Microbiologa de los alimentos y piensos - Mtodo horizontal para la deteccin de Shigella spp.

ADVERTENCIA - A fin de salvaguardar la salud del personal de laboratorio, es esencial que el conjunto de este mtodo slo se lleva a cabo por personal calificado con buenas prcticas de laboratorio y de preferencia que trabajan en una instalacin de contencin. Los reglamentos nacionales pertinentes sobre Salud y Seguridad en relacin con este organismo se cumplen. Se debe tener cuidado en la eliminacin de todos los materiales infecciosos. 1 mbito de aplicacin Esta norma internacional especifica un mtodo horizontal para la deteccin de especies de Shigella. Sujeto a las limitaciones descritas en la introduccin, esta Norma Internacional es aplicable a los productos destinados al consumo humano y la alimentacin de los animales, y muestras ambientales en el rea de la produccin de alimentos y manipulacin de alimentos. 2 Referencias normativas Los documentos de referencia siguientes son indispensables para la aplicacin de este documento. Para las referencias fechadas, slo se aplica la edicin citada. Para las referencias sin fecha, la ltima edicin del documento referenciado (incluyendo cualquier modificacin). 3 Trminos y definiciones Para los propsitos de este documento, los trminos y definiciones siguientes. 3,1 por Shigella los microorganismos que forman colonias se ajustan a la descripcin de estas especies en los medios slidos selectivos utilizados, y que muestran las caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas cuando las pruebas se llevan a cabo de conformidad con esta Norma Internacional 3.2 la deteccin de Shigella spp. determinacin de la presencia o ausencia de estos microorganismos en una masa de producto en particular, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con esta norma internacional 4 Principie 4.1 General La deteccin de Shigella requiere cuatro etapas sucesivas (ver Anexo A).

4,2 Enriquecimiento en medio lquido selectivo Una prueba de Portio n se inocul en caldo de Shigella que contiene 0,5 g / ml de novobiocina, a continuacin, se incub anaerbicamente a (41,5 1) C durante 16 ha 20 h. 4,3 Revestimiento a cabo y la identificacin de colonias Desde el cultivo de enriquecimiento obtenido, tres medios diferenciales selectivos se inoculan: agar MacConkey con baja selectividad; agar XLD con selectividad moderada y Hektoen agar entrico con la mayor selectividad. AII se incuban a 37 C durante 20 h a 24 h. 4.4 La confirmacin bioqumica y serolgica Las colonias tpicas y sospechoso se seleccionan de cada uno de los tres agares selectivos. Las colonias se purificaron en agar nutritivo, a continuacin, las caracterizaciones bioqumicas y serolgicas se llevan a cabo utilizando las pruebas descritas. 5 Medios de cultivo, reactivos y antisueros Para las prcticas de laboratorio actuales, vase la norma ISO 7218, ISOITS 11133-1 y 11133-2 ISOItS para la prueba de preparacin, produccin y realizacin de medios de cultivo. Utilice nicamente reactivos de grado analtico reconocido, a menos que se especifique lo contrario, y el agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente. Vase el Anexo B para una descripcin de todos los medios de comunicacin, los reactivos y antisueros. Medios deshidratados disponibles en el mercado deben dar resultados ms consistentes que los medios de comunicacin preparados a partir de sus componentes en el laboratorio. Siga las instrucciones del fabricante con exactitud, ya que los cambios en la preparacin de 05mall puede cambiar significativamente el rendimiento de los medios selectivos. Un calentamiento excesivo de los agares selectivos utilizados en esta Norma Internacional por autoclave, almacenamiento y re-calentamiento para su uso puede resultar en la prdida de la selectividad. 6 Aparatos y artculos de vidrio El equipo desechable es una alternativa aceptable para reutilizable de vidrio si tiene las especificaciones adecuadas. Equipo habitual microbiologicallaboratory (vase la norma ISO 7218) y, en particular, de lo siguiente. 6.1 Aparatos para la esterilizacin en seco (horno) y esterilizacin en hmedo (autoclave) de los equipos.

Segn la norma ISO 7218. 6,2 estufa de secado o en el horno y ventilado por conveccin, y capaces de funcionar a una temperatura de ajuste entre 37 oC y 55 oC. 6.3 Incubadoras, capaces de operar a (37 1 oC) y oC (41,5 1). 6.4 Modificados frascos ambiente o los gabinetes de incubacin anaerbica, y aparatos relacionados para lograr condiciones anaerbicas, con un gas de composicin de Oz <1% y 9% a 13% Caz. Segn la norma ISO 7218. 6.5 baos de agua, operando a una temperatura fijada de (47 3) oC, para el enfriamiento de los medios fundidos antes placa de vertido, y otro conjunto en (50 1) C (ver B 6.3.2 y B 10.2.2). 6,6 homogeneizador peristltico (Stomacher) o en la licuadora rotativo. Segn la norma ISO 7218. 6.7 agujas de inoculacin y bucles, de platino / iridio o nquel / cromo, de un dimetro aproximado de 3 mm, de plstico o de bucles y agujas desechables de las especificaciones adecuadas. 6.8 pH-metro, con una exactitud de la calibracin de la unidad de pH 0,1 a 25 oC. 6.9 Frascos y botellas, con c1osures, de capacidades adecuadas para su uso en la preparacin de caldos de enriquecimiento y agares y su almacenamiento. 6.10 cilindros de medicin. 6.11 Tubos de 18 mm de dimetro y 160 mm de longitud (conectado o con tapones de rosca), o frascos de cultivo, de la capacidad nominal de 30 millas y millas 10, con productos no txicos tapas metlicas con camisas o gorras de plstico desechables. 6.12 placas de Petri, de dimetro entre 90 mm a 100 mm y 140 mm de dimetro. 6.13 portaobjetos de vidrio o placas, adecuados para su uso en ensayos de aglutinacin. 7 Muestreo

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativo y no ha sido daado o cambiado durante el trnsito o almacenamiento. . El muestreo no es parte del mtodo especificado en esta Sta. Internacional ~ d ~ r. Vase la Norma Internacional especfica tratar con el producto en cuestin. Si no hay una norma internacional especfica, se recomienda que el contratista cerned partes lleguen a un acuerdo sobre este tema.

8 Preparacin de la muestra de prueba Preparar la muestra de ensayo de conformidad con la parte correspondiente de la Norma ISO 6887 y / o ISO 8261. Anlisis de las muestras debe comenzar tan pronto como sea posible, como la supervivencia de Shigella es pobre. 9 Procedimiento (vase el diagrama en el anexo A) 9.1 Prueba de la parte Ver la parte correspondiente de la Norma ISO 6887 y / o ISO 8261 frente a los procedimientos para los diferentes tipos de productos en cuestin. 9.2 Enriquecimiento En general add x 9 x mi o de la porcin de prueba para 9x millas de Shigella caldo que contiene 0,5 IJG / ml de novobiocina (8.1.2) para realizar una dilucin de 1 en 10 de la muestra. Homogeneizar la muestra en el caldo usando un homogenizador peristltico o mezclador rotatorio (6,6). Aspticamente ajustar el pH a 7,0 0,2, si es necesario. Incubar (6,4) del caldo de Shigella bajo condiciones anaerbicas con tapas y cierres sueltos, o con el equipo dando un efecto equivalente, de modo que el intercambio de gases puede ocurrir fcilmente sin contaminacin en (41,5 1) C (6,3) durante 16 horas a 20 h. 9,3 forro hacia fuera y seleccin de colonias 9.3.1 Uso de los cultivos obtenidos en 9.2, mezcle suavemente el contenido con la mano y permitir que las partculas ms grandes para asentarse. Se inoculan, por medio de un bucle (6,7), la superficie de los agares selectivos siguientes para obtener colonias bien aisladas: agar de MacConkey (8.2.1) con baja selectividad; agar XLD (8.2.2) con selectividad moderada; y entrico Hektoen agar (8.2.3) con una mayor selectividad.

9.3.2 Incubar (6,3) en las placas (37 1) C entre el 20 y 24 h. 9.3.3 La aparicin de diferentes especies de Shigella puede variar en el agar selectivo misma. Vase el Anexo C para obtener una descripcin de las colonias de Shigella en las diferentes agares selectivos utilizados. Especies de Shigella puede formar una parte minoritaria de la flora microbiana total, cuando la contaminacin de una muestra de alimentos o el enriquecimiento afier. En estas circunstancias, la siembra directa del caldo de enriquecimiento en una placa de agar selectivo por puede fallar para permitir la deteccin de colonias de Shigella. Por lo tanto, puede ser apropiado en algunas circunstancias (por ejemplo, la investigacin de los alimentos implicados en la enfermedad) a considerar la inoculacin de los dos posibles 90 mm platos o una placa de Petri de gran tamao (140 mm) (6.12) para aumentar la posibilidad de deteccin. Las colonias de algunas cepas de Enterobacteriaceae son muy similares en apariencia a las de Shigella. Las colonias tpicas o sospechosas debern ser confirmadas (ver 9.4) como las especies de Shigella o no. Tambin en algunas circunstancias (por ejemplo, alimentos implicados en el envenenamiento de alimentos), puede ser apropiado para investigar ms de cinco colonias de una placa para aumentar la confianza en la ausencia de Shigella en la muestra de alimento probado. Marque las colonias tpicas o sospechosas que se encuentran en cada plato. Si no hay colonias tpicas son vistas y el crecimiento de otros microorganismos es dbil (especialmente en el agar ms selectivo), reincubar las placas durante 24 h. Examinar de nuevo para las tpicas colonias de Shigella. Llevar a cabo el procedimiento de confirmacin se describe en 9.4 9,4 Confirmacin de las colonias 9.4.1 general de Juegos de identificacin (actualmente disponible comercialmente) que han sido mostrados por el usuario para ser fiable para la identificacin de las diferentes especies de Shigella puede ser utilizado. Siga las instrucciones del fabricante con precisin. Para la confirmacin, sub-cultura de cada plato de cada medio selectivo (ver 9.3) cinco colonias marcadas tpicos o sospechosos. Si en un plato hay menos de cinco colonias tpicas o sospechosas, todas las colonias marcadas para su confirmacin. El uso de cultivos puros para la confirmacin bioqumica y serolgica. 9.4.2 Purificacin de colonias

Streak las colonias seleccionadas sobre la superficie de placas de agar nutritivo (B-3) con el fin de obtener colonias bien aisladas. Incubar (6,3) en las placas (37 1) C durante 18 h a 24 h. Si los cultivos en agar nutritivo son mixtos, sub-cultura de la colonia sospechosa en un plato adicional de agar nutritivo e incubar a (37 1) C durante 18 horas a 24 horas para obtener el cultivo puro. Shigella sonnei pueden dar dos tipos de colonias en la placa de agar mismo: una suave colonia cpula redonda (fase 1), y una colonia irregular, plana con una superficie mate (fase 2). NOTA Es posible comprobar primero la colonia ms caracterstico de cada placa de agar selectivo. Si es positivo, no es necesario para probar otras colonias. Si el progreso negativo, a travs de las otras colonias seleccionadas hasta que o bien todos son negativos o positivos uno se encuentra.

9.4.3 confirmacin Biochemical 9.4.3.1 general Por medio de una aguja de inoculacin (6,7), inocular los medios especificados en 9.4.3.2 a 9.4.3.9, respectivamente, con cada una de las culturas seleccionados en 9.4.1 y registrar todos los resultados. 9.4.3.2 triple azcar hierro agar (TSI pendientes) (8,4) Pualada la culata y la racha de tubo de gelosa. Incubar (6,3) a (37 1) C durante (24 3) horas. Interpretar los cambios en el medio como sigue: Tpicos cultivos de Shigella muestran una cabeza amarillo (formacin de cido) y no del ~ g ~ burbujas, no hay cambio en el color de la inclinacin (sin la utilizacin de lactosa o sacarosa) y no hay produccin de sulfuro de hidrgeno (vase Tabla 1). 9.4.3.3 Semi-slido agar nutriente para las pruebas de la motilidad (8,5) Pualada el agar nutriente semi-slido con una colonia usando una aguja de inoculacin (6,7). Se incuba (6,3) en los tubos (37 1) C durante 18 horas a 24 h. Examine la lnea de inoculacin para la difusin de crecimiento. No mviles microorganismos dar una lnea discreta; cepas mviles dar crecimiento difuso de distancia desde la lnea de inculo. AII Shige / la las especies no tienen movilidad.

9.4.3.4 La urea agar (8,6) Extender la superficie del agar. Incubar (6,3) a (37 1) C durante (24 3) horas y examinar a intervalos. Si la urea se hidroliza, un color rosa al color cereza profundo desarrolla a partir de la liberacin de amonaco por la descomposicin de la urea con un cambio en el color del indicador de pH. No hay ningn cambio en el color del agar con una reaccin negativa. Shige / la especie no se hidroliza la urea. 9.4.3.5 L-lisina descarboxilasa medio (8,7) Se inoculan por debajo de la superficie del caldo lquido. Incubar (6,3) a (37 1) C durante (24 3) horas. Turbidez y una incubacin de afier color prpura indica una reaccin positiva, el amarillo indica un resultado negativo. Shige / la especie no descarboxilacin de lisina. NOTA El uso de un recubrimiento de parafina en los tubos puede ayudar a asegurar condiciones anaerbicas. 9.4.3.6 L-ornitina descarboxilasa medio (8,8) Se inoculan por debajo de la superficie del caldo lquido. Incubar (6,3) a (37 1) C durante (24 3) horas. Si se desarrolla un color prpura, la prueba es positiva, de un color amarillo significa un resultado negativo. Shige / la sonnei descarboxila ornitina, pero otras especies de Shige / la no lo hacen (ver Tabla 1). 9.4.3.7 Deteccin de la formacin de indol (8,9) Inocular un tubo con 5 ml de triptona / triptfano medio (8.9.1) con el cultivo puro. Incubar (6,3) a (37 1) C durante (24 3) horas. Afier de incubacin, agregar 1 ml de reactivo de Kovac (8.9.2). La formacin de un anillo de color rojo dentro de 10 minutos indica la formacin de indol, y un color amarillo / marrn indica un reaccin negativa.

Shige / la sonnei es negativo, mientras que otras cepas dan reacciones variables (ver Tabla 1). 9.4.3.8 Deteccin de 3-galactosidasa (8,10) Suspender un asa de siembra de la cultura purific a partir del agar nutriente en 0,25 ml de solucin salina (8,12) en una botella tapn de rosca o tubo de ensayo. Agregue una gota de tolueno y agitar para mezclar bien. Ponga el tubo en una incubadora (6,3) conjunto a 37 C y dejar durante varios minutos. Aadir 0,25 ml de reactivo de completa y mezclar. Vuelva a colocar en el conjunto de la incubadora a 37 C y se deja durante (24 3) horas, el examen a intervalos. El color amarillo indica la formacin de J3-galactosidasa, que puede ocurrir en tan slo 20 mino Shigella sonnei es positiva. S. dysenteriae y S. boydii dan reacciones variables y S. f1exneri es negativo. (ver Tabla 1).

9.4.3.9 Utilizacin de los hidratos de carbono (8.11) Se inoculan cada uno de los caldos de hidratos de carbono preparados con un inculo pequeo. Incubar (6,3) a (37 1) C durante (24 3) horas. Una reaccin positiva cuando los hidratos de carbono se utiliza da un cambio en el indicador de pH del prpura al amarillo. Ver Tabla 1 para las reacciones de las diferentes especies de Shigella. 9.4.3.10 Interpretacin de los resultados bioqumicos Las cepas dentro de algunas especies de Shigella varan en sus reacciones bioqumicas (ver Tabla 1), por lo tanto, la interpretacin basada nicamente en los resultados bioqumicos es difcil y serotipificacin es esencial para establecer la identidad. Shigella son bacilos Gram-negativos, 2 a 4 IJM IJM en un 0,5 IJM en tamao, pero a menudo muestran una tendencia a corto cocco-bacilos formas y por lo general no producen gas de la glucosa. Ellos no tienen movilidad, no producen sulfuro de hidrgeno o lisina descarboxilacin, y la lactosa negativo a las 24 h. Las otras pruebas descritas anteriormente dan reacciones variables o reacciones diferentes segn la especie. 9.4.4 Diferenciacin bioqumica adicional

9.4.4.1 general Se recomienda llevar a cabo pruebas adicionales de diferenciacin bioqumica para una mejor identificacin de las cepas: algunas cepas de Escherichia coli y especies de Shigella son similares. 9.4.4.2 acetato de sodio Extender la pendiente de la medicina de acetato de sodio \ Jm (8,13) con el cultivo puro (9.4.1). Utilizar un alambre recto para minimizar la cantidad de medio de cultivo transferido Nith el inculo, o utilizar una aguja de inoculacin. Incubar en condiciones aerbicas durante 2 das a (37 1) C. Examine el verde medio para el crecimiento: un resultado positivo se encuentra cuando el medio se vuelve azul. Mira para el crecimiento, de un color azul indica una reaccin positiva. Si no se produce el crecimiento, incubar la cultura durante 2 das adicionales a (37 1) C. Examinar el medio nuevo. Especies de Shigella no crecen o crecen muy poco. Las cepas de E. coli dar colonias azules con el medio circundante azul / verde. Tabla 1 - diferenciacin bioqumica y la confirmacin de las especies de Shigella a partir de E. coli, Hafnia y especies Providencia

9.4.4.3 citrato de Christensen Inocular la superficie de la pendiente de la citrato de Christensen (8,14), utilizando una aguja de la inoculacin con un cultivo puro (9.4.1). Minimizar la medida de lo posible la cantidad de medio transferido con el inculo. Incubar aerbicamente durante 2 das a (37 1) C. Examinar para detectar una crema / crecimiento rosa. En este caso, los cambios de medio a rojo. Si no se produce el crecimiento, incubar el cultivo durante otras 2 das y examinar de nuevo. Especies de Shigella no crecen. 9.4.4.4 sodio mucato Inocular el caldo de prueba (8.15.1) y el caldo de control (8.15.2) con el cultivo puro (9.4.1). Incubar aerbicamente durante 2 das a (37 1) C.

Examinar el medio para detectar el crecimiento y el desarrollo de color. Un color azul indica una reaccin negativa y un color amarillo / paja indica una reaccin positiva. Si no se produce el crecimiento en el caldo de prueba, se incuba la cultura por un perodo de 2 das a (37 1) C. Examinar el medio nuevo. Shigella sonnei muestra las reacciones de las variables, pero otras especies de Shigella son negativos. Para ms detalles sobre las reacciones de las especies de Shigella, vase el cuadro 2. 9,5 de confirmacin 5erological 9.5.1 antignica de diferenciacin Shige / la las especies no tienen movilidad y por lo tanto no tienen antgenos flagelos: la diferenciacin dentro y entre las especies depende del anlisis de los distintos grupos somticos "O" y especficas de los empaques de los antgenos de tipo (ver Tabla 3). Al escribir en el nivel de serovar se realiza mejor por un laboratorio de referencia entrica. El crecimiento de un cultivo fresco en agar nutriente es necesario (ver 9.4.1). Llevar a cabo pruebas de aglutinacin en portaobjetos de vidrio c1ean o placas de vidrio (6,13) del tamao apropiado. NOTA 1 Los antgenos de los grupos (A, S, C, D) puede contener antgenos menores que pueden cruzar reaccionar con antgenos de los grupos de otros, lo que se evita mediante el uso de antisuero absorbido y / o su dilucin a un nivel estipulado. Algunas especies, particularmente Shigella dysenteriae, tienen antgenos de la envoltura que enmascaran el grupo y antgenos serovar que impiden la aglutinacin con antisueros tipo especfico. El antgeno envoltura se elimina por calentamiento de una suspensin a 100 oC durante 15 min a 60 min. NOTA 2: La Shigella sonnei antgeno del grupo D est presente en ambos tipos de colonias de las lisas y rugosas y no tiene reactividad cruzada con otros antgenos de los grupos de Shigella. A diferencia de algunas otras enterobacterias, los tipos de colonias de S. sonnei en bruto no necesariamente auto-aglutinar. Shigella sonnei no tiene antgeno sobre. 9.5.2 Las pruebas de aglutinacin Siga exactamente las instrucciones dadas por el fabricante para la preparacin de antisueros y la realizacin de las pruebas de aglutinacin. Colocar una gota del antisuero grupo y una gota de solucin salina (8,12) por separado sobre un portaobjetos de vidrio (6,13). Dispersar parte de la colonia que se analizarn en la solucin salina y una parte de la colonia en la solucin

de antisuero a fin de obtener una suspensin homognea y turbia en cada uno. Agitar suavemente el portaobjeto durante 30 s 60 s. Observe el resultado contra un fondo oscuro, si es necesario con la ayuda de una lupa. Si las bacterias en el antisuero han c1umped en partitles ms o menos distintas y no hay aglutinacin en la solucin salina, el iso tarde es positivo para el grupo de prueba. Si hay aglutinacin en la solucin salina, la cepa se considera auto-aglutinar, y no se utilizarn ms. El ensayo de otras colonias de la misma cultura y la otra iso gulados seleccionado para frorn del examen. el agar selectivo y original de dar reacciones bioqumicas indicativas de Shige / la continuacin, debera ser teste "d. Si" todas las colonias seleccionadas aglutinan automtica, consulte a un Laboratorio de Referencia de la identidad entrica iso tarde. ". Si todas las pruebas son negativos y pruebas bioqumicas son caractersticos de Shige / la, calentar una suspensin de los cultivos puros en un bao mara a 100 C durante 60 minutos y repetir las pruebas de aglutinacin. 9.5.3 La confirmacin definitiva Para la confirmacin y / o el anlisis ms all del "grupo" de los factores (ver Tabla 3), los aislados deben ser enviados a un laboratorio de referencia reconocido entrica para su confirmacin y tipificacin definitiva. El envo deber ir acompaada de toda la informacin posible acerca de los aislamientos.

10 Expresin de los resultados De acuerdo con los resultados de la interpretacin, indican la presencia o ausencia de especies de Shigella confirmados en la porcin de ensayo de x 9 x o millas de producto 11 Informe de la prueba El informe del ensayo deber especificar: a) toda la informacin necesaria para la completa identificacin de la muestra;

b) el mtodo de muestreo utilizado, si se conoce; c) el mtodo de ensayo utilizado, con referencia a esta norma internacional; d) todos los detalles operativos no especificados en esta norma internacional, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el resultado de la prueba (s); e) los resultados de ensayo obtenidos.