Tecnologa y Calidad de la Leche - Gua de Trabajos Prcticos 2012

REA DE TECNOLOGA Y CALIDAD DE LA LECHE

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INTRODUCCION
El anlisis de la calidad de leche cruda es una prctica cotidiana y muy utilizada en el sector lcteo. ste se realiza con diferentes objetivos como el pago al productor segn la calidad remitida, control de la materia prima que ingresa a la usina, direccionamiento de leche de diferente calidad a distintos productos, entre otros. La obtencin de resultados vlidos surge de una secuencia de pasos que se inicia con una correcta toma de muestra de leche y finaliza con la comunicacin de los resultados en tiempo y forma al usuario final.

TOMA DE MUESTRA
El muestreo de la leche constituye el primer eslabn que condiciona el logro de buenos resultados, para ello es necesario que la muestra cumpla con dos requisitos bsicos: Ser representativa del volumen total de leche de donde se extrajo. Ser conservada y acondicionada correctamente para mantener sus caractersticas originales hasta su procesamiento en el laboratorio.

EXTRACCIN DE MUESTRAS
Mtodos estndar para la toma de muestra de leche (FIL-IDF 50B 1995) EQUIPO DE MUESTREO 1. Muestreo para examen microbiolgico. Todo el equipo de muestreo deber ser estril. 2. Muestreo para anlisis qumico y/o fsico. Es deseable disponer de material esterilizado, en caso de no ser as, este deber estar limpio y seco y no deber influir en las propiedades y composicin del producto. TOMA DE MUESTRA DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS LIQUIDOS Material para la toma de muestra
Agitadores

Los agitadores (Fig. 1) para la mezcla de lquidos a granel deben tener una superficie suficiente para remover debidamente el producto sin que se produzca el batido de la materia grasa. Dadas las diversas formas y dimensiones de los recipientes, no es posible recomendar un tipo particular de agitador adaptable a todas las circunstancias; pero deber estar diseado de manera que no dae el interior de los recipientes durante la agitacin y permite para evitar fenmenos de oxidacin.

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Se puede recomendar un tipo de agitador que se adapte a tarros lecheros y un agitador conveniente para los camiones cisternas y cisternas de leche. Para mezclar el contenido de grandes recipientes se recurrir a una agitacin mecnica aire comprimido limpio. Se utilizar una presin atmosfrica y un volumen de aire mnimo para evitar fenmenos de oxidacin.

Fig. 1: Agitador utilizado previo a la toma de muestra Cucharones para toma de muestra Para la toma de muestras luego de la agitacin, se utilizan cucharones con diferente formato segn se muestra en la Fig. 2. Los mismos deben ser esterilizados con alcohol (de la misma forma que los agitadores) para no contaminar la muestra o incorporar microorganismos al recipiente donde se almacena la materia prima.

Fig. 2: Diferentes modelos de muestreadores / cucharones para la toma de muestra de leche Recipientes La capacidad del recipiente no podr ser inferior de 50 cc. La capacidad de los mismos debe ser tal que prcticamente se llenen con la muestra y permitan una buena mezcla del contenido antes del anlisis, evitando el batido durante el transporte. Especificaciones sobre los envases: Los envases y tapas debern ser de forma y material adecuado para proteger la muestra y que no causen en ella cambios que afecten el resultado de los anlisis o

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exmenes posteriores. Los materiales apropiados incluyen vidrio, algunos metales y plsticos. Si es transparente, deber ser almacenado en un lugar oscuro. Los envases y tapas debern estar limpios y secos ya sea estriles o no (dependiendo del anlisis a realizar). Los ms utilizados son envases descartables de plstico (Fig. 3).

Fig. 3: Envases plsticos ms utilizados para toma de muestra de leche fluida

TECNICAS DE TOMA DE MUESTRAS

1. De tarros Lecheros Es indispensable mezclar adecuadamente la leche de los tarros lecheros si se quiere obtener una muestra representativa. Mezclar vigorosamente aproximadamente 20 veces mediante el agitador para asegurar un reparto uniforme de la materia grasa. Cuando la leche a examinar se encuentra en ms de un recipiente, se tomar una cantidad representativa de cada uno, despus de haber mezclado su contenido, y se anotar la cantidad de leche a la que corresponde cada muestra. 2. Del tanque de fro En los tanques de fro (Fig. 4), la leche se agitar mecnicamente hasta que se obtenga una homogeneidad suficiente durante 5 minutos como mnimo. Si la cisterna est provista de un sistema de programacin peridica de agitacin, dicho tiempo ser ms corto (1 a 2 minutos). La muestra de leche se tomar de punta de manguera de descarga al camin cisterna cuando queda en el tanque de fro la mitad del volumen total de leche (fig. 4), a fin de obtener una muestra representativa.

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Fig. 4: Imagen de camin cisterna y dibujo de la toma de muestra de punta de manguera Sin embargo, puede ocurrir que la toma de muestra no coincida con la presencia del camin cisterna en el lugar, en cuyo caso debemos realizar los pasos mencionados anteriormente y tomar la misma desde la escotilla (abertura) ubicada en la parte superior del tanque de fro. (Fig. 5, derecha). Si el volumen de leche representa menos del 15% de la capacidad de la cisterna, el agitado se efectuar a mano.

Fig. 5: Tanques de fro. En la imagen de la derecha se observa la toma de muestra desde la escotilla

3. De grandes recipientes, tanques de almacenamiento, camiones cisternas En cada caso se mezclar cuidadosamente la leche antes de efectuar el muestreo, segn el mtodo apropiado, por ejemplo, agitacin mecnica, agitacin por aire comprimido limpio, agitadores. El grado de agitacin estar en funcin del tiempo que ha reposado la leche. Cuando el agitado es manual, se hacen las siguientes recomendaciones: 1. Cuando el muestreo se efecta dentro de la media hora siguiente al llenado del recipiente, se agitar vigorosamente la leche durante 5 minutos como mnimo. 2. Cuando la leche ha permanecido ms tiempo en la cisterna, se agitar como mnimo durante 15 minutos

PRESERVACION, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

La temperatura de almacenamiento deber estar comprendida entre 0-4 C. Esta deber alcanzarse tan rpidamente como sea posible antes del muestreo. Preferentemente las muestras sern enviadas al Laboratorio de ensayo dentro de las 24 horas despus del muestreo, se utilizaran conservadoras de telgopor u otro material aislante y refrigerante, acompaada por la informacin necesaria. La muestra podr ser conservada utilizando productos qumicos apropiados y autorizados, aunque esto no reemplaza la refrigeracin. El conservante qumico (Ej., azidiol, bronopol, etc.) ser provisto por el laboratorio segn el tipo de anlisis a efectuar. El laboratorio ser el encargado y

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responsable de dosificar el conservante qumico dentro del envase, si esto no es posible, la persona que lo haga deber respetar las indicaciones del laboratorio.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO

EXAMEN DEL ENVASE Se controlar la integridad y el estado de conservacin del envase y su higiene, en lo que corresponde a los envases de retorno. Adems tratndose de papel resistente, plstico, etc., interesa establecer las influencias recprocas que pueden existir entre los constituyentes del envase y del producto. HOMOGEINIZACIN DE LA MUESTRA PARA EL ANLISIS Se lleva la muestra a la temperatura del Laboratorio (20 25 C) y se homogeneiza invirtiendo repetidamente (20 - 25 veces) el recipiente o trasvasando (sin agitacin fuerte para evitar la formacin de espuma), a los efectos de distribuir bien la grasa, especialmente si no se trata de leche homogeneizada. A veces es necesario elevar la temperatura a 35 - 40C, para homogeneizar el producto y luego enfriar a la temperatura indicada precedentemente (esto no debe hacerse cuando se requieran anlisis microbiolgicos). El anlisis debe efectuarse de inmediato; en caso contrario se debe mantener la muestra en el refrigerador a una temperatura inferior a 10C o se le debe agregar algn conservante que no cause modificaciones en los datos analticos.

TODA DETERMINACIN CUANTITATIVA, DEBE SER PRECEDIDA DE UNA NUEVA HOMOGENEIZACIN.

La leche es una emulsin de grasa en forma de glbulos y es tambin una suspensin de protenas en suero formada por una solucin que contiene principalmente lactosa y sales minerales. A ello se aaden numerosos componentes en cantidades pequeas: vitaminas, enzimas, etc. La leche es un producto que se altera muy fcilmente, bajo la accin del calor numerosos microorganismos pueden multiplicarse en ella, en especial aquellos que descomponen la lactosa produciendo cido y provocando la coagulacin de una parte de la protena. Su uso para el consumo y para la industria exige medidas para prevenir la accin de los microorganismos y cortar la accin de las enzimas. Se puede definir a la LECHE como:

Es el producto ntegro y fresco del ordee completo de una o varias vacas sanas, bien alimentadas y en reposo, exento de calostro y que cumpla con las caractersticas fsicas y bacteriolgicas que se establecen.
Se observan diferencias en la composicin qumica porcentual de la leche de diferentes especies de rumiantes como se muestra en la tabla N 1

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Tabla N 1 Composicin qumica de la leche de diferentes especies de rumiantes Composicin por 100g Extracto seco Total CABRA 12,8 VACA 12,5 OVEJA 19,1 BFALA 17,8 Fuente: Alais, 1985 Materia Grasa 3,8 3,5 7,5 7,5 Protena 3,4 3,3 5,7 4,6 Lactosa 4,5 4,7 4,5 4,7 Sales 0,8 0,8 1,1 0,8

Estos valores pueden variar segn la raza, poca del ao, poca de lactancia, alimentacin, salud del animal, etc. Tenga en cuenta que cuando no se explicita de que especie se esta hablando corresponde a leche bovina. EVALUACION DEL ESTADO DE CONSERVACIN Se establecer si la leche en examen se halla alterada mediante el examen de los caracteres organolpticos, fsico-qumicos y microbiolgicos establecidos por la reglamentacin vigente. Tambin se deber tener en cuenta la contaminacin con sustancias txicas, grmenes patgenos, presencia de sustancias extraas como calostro, sangre, antibitico, medicamentos, antispticos etc. ni adulterantes similares a las de sus constituyentes: suero, almidn, colorantes entre otros. EXAMEN ORGANOLPTICO CARACTERES NORMALES

ASPECTO: lquido heterogneo (contiene componentes en suspensin, en emulsin, en suspensin coloidal y en solucin). Posee una fluidez determinada, pero menos mvil que el agua. Su aspecto suele variar con el contenido graso. COLOR: blanco opaco ligeramente amarillento, debido a la suspensin de la grasa en forma de glbulos y al caseinato de calcio en suspensin coloidal. Suele variar con el contenido de caroteno y xantofila, aunque en algunas especies como la cabra carece de pigmentos. SABOR: caracterstico suave, dbilmente azucarado con la propiedad de absorber y retener el gusto de las esencias que se hallan a su alrededor. OLOR: dbil, parecido, pero ms suave, que el de las glndulas del animal vacuno. CARACTERES ANORMALES

ASPECTO: lquido heterogneo, con caractersticas especiales: leche cuajada, grumosa, coposa, gomosa, mucosa, etc. COLOR: marcada coloracin amarilla (calostro?), rosada (sangre?), etc. SABOR: amargo (por alimentos: chamico, alcachofas, forrajes ensilados), rancio (presencia de grmenes ajenos extraos a la leche), cido (productos de fermentacin: cido lctico, ctrico, etc.). OLOR: aromtico, ftido, ptrido, rancio, agrio. Todo signo anormal observado en el examen organolptico se deber constar en el protocolo analtico.

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EXAMEN FISICO QUIMICO ACIDEZ La determinacin de la acidez tanto cualitativa como cuantitativamente es un dosaje importante para determinar la aptitud de la leche para el consumo y su industrializacin; ya que un exceso de acidez puede provocar una precipitacin de las protenas en las mquinas pasteurizadoras. La leche tiene elementos cidos como el cido carbnico, cido ctrico, cido fosfrico, casena, y componentes bsicos como el xido de sodio, potasio, calcio, etc. Normalmente la cantidad de elementos cidos y bsicos casi estn en equilibrio. De esto se deduce que cuando se toma la acidez con papel de tornasol de una reaccin anficromtica, es decir reaccin cida y bsica a la vez. Pero tomada con aparatos electrnicos vamos a encontrar que el pH tiene variaciones que van de 6,6 a 6,8. La leche fresca normal carece de cido lctico. Bajo la influencia de los grmenes que la invaden muy rpidamente, la lactosa presente se convierte en cido lctico, este cido junto con los que naturalmente tiene la leche, conforman lo que se denomina ACIDEZ. Para determinar la acidez de la leche deben pasar un par de horas, nunca recin ordeada. La acidez de la leche puede ser determinada por cuatro mtodos diferentes: 1) Prueba del alcohol 2) Prueba de la ebullicin 3) Medicin del pH: ACIDEZ ACTUAL o IONOMTRICA 4) Acidez por titulacin: ACIDEZ TOTAL o TRITRIMTRICA 1) PRUEBA DEL ALCOHOL Es una prueba de alto valor prctico, eficiente para obtener una rpida orientacin de algunas alteraciones de la leche y para prever la coagulabilidad de la misma por efecto del calor. Contribuye tambin a descubrir las leches anormales, por ej. el calostro, la leche del final del ordeo, o la leche cuyo contenido mineral se ha alterado, ya que resulta ms coagulable que la leche normal. Se emplea tambin para diferenciar leches con elevado grado de acidez, leches viejas o mal conservadas, leches viejas mezcladas con frescas, leches con desequilibrios minerales. Hay que tener en cuenta que cuando se hace esta prueba en leches de acidez normal y que no obstante precipitan, puede deberse a un exceso de calcio proveniente de la alimentacin. Principio del mtodo En esta prueba, el alcohol activa el poder precipitante del cido lctico sobre las protenas del suero (principalmente la casena), evidencindose por la presencia de grumos. Material necesario: Tubos de ensayo. Pipetas.

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Reactivos necesarios: Alcohol 68 - 70 Procedimiento: 1. Mezclar en un tubo de ensayo cantidades iguales de alcohol y leche. 2. Invertir varias veces el tubo y observar las paredes del mismo. 3. Si se observan grumos, el resultado es positivo. Estamos en presencia de leche cida. 2) PRUEBA DE LA EBULLICIN Principio del mtodo Un determinado volumen de leche se somete a altas temperaturas y se observa si hubo o no coagulacin de las protenas sobre las paredes del tubo. Material necesario Tubos de ensayo. Pipetas. Mechero. Procedimiento: 1. Colocar una muestra de leche en un tubo de ensayo. 2. Calentar a fuego directo hasta ebullicin. 3. Observar el aspecto de la leche hacindola deslizar a sta sobre las paredes del tubo, circular y longitudinalmente. 4. La coagulabilidad de la leche (precipitacin de casena) o el comienzo de su floculacin, con indicio de su elevada acidez y por lo tanto esta leche se conservar poco y no es apropiada para ser industrializada. Son leches cidas, viejas o mal conservadas. 3) DETERMINACIN DEL pH El pH normal de la leche es 6,6 - 6,8. Se lo puede determinar de varias formas: 1) Utilizando un aparato electrnico (pHmetro) o potencimetro. 2) Utilizando papeles indicadores de pH. 3) Utilizando reactivos indicadores de pH 4) DETERMINACIN DE LA ACIDEZ TITULABLE La acidez titulable de la leche es la acidez expresada convencionalmente como contenido de cido lctico y determinada mediante procedimientos normalizados. Se puede realizar a los siguientes tipos de leche: leche fresca, leche homogeneizada (pasteurizada o esterilizada), leche descremada y semidescremada. Principio del mtodo: Un volumen conocido de la muestra se titula con una solucin alcalina de concentracin determinada, con ayuda de un indicador de cambio de pH, el que indica el punto final de la titulacin, que ser aquel en el cual las cargas acidas y bsicas estn en equilibrio.

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Instrumental: Erlenmeyer de 125 ml Pipeta volumtrica de 10 ml. Bureta de 10 ml Reactivos: Solucin Dornic 0,111 N de NaHO (1 ml de esta solucin equivale a 0,01 g de cido lctico). Solucin indicadora de fenolftalena al 2% en alcohol etlico. Procedimiento: 1. Medir 10 ml de leche con pipeta volumtrica y colocarlos en un Erlenmeyer de 135 ml. 2. Aadir 3 gotas de sol. de fenolftalena al 2%. 3. Valorar con sol. 0,111 N de NaHO hasta aparicin de una dbil coloracin rosada que persista como mnimo durante 30 segundos. 4. Leer en la bureta el volumen de solucin empleada. 5. En la prctica se acostumbra a expresar la acidez en grados Dornic, se utiliza para ello la siguiente ecuacin: A= V x 10
A= acidez titulable de la leche, expresada en grados Dornic. V= volumen de la sol. NaHO empleados en la titulacin, en ml

Tambin puede expresarse como contenido en acido lctico para lo cual se utiliza la siguiente ecuacin % acido lactico= V /10

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PAGO POR CALIDAD DE LA LECHE

El sistema base de pago, incluye la calidad composicional, higinica y sanitaria, adems del volumen y la temperatura de entrega de leche.

PARMETROS QUE SE TIENEN EN CUENTA PARA LA BASE DEL PAGO: 1. CALIDAD HIGINICA
CALIDAD MICROBIOLGICA: RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS (UFC/ml) LIBRE DE CONTAMINANTES: INHIBIDORES AGUADO

2. CALIDAD SANITARIA.
RECUENTO DE CELULAS SOMTICAS/ml (RCS) SANIDAD (libre de Brucelosis y Tuberculosis)

3. CALIDAD COMPOSICIONAL
PROTEINA (%) GRASA BUTIROSA (%) VALORES ESPERADOS PARMETRO UFC/ml RCS/ml TEMPERATURA SANIDAD ANIMAL Brucelosis Tuberculosis INHIBIDORES CRIOSCOPA VALORES ESPERADOS 25.000 200.000 4-5C Libre Libre Ausencia - 0,520C

1. CALIDAD HIGINICA CALIDAD MICROBIOLGICA RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS VIABLES (UFC/ml).

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Mtodo de referencia de recuento en placa: Este mtodo se basa en la presuncin de que cada clula bacteriana puede crecer en un medio de cultivo slido formando colonias. De acuerdo con este criterio en nmero de colonias desarrolladas en un medio de cultivo slido puede corresponder al nmero de clulas bacterianas viables presentes en una cantidad determinada de muestra que haya sido inoculada. El nmero de bacterias aerobias mesfilas encontrado en los alimentos es uno de los indicadores microbianos de calidad de los mismos Este ndice no es vlido para alimentos fermentados: queso, leches fermentadas, yogur, manteca. Esta determinacin se utiliza para: Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfeccin y, averiguar la temperatura a que fueron sometidos los alimentos durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento. Tener una idea sobre la alteracin incipiente de los alimentos, de su probable vida til, de la descongelacin no controlada de los alimentos congelados o de las fallas en el mantenimiento de la temperatura de refrigeracin en los alimentos refrigerados.

Materiales: Equipamiento para mezclas: mezcladores rotativos, mixer (trabaja bajo el principio de rotacin excntrica del contenido de los tubos), frascos o botellas con capacidad suficiente para contener los 90 ml del diluyente de la dilucin inicial. Placas de Petri (100 x 15 mm). Pipetas bacteriolgicas de 1 ml, 5 ml y 10 ml. Bao de agua regulado a 44 - 46C para mantener el agar fundido. Estufa de cultivo regulada a 35 - 37C. Contador de colonias. Agar de recuento. Procedimiento: 1. Agitar la muestra invirtindola 25 veces en forma rpida de manera que los microorganismos estn uniformemente distribuidos en la misma. El intervalo entre la mezcla y la toma de porcin de muestra no debe exceder los 3 minutos Tomar 1 ml de muestra y agregarlo a 9 ml del diluyente a utilizar. El ms adecuado es la solucin de peptona 0,1%, ( se pueden utilizar otros diluyentes como: peptona/sol. salina, sol. Ringer concentrada al cuarto, sol. buffer de fosfato), 10 ml de muestra a 90 ml de diluyente 11 ml de la muestra a 99 ml de diluyente. Agitar esta primera dilucin (por ej. 25 veces durante 10 seg. ). Es as obtenida la dilucin 1/10. 2. Diluciones decimales siguientes: Transferir por medio de una nueva pipeta 1 ml de la primera dilucin a otro tubo de 9 ml de diluyente evitando el contacto de la pipeta con el diluyente. Para cada dilucin se debe usar una nueva pipeta. Mezclar cuidadosamente, aspirando 10 veces con una nueva pipeta o usando un agitador mecnico por 5 10 seg. para obtener la dilucin 1/100. Repetir las operaciones usando la dilucin 1/100 para obtener diluciones 1/1000. 1/10000, etc. hasta obtener el nmero adecuado de microorganismos. 3. Duracin del procedimiento:

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El tiempo transcurrido entre la medicin inicial de la muestra o el final de la preparacin de la sol. primaria y el mezclado de las diluciones no debe ser mayor que 15 minutos Siembra en placas de Petri: Pipetear por duplicado a placas de Petri estriles alcuotas de 1 ml a partir de dilucin 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 y 1/100000. Se sugiere esta serie de diluciones cuando no se conoce el rango aproximado del nmero de bacterias. Este proceso se realiza usando diferentes pipetas esterilizadas con las distintas diluciones. S se puede utilizar la misma pipeta estril si se trabaja de la mayor dilucin a la menor dilucin. Agregado del medio de cultivo: Licuar el agar de recuento (agar nutritivo, Plate Count) en un bao de vapor o de agua hirviente, sin exponerlo a tal calentamiento por un perodo prolongado. Templar el agar a 44 - 46C y controlar cuidadosamente la temperatura para evitar la muerte de las bacterias en la muestra diluida. Agregar rpidamente a las placas el agar licuado y templado de manera de obtener una capa de 3 4 mm de espesor. Mezclar cuidadosamente las alcuotas con el agar mediante movimientos de vaivn y de rotacin de las placas de Petri (en favor y en contra de las agujas del reloj y en cruz) con el objeto de obtener las colonias uniformemente dispersas despus de la incubacin. Para control de esterilidad, adicionar a placas de Petri, agar sin inocular y agar inoculado con el diluyente. Mantener las placas sobre una superficie horizontal y limpia hasta que el medio se solidifique, luego invertirlas y llevarlas a estufa de cultivo durante 48 3 horas. Recuento de colonias en placas: Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias. Tomar la media aritmtica de los 2 recuentos y multiplicar por el factor de dilucin (recproco de la dilucin utilizada). Informar segn el caso, el resultado como nmero de microorganismos aerobios mesfilos por ml gramo.

Ejemplo: dilucin 1/100. Placa 1: 72 colonias x 100 = 7200 y placa 2: 77 colonias x 100 = 7700 Se promedia:
(7200 7700) 7450 2

Se informa 7450 colonias /g ml

El Cdigo Alimentario Argentino en el art. 558 inciso A, establece las exigencias microbiolgicas para la leche de consumo: Leche Entera Pasteurizada, exige que el Recuento total en placa sea menor de 50.000 UFC/ml (desde abril a septiembre inclusive) y menor de 100. 000 UFC/ml (desde octubre a marzo inclusive). Resulta importante aclarar que las exigencias establecidas en el CAA para este parmetro se encuentran totalmente desfasadas de la realidad: Las Usinas consideran que una LECHE CRUDA es de buena calidad, cuando los recuentos en placa son < de 25.000 (UFC/ml). Valores entre 50.000 y 100.000 UFC/ml se los considera elevados y son castigados o no bonificados al momento del pago de leche por calidad.

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Recordar: El valor normal/ esperado para LECHE CRUDA, es de 25.000 (UFC/ml)

LIBRE DE CONTAMINANTES: DETECCION DE INHIBIDORES EN LECHE

Existen TEST cualitativos (microbiolgicos y enzimticos) listos para usar en la deteccin de sustancias inhibidoras en leche. La aplicacin de tratamientos antibiticos de enfermedades infecciosas como la mastitis en rodeos lecheros requiere respetar el perodo de retirada en leche de los animales tratados. En circunstancias normales, las vacas en tratamiento deben ser aisladas durante un cierto perodo de tiempo, antes de ser ordeadas (4-5 das aprox.) variando segn tipo de antibiticos utilizados, va y dosificacin aplicada. Si este perodo no es respetado los residuos del antibitico pasan a la leche. Las penalizaciones por deteccin positiva de antibiticos son, a menudo, severas. Los residuos de antibiticos plantean un problema importante a la industria lctea, ya que pueden inhibir los cultivos starter en la elaboracin de queso y yogur. An ms importantes y severas, son las consecuencias que afectan a la salud humana, ya que pueden causar resistencia a los antibiticos, alergias e hipersensibilidad. Alcance: Estos kits se pueden utilizar para la deteccin de residuos antimicrobianos en leche de vaca, cabra y oveja incluyendo leche cruda, leche sometida a un tratamiento trmico y leche en polvo. Fundamento: Los tubos contienen agar pre-sembrado con esporas de Bacillus stearothermophilus var. calidolactis que contiene adems un azcar fermentable (glucosa) y un indicador de pH (Prpura de Bromocresol). En ausencia de sustancias antimicrobianas en la muestra de leche la espora del bacilo germina y metaboliza el azcar. El cido lctico producido por la fermentacin de la glucosa hace virar el color violeta del indicador prpura de bromocresol a un color amarillo. Procedimiento: Agregar con una pipeta 100l de la muestra de leche directamente sobre la superficie del agar. Incubar en una estufa o en bao Mara a 64C1C durante 230 hs-3hs. La leche difunde rpidamente a travs del agar. Lectura:

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Amarillo : Negativo. Ausencia de residuos de antibiticos. Violeta : Positivo. Presencia de residuos de antibiticos. Existen tambin en el mercado otros kits basados en mtodos enzimticos.

A. DETERMINACIN DEL DESCENSO CRIOSCPICO DE LA LECHE FLUIDA.

Objetivo: Determinar el descenso crioscpico, en grados centgrados, de la leche fluida. Definicin: El descenso crioscpico de la leche es el valor, expresado en C, del descenso de la temperatura de congelacin de la misma, respecto del agua. Alcance: El mtodo es aplicable a leche cruda, pasteurizada y esterilizada; entera o parcialmente descremada. Principio del mtodo: La leche es sobreenfriada a una temperatura apropiada, para luego inducir su cristalizacin repentina por vibracin mecnica. Esto provoca que la temperatura se eleve debido al calor de fusin desprendido, hasta alcanzar un plateau, que corresponde al punto de congelacin de la muestra. El aparato se calibra con soluciones estndar que tienen un punto de congelacin conocido. Equipos y materiales de Laboratorio: 1. Criscopo automtico ADVANCED modelo 4DII calibrado contra soluciones patrn. 2. Tubos de ensayo de vidrio de 50,8 0,1 mm de alto, 16,0 0,1 mm de dimetro externo y 13,5 0,1 mm de dimetro interno. 3. Pipeta aforada de 2 ml de capacidad. Expresin de los resultados: El resultado final se expresa en C. Con 3 cifras decimales y ser el promedio de dos determinaciones. Los duplicados no deben diferir en ms de 0,002C.

El valor normal de descenso crioscpico en leche cruda es de 0,520C.

B. DETERMINACIN DE DENSIDAD EN LECHE FLUIDA

Terminologa: Densidad relativa: es la relacin entre las masas de iguales volmenes de leche y agua destilada consideradas ambas a una determinada temperatura.

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En el caso de la leche, la temperatura elegida es de 15C, ya que as lo reglamenta el Cdigo Alimentario Argentino (C.A.A.). Principio del mtodo: En esta determinacin se utiliza un densmetro de flotacin provisto de un vstago calibrado a 15C. El fundamento de su empleo est basado en una aplicacin del principio de Arqumedes. La escala cubre un rango de densidades que va desde 1,025 a 1,035 o de 1,015 a 1,040. En algunos casos las graduaciones solo indican las milsimas de la densidad relativa (los dos ltimos dgitos), debindose convertir la lectura en valores de densidad relativa mediante un sencillo procedimiento, por ejemplo, un valor ledo de 28 corresponde a una densidad relativa de 1,028. Generalmente el mismo vstago posee un termmetro que permite determinar simultneamente la temperatura de la muestra a la que se realiza la experiencia. Al valor de la densidad relativa obtenido se le efecta posteriormente la correccin por temperatura segn las tablas confeccionadas al efecto. Frecuentemente estas son provistas por el fabricante junto con el lactodensmetro. Procedimiento: 1. Llevar la muestra a una temperatura que oscile entre 10 y 20 C. Si no se puede homogeneizar, se calienta a 40C y se enfra inmediatamente a 15C. 2. Manteniendo inclinada la probeta para evitar la formacin de espuma, verter la muestra hasta llenar la probeta completamente. Debe evitarse tomar la densidad de una muestra que no haya desbordado, al introducir el lactodensmetro. 3. Sumergir suavemente el lactodensmetro hasta que est cerca de su posicin de equilibrio e imprimirle un movimiento de rotacin para impedir que se adhiera a las paredes de la probeta. 4. Esperar que quede en reposo sin rozar las paredes de la misma. 5. Leer la graduacin correspondiente en el lactodensmetro juntamente con la temperatura a que se halla la muestra. 6. Buscar en tablas el valor correspondiente a la correccin por temperatura.

El valor normal de la densidad de leche de vaca a 15C es de 1,028 a 1,034

Componentes de la leche que originan la densidad: La densidad de la leche es la consecuencia del promedio de densidad de c/u de los componentes: Agua Grasa Lactosa Protenas Minerales Slidos no grasos 1, 000 0, 930 1, 666 1, 346 5, 500 1, 616

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La grasa es la nica constituyente con menor densidad que el agua por lo tanto es el que ms influye para bajar la densidad de la leche. Productos con distinto contenido de grasa presentan las siguientes densidades: Leche descremada leche entera crema 20% crema 40% 1, 036 1, 032 1, 011 0, 933

La densidad de la leche puede variar por las siguientes causas: a) POR CAUSAS NORMALES: 1. Con la temperatura: cuando la medicin se realiza a temperatura prxima a los 29 34 C, la temperatura de fusin de la grasa vara y por supuesto su densidad que no se restablece hasta varias horas despus. 2. Con el tiempo transcurrido desde el ordee: durante las 6 horas que siguen a ste y mientras la leche se enfra, la densidad aumenta. 3. Por la composicin de la leche. 4. Por las distintas etapas del ordee: la 1 etapa por ser pobre en grasa tendr mayor densidad que al final por tener mayor porcentaje de materia grasa. b) POR ADULTERACIONES: 1. Por agregado de conservantes slidos: por ej. , el agregado de dicromato de potasio, incrementa la densidad en 0,0007 por cada gramo de slido aadido por litro de leche. 2. Por aguado. 3. Por aguado con soluciones preparadas: segn tengan stas densidades mayores, menores o iguales que las de la leche. 4. Por desnatado: como esta adulteracin obra en sentido contrario que el aguado conviene estudiarlas conjuntamente porque pueden dejar invariable la densidad. 5. Por aguado con soluciones y desnatado: variar segn la densidad de la solucin preparada. 6. Por neutralizacin: depende de la densidad de la solucin preparada. 2. CALIDAD SANITARIA RECUENTO DE CELULAS SOMTICAS/ml (RCS) A. RECUENTO MICROSCPICO DIRECTO: MTODO DE BREED

El mtodo de Breed es el mtodo de referencia para el recuento de clulas somticas .

MTODO DE BREED:

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Procedimiento: Se toman portaobjetos bien limpios y desengrasados. Se extiende sobre una cuadrcula de 1 cm de lado, 0,01 ml de la muestra (leche), bien homogeneizada. Se seca calentando suavemente el portaobjeto. Esta operacin no debe prolongarse ms de 10 minutos. Para el desengrasado se utiliza una solucin de alcohol, xilol y cido actico (60: 30:10) durante 1 minuto y para la tincin con Azul de metileno al 1%, durante 1 minuto Graduacin del campo visual: Se mide el dimetro del campo del Microscopio ptico con una escala micromtrica objetiva y luego se aplica la frmula para hallar la superficie. Teniendo en cuenta la dilucin y la superficie del cuadrado determinamos la cantidad de campos que hay, o sea El factor del Microscopio (es el nmero de campos en 1 cm, es decir 100 mm)
FM 100 mm Area del campo en mm

Determinacin del nmero total de clulas somticas: Se procede a contar las clulas somticas por campo. A mayor nmero de clulas somticas se contarn menos campos y viceversa. El recuento se hace en diagonal. Se saca el promedio:

N de clulas somticas

Total de clulas somticas Cantidadde camposcontados

N total de clulas somticas/ml = FM x N de clulas somticas promedio.

B. METODO AUTOMATIZADO (SOMACOUNT 300) El estndar especifica un mtodo para recuento de clulas somticas (RCS), tanto en leche cruda como leche qumicamente preservada usando instrumentos de recuento como FOSSOMATIC, BENTLEY. El RCS en muestras no preservadas dentro de las primeras 24 hs. posterior al ordee podr dar resultados inexactos. Definicin: Clula somtica: son aquellas clulas con una intensidad fluorescente mnimo debido al teido del ADN del ncleo de la clula. Principio del Equipo Bentley: El recuento de clulas blancas en leche se hace a travs del mtodo denominado citometra de flujo. Este instrumental Somacount 300 requiere de un colorante fluorescente Bromuro de etidio para

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teir el ncleo de las clulas somticas. Tambin es utilizado el llamado fluido de transporte el cual transporta las clulas teidas fluorescentemente a travs del flujo de leche. El equipo utiliza un sistema ptico, para detectar y contar las clulas somticas. El sistema ptico consiste de: un lser de helio nen, espejos, un tubo fotomultiplicador, lentes y filtros. Debido a la tintura fluorescente cada clula que pasa a travs de la fuente de luz produce un corto destello de luz. La luz pasa a travs de unos filtros pticos y lentes, los mismos sern convertidos en impulsos elctricos; y la computadora cuenta los pulsos elctricos que representan clulas somticas. Los resultados obtenidos se visualizan en pantalla. Por medio de una pipeta ubicada en el frente del instrumento, se extrae una muestra (3 ml) desde el vial de leche. A travs de jeringas de bombeo y vlvulas se detectan y cuentan las clulas somticas presentes en leche.

PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE (PAL) O RING TEST Tcnica estandarizada internacionalmente por la FAO- OMS Principio: La prueba del anillo detecta la presencia de anticuerpos en la leche. Estos anticuerpos reaccionan con el antgeno coloreado de Brucella: forman con l un complejo que se adhiere a la superficie de los glbulos de grasa de la leche y que asciende con ellos para formar una capa de crema coloreada. En ausencia de anticuerpos especficos, la capa de crema ser blanca y la columna de leche estar coloreada. En ausencia de anticuerpos especficos, la capa de crema ser blanca y la columna de leche estar coloreada por las clulas de brucelas teidas que contiene en suspensin. Esta prueba se emplea para diagnosticar la infeccin en rebaos. Su sensibilidad es tal que permite detectar la infeccin en la leche de una sola vaca mezclada con la de muchas vacas sanas.

Objetivo: El objetivo fundamental del empleo de esta prueba, es la de ubicar los rodeos que se infectan en un rea de lucha determinada, o mantener una vigilancia permanente sobre rodeos indemnes. Es una prueba poblacional y de aplicacin permanente, es decir que se debe aplicar cada 3 o 4 meses. Toma de muestra: a) En el campo: Tan pronto se ha llenado el tarro y antes de que la crema suba, revolver bien el contenido y tomar unos 50ml de leche. Agregar 1 ml de suspensin de formalina al 1% por cada 10 ml de leche. Las muestras, bien identificadas, se transportan refrigeradas hasta el laboratorio. b) En las plantas pasteurizadoras y lugares de acopio: Elegir los tanques del menor tamao posible, cuya procedencia pueda ser identificada. Mezclar bien la leche de cada tanque para que la crema represente un trmino medio y tomar una muestra de unos 50 ml. Agregar 1ml de suspensin de formalina al 1% por cada 10ml de leche.

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Procedimiento: 1. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). 2. Colocar 1ml de la muestra en un tubo de 12 x 75mm. 3. Agregar una gota (0.03 ml) de antgeno a cada tubo, homogeneizar varias veces , sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antgeno sobre las paredes. 4. Incubar a 37C durante una hora. 5. Lectura: NEGATIVA - : Anillo de crema blanco; columna de leche azul POSITIVA + : Anillo de crema y columna de crema del mismo color o casi igual POSITIVA ++ : Anillo de crema de color ms pronunciado que la columna de leche POSITIVA +++: Anillo de crema azul oscuro; columna de leche blanca PAL es una prueba que detecta anticuerpos contra brucela en muestras de leche; muestras que son obtenidas de algunos de la mayora de los bovinos que componen un rodeo de tambo: las hembras en lactancia, NO de la totalidad de su poblacin. Por lo tanto resulta obvio que no se expide sobre el rodeo, sino sobre una parte de ste. Precauciones:

El exceso o la escasez de crema dificulta la interpretacin de la prueba. La agitacin vigorosa, leches congeladas, o el uso de leche homogeneizada dificulta la
realizacin de la prueba.

El calentamiento de la leche interfiere con los resultados, por lo tanto la prueba no se puede
efectuar sobre leches pasteurizadas, a menos que se les agregue crema de leche sin pasteurizar o que se las diluya con leche fresca de vacas negativas. Cuando la prueba se efecta el mismo da en que se ha recolectado la leche, se pueden obtener resultados POSITIVOS FALSOS o DUDOSOS. La leche de calostro puede dar resultados FALSOS POSITIVOS. La leche de vacas con mastitis tambin puede dar FALSOS POSITIVOS o impedir la interpretacin de la prueba debido al decoloramiento del antgeno. La leche de vacas prximas a secarse puede dar resultados DUDOSOS o FALSOS POSITIVOS. Hay vacas infectadas con brucelas que no eliminan anticuerpos por leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo.

3. CALIDAD COMPOSICIONAL DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE MATERIA GRASA

El mtodo de referencia en lcteos para determinar el tenor graso es el Mtodo de Rosse y Gottlieb. A. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE MATERIA GRASA POR BUTIROMETRIA: Mtodo Gerber para anlisis de rutina. Definicin:

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Se define como materia grasa en leche fluida a las sustancias extradas segn el procedimiento que se describe a continuacin. Este mtodo es un procedimiento emprico por el cual se obtiene un valor de materia grasa, expresado en gramos de grasa por cien gramos de leche o en gramos de grasa por cien mililitros de leche, segn la capacidad de la pipeta utilizada. Principio del mtodo: Disolucin en cido sulfrico de todas las sustancias (hidroliza las protenas y los fosfatos) excepto la materia grasa que no es capaz de mantenerse en estado de emulsin y sube libremente por diferencia de densidad. El alcohol amlico impide la formacin de espuma y consigue que la separacin de la columna butirosa sea ms ntida. La centrifugacin y el calentamiento contribuyen a que el ascenso de la materia grasa sea ms rpido y completo. El contenido de materia grasa se determina por lectura directa en el butirmetro, existiendo diferentes tipos segn sea para leche fluida o para otros productos lcteos como crema o quesos (Fig. 6 y 7).

Fig. 6: Butirmetro de leche

Fig. 7: Butirmetro para crema/quesos

Equipos y material de laboratorio Butirmetros para leche.

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Pipeta automtica de 10 ml. Pipeta automtica de 1 ml. Pipeta para leche aforada, de 10,75 ml para obtener resultados en gramos por cien gramos de muestra o de 11 ml para obtener resultados en gramos por cien ml de muestra. Centrfuga para anlisis Gerber con velocidad entre 1000 y 1200 r. p. m. Bao de agua, con regulador de temperatura, ajustado a 65 2C y de forma tal que los butirmetros puedan ser mantenidos en posicin vertical, con sus escalas completas sumergidas.

Reactivos cido sulfrico para anlisis de leche, densidad 1820 - 1825 g/l a 15C. Alcohol amlico. Preparacin de la muestra Se ajusta la temperatura de la muestra entre 20 y 30C y luego se mezcla invirtiendo suavemente varias veces el recipiente, evitando la formacin de espuma. Si hay dificultad en dispersar la grasa se calienta la leche entre 30 y 40C en bao de agua y se mezcla suavemente. Si efectuado el procedimiento anteriormente indicado la grasa no se dispersa se debe descartar la muestra. Si se trata de una muestra que contiene sustancias conservadoras se requiere un calentamiento lento entre 35 y 40 C. Cuando se ha alcanzado una distribucin uniforme de la grasa, se ajusta rpidamente la temperatura aproximadamente 20 C y se deja reposar de 3 a 4 minutos para permitir que las burbujas de aire suban a la superficie del lquido. Procedimiento 1. Se miden 10 ml de cido sulfrico para anlisis de leche y se colocan en el butirmetro de tal manera que el cido no moje el cuello del butirmetro o queden burbujas de aire. 2. Se invierte, suavemente 3 4 veces, el recipiente que tiene la muestra preparada y se mide inmediatamente con la pipeta el volumen de leche requerida. 3. Se debe introducir la pipeta en la muestra, aspirar hasta su enrase y descargar la leche de manera tal que se forme una capa sobre la superficie del cido, evitando que se mezclen. 4. Verter sobre la leche 1 ml de alcohol amlico en el butirmetro con leche evitando mojar el cuello del butirmetro con alcohol. 5. Tapar hermticamente el butirmetro con tapn de caucho. 6. Agitar e invertir el butirmetro hasta que su contenido est perfectamente mezclados y los cogulos de casena se hayan disuelto, lo cual se comprobar por ausencia de partculas blancas. 7. Se coloca el butirmetro en un bao de agua a 65C entre 10 y 15 minutos con el tapn hacia abajo y manteniendo la columna de grasa totalmente sumergida. 8. Inmediatamente despus se coloca el butirmetro en la centrfuga con el tapn colocado hacia afuera a una velocidad de funcionamiento de 1200 r. p. m. durante 5 minutos .

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9. Retirar el butirmetro de la centrfuga y colocarlo en el bao de agua durante 3 minutos como mnimo y 10 minutos como mximo. El nivel del agua debe estar por encima de la parte superior de la escala. 10. Retirar el butirmetro del bao de agua y ajustar cuidadosamente el tapn para leer directamente en la escala el porcentaje de materia grasa. En el butirmetro para leche cada una de las divisiones grandes representa 1 g% de materia grasa, y las divisiones pequeas 0,1 g% de materia grasa. B. DETERMINACIN DE MATERIA GRASA POR UN MTODO INSTRUMENTAL MILKO-TESTER MINOR Introduccin: El siguiente procedimiento para la determinacin del porcentaje de materia grasa en leche, utiliza un analizador Milko-Tester Minor, el cual mide la dispersin de la luz en la leche, que es proporcional a la cantidad de glbulos de grasa presentes. Este procedimiento describe un mtodo rpido para la determinacin de materia grasa en leche. Principio: Se diluye la muestra en una solucin de EDTA para eliminar la interferencia que producen las micelas de casena y se homogeneiza la mezcla par uniformar el tamao del glbulo graso. Se mide luego la dispersin de la luz provocada por el pasaje de la misma a travs de la muestra. EL PORCENTAJE DE MATERIA GRASA PUEDE VARIAR POR: A) CAUSAS NORMALES: Con un animal bien alimentado y sano. Con los distintos ordees: mayor porcentaje a la tarde que a la maana. Con la cantidad de leche producida. Con el mes de lactacin. Con el cambio de rgimen alimenticio. Con las estaciones: mnimo en primavera y comienzos del verano y mximo en el invierno. Con el calor: desciende la cantidad de leche y el % de grasa. Con el tiempo transcurrido entre ordees. Con las partes del ordee: en el ordee de 5 minutos el 1 minutos tendr menor riqueza que el ltimo.

B) POR ADULTERACIONES: Aguado agregado de soluciones: rebajan todos los componentes de la leche. Desnatado.

DETERMINACIN DE SLIDOS TOTALES EN LECHE FLUIDA

Objeto:

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Esta norma tiene por objeto establecer el mtodo para determinar los slidos totales y libres de materia grasa en leche. Terminologa: Slidos totales de la leche es el residuo comprendido principalmente por compuestos nitrogenados, materia grasa, hidratos de carbono y sales minerales. Expresado en por ciento ponderal obtenido despus del proceso de desecacin segn el mtodo que se describe a continuacin: Fundamento del mtodo: Una cantidad conocida de la muestra se deseca mediante evaporacin en estufa, utilizando arena hasta constancia de masa. Procedimiento: 1. Colocar una varilla corta de vidrio y la cantidad de arena suficiente (20 g aproximadamente ) en una cpsula. 2. Secar el conjunto en estufa a 102 1C hasta que dos pesadas sucesivas no difieran entre s en ms de 0, 1 mg. 3. Se pesan aproximadamente 10 g de muestra con una exactitud de 0,5 mg en la cpsula, se homogeneiza con la arena, utilizando para ello la varilla de vidrio. 4. Se coloca la cpsula a Bao Mara a ebullicin durante el tiempo necesario para que la muestra se seque parcialmente, lo cual insume aproximadamente 20 minutos. 5. Se coloca la cpsula en la estufa a 102 1C y se calienta durante 90 minutos. 6. Dejar enfriar la cpsula (con los slidos totales) en el desecador y pesar con aproximacin de 0,1 mg. 7. repetir el calentamiento por perodos de 30 minutos, enfriando y pesando hasta que dos pesadas sucesivas no difieran entre s en ms de 1 mg, o bien hasta que se observe un aumento de masas en cuyo caso debe tenerse en cuenta en valor anterior. Clculo: El contenido de slidos totales se calcula de la siguiente forma:
S m1 m 100 m2 m

Siendo: S= contenido de slidos totales en % de masa. m= masa de la cpsula vaca en g. m2= masa de la muestra antes de la desecacin en g. m1= masa de la muestra luego de la desecacin, en g. El contenido de slidos libre de materia grasa, se calcula con la siguiente frmula:
SNG ST MG

SNG= slidos no grasos, en % en masa. ST= contenido de slidos totales, en % en masa. MG= contenido de materia grasa determinado por el mtodo butiromtrico, en % en masa.

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Observaciones generales: Es importante que las cpsulas tanto vacas como con muestra estn perfectamente fras antes de proceder a su peso, para evitar cometer as errores de pesada. No debe quedar lquido sobrenadante al colocar la muestra en la cpsula. La temperatura del B. M. debe ser superior a 92C porque la lactosa puede cristalizar a una temperatura inferior como lactosa hidratada ocluyendo agua de difcil evaporacin. Durante esta etapa debe evitarse la formacin de nata cogulos que puedan retener humedad. El control de la temperatura y del tiempo de permanencia de la muestra en la estufa, son de suma importancia en el desarrollo correcto de este anlisis.

Valor normal = 8, 5 a 9 g %. Las variaciones del extracto seco se deben a: 1) Causas normales: Por alimentacin del animal. Enfermedades de los animales, normalmente las vacas enfermas dan siempre valores mnimos. Si la leche es muy rica en grasa puede parecer aguada por su ESD ya que ste es muy bajo. 2) Adulteraciones: El aguado lo rebaja. El agregado de soluciones preparadas. El desnatado lo rebaja.

Valor normal /esperado: Slidos no grasos: 8,5 -9 g%

Valor normal /esperado: Slidos totales: 11,5 -12 g%

DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES

Definicin Se entiende por contenido de protenas totales, al resultante de multiplicar el porciento de nitrgeno determinado por el procedimiento que se describe a continuacin por el factor 6,38. Principio La determinacin se efecta por el mtodo Kjeldhal. Se mineraliza la muestra con cido sulfrico y un catalizador, para transformar el nitrgeno de la misma, en nitrgeno amoniacal. El amoniaco es posteriormente liberado en medio alcalino (con hidrxido de sodio) y valorado.

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mbito de aplicacin Este mtodo de referencia, es de aplicacin en leche y productos lcteos, que no contengan ms sustancias nitrogenadas, que aquellas presentes normalmente en la leche.