta de alimentos contaminados con parasitos) Accidentes de laboratorio Matriz extracelular {ME) Clula blanco Trypanosoma cruzi: interaccin con la clula husped Como se abre camino el Como se abre camino el tripomastigote tripomastigote sanguneo hacia la clula blanco? sanguneo hacia la clula blanco? Adhesin a NE: molculas parasitarias (p.ej. gp85fTransialidasa o penetrina) con afinidad por laminina, fibronectina o heparina. Hidrlisis de colagenoffibronectina de NE Segun Yoshida, 2006 Hidrlisis de colagenoffibronectina de NE por enzimas como Tc80. Adhesin a clula blanco (por ej. gp85, mucinas yfo transialidasa). Ca 2+ Ca 2+ El parasito activa oligopeptidasa B y secreta de cruzipaina: aumento del nivel de Ca2+ en la clula blanco facilitando el ingreso. Endosoma Temprano lisosoma lisosoma PIP3 actina 10-15 min 2-S horas lisosoma Invasin de clulas fagocticas y no-fagocticas. 1.Mec. no fagocticos: -Reclutamiento de lisosomas e internalizacin dependientes de Ca2+ -!nvaginacin de membranas con P!P3 y posterior reclutamiento de endosomas tempranos Trypanosoma cruzi: invasin, establecimiento y diferenciacin lisosoma Vacuola parasitfora 24 hr endosomas tempranos 2.Fagocitosis o macropinocitosis movilizacin de actina de la clula husped. El tripomastigote se rodea de lisosomas formandose la vacuola parasitofora e inicia su diferenciacin a amastigote Desintegracin de la vacuola, localizacin citoplasmatica, multiplicacin intracelular del amastigote Diferenciacin a tripomastigote y salida de clula husped. De Souza , 2010 Fases de la infeccin por T. cruzi - Formas clinicas P a r a s i t e m i a
semanas anos dcadas toda la vida Etapas de la Enfermedad de Chagas Umbral de deteccin por microscopia directa Cardiaca Digestiva Neurolgica Asintomatica > 70 Sintomatica > 30 Casos de reactivacin Etapa aguda Etapa indeterminadafcrnica FORMAS Parasitemia detectable Chagoma de inoculacin Cmo se controla la parasitemia inicial? Por qu el parsito persiste crnicamente? Diagnstico de infeccin humana crnica Mtodos serolgicos Deteccin de IgG Antgenos crudos o semi purificados Diagnstico de infeccin humana aguda Mtodos parasitolgicos Diagnstico Mtodos serolgicos: 6 a 9 meses despus del nacimiento Mezcla de antgenos recombinantes purificados 2 pruebas serolgicas Ambas reactivas Ambas no reactivas Slo1 reactiva Positivo Negativo Inconcluso 3er tcnica Diagnstico de infeccin congnita Mtodos parasitolgicos Mtodos parasitolgicos Gota fresca Microhematocrito Strout Hemocultivo Xenodiagnstico PCR Mtodos serolgicos Diagnstico - metodologia Tipo de Antgeno Principio del ensayo Lisado de epimastigotes Enzimo-inmunoensayo adsorbente Mezcla de antgenos recombinantes Lisado de epimastigotes Aglutinacin de hemates sensibilizados Aglutinacin de Partculas de Gelatina Epimastigotes enteros Inmunofluorescencia indirecta No existe mtodo de referencia No existe mtodo de referencia C|u|a derdril|ca L T C08 C|u|a ruscu|ar C|u|a p|asrl|ca Vacrlago acl|vado C|u|as elecloras C|lolox|c|dad Vuerle ce|u|ar La respuesta inmune innata y adquirida durante la infeccin por La respuesta inmune innata y adquirida durante la infeccin por T. T. cruzi cruzi cl|vac|r por PAVPs coro 0Pl, v|a TLR, 2,1 y 9 C|u|a p|asrl|ca Vacrlago acl|vado Vo|cu|as elecloras NK Vacrlago Vacrlago acl|vado 0eslrucc|r paras|lar|a RNl Vo|cu|as elecloras 0psor|zac|r y ||s|s de lr|porasl|goles y de arasl|goles ||oerados a| red|o exlerro FA8E ACU0A FA8E 6R0N|6A 0eslrucc|r paras|lar|a Sin embargo, la respuesta inmune no logra erradicar el parasito. Por qu? Vo|cu|as elecloras lg01 lg03 Junqueira C, 2010 Necanismos Necanismos de de evasin evasin de la de la respuesta respuesta inmune inmune por por T. T. cruzi cruzi Gp160 de estadio tripomastigote -RES!STENC!A AL CONPLENENTO (se une a C3b inhibiendo C3 convertasa) -CAPP!NG Evita la exposicin de anticuerpos en superficie --RECLUS!ON !NTRACELULAR Y RECLUS!ON !NTRACELULAR Y LOCAL!ZAC!ON C!TOPLASNAT!CA LOCAL!ZAC!ON C!TOPLASNAT!CA VP : naranja (Lamp1), flechas blancas. ADN (azul). A. Tripomastigotes B. Amastigotes Libres en citoplasma (sin marca, flechas negras). Dentro de vP T. cruzi libera: Tc Tox: simil C9 humana, forma canales en la pared de la vP trans-sialidasa: aumenta la inestabilidad de la pared. Microscopa confocal. -!NNUNOSUPRES!ON !L-2; !L-2Rc LT; LB inespecifica Nucinas-GP! G!PLs trans-sialidasa -APOPTOS!S DE CLULAS L!NFOC!TOS Necanismos Necanismos de de evasin evasin de la de la respuesta respuesta inmune inmune por por T. T. cruzi cruzi trans-sialidasa Mecanismo Molcula de Mecanismo Molcula de T. T. cruzi cruzi involucrada involucrada -ACT!vAC!ON POL!CLONAL de LT y LB L!NFOC!TOS molculas no definidas ETIOLOGIA DE LA ENFERMEDAD CHAGAS persistencia parasitaria persistencia parasitaria vs teora autoinmune ETIOLOGIA DE LA ENFERMEDAD CHAGAS Si: Correlacin entre persistencia parasitaria y dao en tejidos blanco en pacientes en etapa crnica. El tratamiento etiolgico retrasa la aparicin de sntomas clnicos Deteccin de parsitos en areas de tejido crnicamente inflamado mediante tcnicas de alta sensibilidad. PCR, Hibridizacin in situ. etc. Inmunoperoxidasa contra Ag de T. cruzi PCR in situ con cebadores para ADN para de T. cruzi Hematoxilina- Eosina A dcadas de la A dcadas de la primoinfeccin primoinfeccin, existe una relacin directa entre el parasito y el desarrollo , existe una relacin directa entre el parasito y el desarrollo de la de la miocardiopattia miocardiopattia chagasica chagasica? ? contra Ag de T. cruzi Corazn-granuloma con Ag de T. cruzi) Corazn-infiltrados y ADN parasitario para ADN para de T. cruzi Lannes-Vieira, 2009 Mecanismos autoinmunes descritos en Enf. de Chagas: - Nimetismo molecular - Activacin policlonal de linfocitos Algunos auto-antgenos con reaccin cruzada con antgenos de T.cruzi descritos: - Niosina B13 - Cha SAPA Teora autoinmune en Enfermedad de Teora autoinmune en Enfermedad de Chagas Chagas - Cha SAPA - Receptor beta 1 adrenergico Proteina P ribosomal Son relevantes los mecanismos autoinmunes en la fisiopatogenia? Evidencias en contra: 1. La inmunosupresin induce reactivacin de la enfermedad 2. Los autoanticuerpos estan presentes en pacientes crnicos con y sin miocardiopatia. Signo de Romaa-Mazza ENFERMEDAD DE CHAGAS ETAPA AGUDA Miocarditis aguda Miocarditis aguda Baja frecuencia ( 0,5%) mas comn en nios alta mortalidad Aneurisma apical. Dilatacin derecha de atrio y ventrculos Principales sntomas Arritmias. Tromboembolismo Insuficiencia cardaca. FORNAS CL!N!CAS: CARD!OPAT!A CHAGAS!CA atrio y ventrculos Color Atlas ofTropical Medicne and Parasitology. Peters & Giles. RX Torax normal Cardiomegalia La fisiopatologa de la miocardiopatia chagsica La fisiopatologa de la miocardiopatia chagsica crnica es multifactorial crnica es multifactorial Infeccin crnica por Infeccin crnica por T. T. cruzi cruzi (baja carga parasitaria) (baja carga parasitaria) Dao tejido nervioso Dao tejido nervioso Dao de Respuesta Respuesta inmune inmune cruzada y cruzada y dao colateral dao colateral Alteracin Alteracin microvasculatura microvasculatura !squemia del miocardio !squemia del miocardio Modificado deMarin-Neto y col., Circulation 2007. Dao de miocardio y fibrosis Arritmias Arritmias Alteracin de la Alteracin de la contractilidad contractilidad Remodelacin Remodelacin de camaras de camaras Nuerte subita Nuerte subita Dilatacin cardiaca Dilatacin cardiaca progresiva, falla cardiaca progresiva, falla cardiaca FORMA DIGESTIVA MEGAVISCERAS FORMAS CLINICAS: ME0AESOFA0O ME0ACOLOM Denervacin neurovegetativa perifrica (principalmente plexos de Auerbach). Principales sntomas: disfagia y constipacin. -Esta presentacin clinica se observa solo en determinadas regiones geograficas (Nordeste de Brasil, menos frecuente en Argentina y Chile, raro en Regin andina y centroamrica. Tratamiento Tratamiento etiolgico etiolgico de la de la infeccin infeccin causada causada por por T. T. cruzi cruzi Drogas: Benznidazol y Nifurtimox Eficacia del tratamiento depende del tiempo de evolucin de la infeccin Tiempo de Eficacia Tiempo de evolucin HACEMOS UN DESCANSO? Dra Risso:mkrisso@yahoo.com Dra Sartor: pausartor@hotmail.com