Tcnicas de Ing. Gentica para conferir resistencia a virus en plantas.

Javier Villacreses. Ing. Produccin Vegetal.

Produccin Vegetal.
Industrializacin Agrcola.

Biotecnologa.

Mejoramiento Vegetal.
Ing. Gentica.

Resistencia

Produccin metabolitos.

Virus Insectos

Factores Abiticos.

Met. Secundarios.

Virus.
Conjunto de una o mas molculas de acido nucleico, contenido en una cubierta protectora de protenas o lipoprotenas, capas de autoreplicarse nicamente dentro de clulas hospedadoras adecuadas.

Patrn de bandas caracterstico de la infeccin de los tulipanes por el Tulip mosaic virus.

Estrategias de resistencia.
Proteccin Cruzada.
Tomates/ Tomato mosaic virus. Papas/ Potato spindle tuber viroid. Citrus/ Citrus tristeza virus.
Desventajas. La cepa atenuada (o protectiva) puede mutar y volverse virulenta. La cepa protectiva puede tener sinergismo con un tercer virus que est en el campo y causar una enfermedad severa. Una misma cepa puede ser protectiva en una especie y virulenta en otra especie. La cepa protectiva puede causar prdidas pequeas pero significativas en el rendimiento.

Estrategias de resistencia.

Solucin.
Todos estos inconvenientes se solucionaran si se lograra desencadenar proteccin cruzada por la expresin de un nico gen viral en plantas transgnicas.

Estrategias de proteccin antiviral por Ing. Gentica.

Resistencia derivada del patgeno (PDR).
Mediada por protenas: Capside Viral (CP). Replicasas Virales (REP). Protenas de movimiento

(MP).

Mediada por RNA.

Silenciamiento gnico post-transcripcional (PTGS).

Resistencia derivada de transgenes no virales.

Anticuerpos antivirales. Proteinas inhibidoras del ribosoma.

Resistencia derivada de patgenos.

Puede derivarse resistencia del parsito expresando funciones del patgeno en el husped, de forma tal que sta ocurra en forma disfuncional, en exceso o en un momento inadecuado del desarrollo. Sandford and Johnston, 1985.

Resistencia a Tobacco mosaic virus mediada por la protena de cpside viral

A: La expresin de protena de la cpside (CP) caus un retraso en la aparicin de los sntomas en tres lneas transgnicas independientes. B: La eficacia del mecanismo de resistencia fue inversamente proporcional a la concentracin del inculo viral. CP - : progenie que no expresa al gen de cpside de TMV. CP +: progenie que expresa al gen de cpside de TMV.

La resistencia mediada por la cpside provee proteccin de amplio rango.

Las plantas que expresan la protena de la cpside del Soybean mosaic virus resultan protegidas frente al desafo con virus relacionados, tales como el Potato virus Y y el Tobacco etch virus.

Ensayo de proteccin a TMV en plantas transgnicas que expresan protenas de cpside nativas o mutadas

La planta que expresa a TMV-T28W se comporta igual que la no transgnica. La que expresa a TMV-42W resulta ms protegida que la transgnica para protena de cpside nativa (3646).

Reportes sobre proteccin mediada por protenas de cpside viral.

Los acrnimos utilizados (en orden alfabtico) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maize dwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya ringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV: Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato chlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White clover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus.

Proteccin mediada por la cpside viral.

El fenotipo de resistencia se expresa como:

retardo temporal del desarrollo de sntomas atenuacin de la sintomatologa normal menor ttulo de virus en los tejidos menor nmero de sitios de infeccin

Se requiere la presencia de protena viral. Existe correlacin entre resistencia y nivel de expresin de la protena de la cpside. La proteccin es superada por altas dosis de inculo (viriones). En algunos casos es superada por inoculacin con ARN viral. La proteccin es ms efectiva para el virus homlogo. Sin embargo, abarca tambin virus y cepas del mismo grupo. En algunos casos, la efectividad y/o el espectro de proteccin se modific por la expresin de versiones truncadas o quimricas de la protena de la cpside. Acta a nivel celular afectando una etapa temprana del ciclo infectivo (decapsidacin) y, probablemente, a nivel de la dispersin sistmica.

Resistencia mediada por replicasas en plantas transgnicas.

Mecanismos propuestos mediada por replicasas.

para

la

resistencia

Efecto squelching: inhibicin producida por un exceso de uno de los componentes del complejo de replicacin. Efecto de inhibicin por trans-dominancia: formacin de un complejo replicativo no funcional por incorporacin de un componente disfuncional. Efecto mediado por ARN: degradacin del ARN viral inducida por un mecanismo de silenciamiento gnico.

Resistencia mediada por replicasas en plantas transgnicas.

1. El fenotipo de resistencia se expresa como cuasi-inmunidad. 2. En muchos casos, no se requiere presencia de la protena. No existe correlacin entre resistencia y nivel de expresin de la replicasa viral. Puede obtenerse mediante la expresin del transcripto correspondiente de ARN. 3. Tolera altas dosis de inculo. 4. Es una proteccin de rango estrecho. Opera frente al virus homlogo o cepas estrechamente relacionadas. Es superada por virus pertenecientes al mismo grupo. 5. Se asume que, en la mayora de los casos, la resistencia es mediada por un mecanismo dependiente de ARN (PVX, CyRSV, PEBV): Se asocia a baja acumulacin del transcripto de replicasa. Opera slo cuando existe alta homologa. El transgen puede inactivar genes homlogos (mecanismo de silenciamiento gnico).

Protenas de movimiento virales modifican el lmite de exclusin de los plasmodesmos.

Las protenas de movimiento (MP) de varios virus de plantas (TMV, PVX, AIMV, CMV, BDMV) causan un aumento en el lmite exclusin de los plasmodesmos y son capaces de desplazarse independientemente de la replicacin viral. A y B: se inyect PVX mMP-GUS. C y D: se inyect PVX MP-GUS. B y C: deteccin de dextrano F de 10 kDa conjugado a un ligando fluorescente. A y D: tincin GUS.

La MP nativa permite el movimiento del dextrano F de 10 kDa. La MP mutada (mMP) no lo permite.

Proteccin mediada movimiento.

-

por

protenas

de

1. El fenotipo de resistencia se expresa como:

retardo temporal del desarrollo de sntomas menor ttulo de virus en los tejidos infectados atenuacin o desaparicin de la sintomatologa normal

2. Se requiere la presencia de la protena de movimiento, generalmente en forma mutagenizada. 3. Existe correlacin entre nivel de resistencia y nivel de expresin de la protena de movimiento. 4. Es una proteccin de rango amplio. Protege frente a virus del mismo grupo y frente a virus de grupos no relacionados. 5. La proteccin es superada por altas dosis de inculo. 6. Se asume que interfiere con el mecanismo de transporte viral, fundamentalmente sobre el pasaje clula a clula.

Resistencia derivada del patgeno mediada por ARN.

Silenciamiento gnico post-transcripcional (PTGS):Ausencia de expresin del gen de inters debido a una degradacin inducible y especfica del transcripto de ARNm. Se desencadena por reconocimiento de secuencias homlogas a nivel citoplasmtico. En algunos casos el PTGS puede reforzarse por metilacin a nivel nuclear.

Silenciamiento organismos.

gnico

en

distintos

La degradacin del ARN es gatillada por ARNdc, el cual puede provenir de un transgen, un virus o un elemento gentico transponible. La enzima Dicer procesa el ARNdc en siARNs. El complejo RISC utiliza la hebra antisentido de los siRNAs para silenciar el ARNm blanco. En moscas y mamferos, la hebra antisentido es incorporada directamente en RISC. En ausencia de siARNs, RISC no posee capacidad de unir ARNm en forma secuencia-especfica. En presencia de siARN, RISC participa de la degradacin del ARNm homlogo en forma cclicaEn plantas y gusanos la hebra antisentido de siARN puede participar primeramente de un proceso de amplificacin. La hebra antisentido se une a una ARN polimerasas ARN- dependiente que puede unirse al ARNm complementario y actuar como punto de partida para la sntesis de nuevo ARNdc. La enzima Dicer es requerida para generar siARNs y el proceso continua con la degradacin del ARNm blanco

Silenciamiento (PTGS)

gnico

post-

transcripcional

Se caracteriza por elevados niveles de transcripcin en el ncleo y niveles acumulacin de ARNm muy bajos o nulos en el citoplasma Requiere la transcripcin del transgn: es ms frecuente con el aumento del nmero de copias y la fuerza del promotor. La replicacin viral puede gatillar el PTGS en una planta transgnica no silenciada y, en consecuencia, la misma se vuelve resistente a los mismos (fenotipos de inmunidad y recuperacin). Desaparece luego de la meiosis y reaparece semanas despus de la germinacin de las semillas. El proceso se gatilla a partir de la presencia de ARNdc.

Supresin del silenciamiento gnico por genes virales.

Las protenas virales supresoras del silenciamiento actan a distintos niveles.

P1/HC-Pro de TEV PVY (potyvirus, ARNsc). 2b de CMV (cucumovirus, ARNsc). p25 de PVX (potexvirus, ARNsc). p19 de TBSV (tombusvirus, ARNsc). Ac2 de ACMV (geminivirus, ADNsc).

Resistencia derivada de la expresin de genes no virales.

Expresin de anticuerpos de cadena nica (scFv antibodies) o plantibodies en plantas.

Expresin de anticuerpos de cadena nica contra la protena de cpside del Artichoke mottled crinkle virus en plantas de tabaco.

Porcentaje de infeccin de plantas control y de dos lneas transgnicas inoculadas con AMCV. virus en hojas inoculadas y hojas superiores de plantas inoculadas con AMCV a los 14 das postinfeccin.

Plantibodies
Se requieren muy altos niveles de expresin. Se debe lograr que el anticuerpo se exprese en los compartimentos celulares donde ocurren los pasos de multiplicacin viral a ser inhibidos. Los anticuerpos a expresar deben ser seleccionados previamente por su habilidad de bloquear un paso crucial en el ciclo de multiplicacin o transmisin viral. Por lo tanto se requiere de un ensayo de interferencia viral bien diseado.
Los anticuerpos ms promisorios son aquellos dirigidos hacia protenas con actividad cataltica y no los dirigidos hacia protenas estructurales.

Plantas transgnicas con resistencia a virus en etapa de experimentacin o de pruebas experimentales a campo en pases en vas de desarrollo.

 Gracias