Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa

ESTADSTICA Proyecto de Tercer Departamental

Aplicacin de los mtodos analticos estadsticos a un problema biotecnolgico: Proliferacin del crecimiento celular de E. coli
Equipo: Meldicos Dvila Arias Nerlyn Eleded Huerta Prez Yael Alonso Lugo Vilchis Aldo Leonel Santos Martnez Sharon Lizeth Terlakis Gonzlez Jimena Thalia
Mxico, D.F., 23 mayo 2011

2MM2

En el rea de la biotecnologa, especficamente, en la microbiologa son necesarios mtodos estadsticos para dar un tratamiento a una serie de datos experimentales para llegar a establecer condiciones adecuadas a distintos medios o sistemas naturales o artificiales que impliquen el crecimiento de microorganismos.

Entonces, de esta manera:

Conocer el tiempo de generacin de la E. coli para as poder predecir el tiempo que tardar la bacteria en producir sus efectos secundarios despus de ser expuesto a ella, y de esta forma poder contraatacarlos.

Explicar mediante anlisis estadstico cmo se lleva a cabo el tratamiento de datos para el recuento de microorganismos tales como la Escherichia coli a travs de la tcnica de cuenta viable por vaciado en placa en la fase exponencial de crecimiento celular

Demostrar los resultados experimentales de la proliferacin de crecimiento celular de Escherichia coli en un cultivo selectivo y con agitacin a nivel matraz por 24 horas El alumno cuantificar el nmero de microorganismos viables a travs del recuento por diluciones y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias. Comparar los resultados obtenidos prcticamente con resultados tericos aplicando mtodos estadsticos

Las personas infectadas con E. coli pueden tener diversos sntomas, algunas, diarrea leve y otras, ningn sntoma en absoluto.

Se incorporan las bacterias al comer alimentos que las contengan.

la infeccin puede ocasionar una complicacin denominada sndrome urmico hemoltico (SUH). Se trata de una enfermedad grave, con destruccin de los glbulos rojos e insuficiencia renal.

 Microorganismo unicelular simple Contiene un solo cromosoma de forma circular en el nucleoide Recubrimiento por una pared celular y una membrana celular Movimiento a travs de flagelos Cuenta con pequeas molculas de DNA (plsmidos) Forma colonias No cuenta con organelos membranosos

Es el nmero de clulas que crecen aumentan en cantidad y se agrupan en colonias de cientos de microorganismos (UFC)

A los grupos de microorganismos lo suficientemente grandes como para ser observados sin el microscopio

Permiten predecir la rapidez con que crecern en distintas situaciones

o Temperatura FSICOS o pH (medio) o Presin osmtica

Factores que controlan el crecimiento microbiano

QUMICOS o Agua o Fuentes de carbono o Fuentes de nitrgeno o Sustancias minerales o Oxigeno, etc.

Reproduccin bacteriana
Divisin celular que da lugar a dos clulas hijas a partir de una clula madre con una distribucin equitativa del nico cromosoma de DNA bacteriano

Escherichia coli: caractersticas generales

Bacteria simbitica que vive en el tracto intestinal humano Es inofensiva Produce enfermedades gastrointestinales, como la diarrea Se adquiere la infeccin por consumo de alimentos que contengan la bacteria Se requiere higiene para evitar intoxicacin por alimentos y prevenir infecciones

Escherichia coli: como objeto de estudio

Es un microorganismo modelo debido a: a) Fcil manutencin y manipulacin en el laboratorio a) Ciclos de vida cortos b) Gran nmero de descendencia c) Fenotipo (rasgos fsicos y conductuales) de inters sencillo de observar o medir d) Tcnicas de transformacin bacteriana sencillas

El crecimiento puede estar basado en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeas. Algunos de ellos son:

Turbidimetra Cuenta directa por cmara de Neubauer Cuenta viable por vaciado en placa

Medicin la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.

Tcnica de contaje celular a travs de una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas dispersas en un fluido.

Recuento de organismos unicelulares, directamente sobre la placa, ya que las clulas viables originan cada una en su crecimiento colonias independientes y macroscpicamente visibles.

Mtodo

Ventajas

Desventajas

Turbidimetra

Conteo de clulas vivas

Para microorganismos ( m) Para muestras con cargar superiores a 10 000 por mililitro Inadecuada distribucin de la muestra sobre la placa, ocasiona errores No sirve en caso de contar muestras con hongos

Rpido Cmara de Neubauer Frotis se pueden guardar Conteo de organismos viables y no viables Fcil de utilizar en caso de clulas aisladas Vaciado en placa

Conteo de microorganismos Se invalida el sistema si no que no crecen bien en la cuenta con mnimo 25-250 superficie de las placas de colonias cultivo

 Se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado. En este caso se trabaj con Agar Glucosa Sales  Comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que aporta el medio de cultivo para fabricar nuevos microorganismos  El proceso de crecimiento continuar hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agote

Cultivo de E. coli

Muestra 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tiempo(horas) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.5 8.0 9.5 11.0 12.5

UFC/ml 1.86E+07 2.91E+08 1.84E+09 2.26E+09 2.11E+09 2.60E+09 4.90E+09 3.40E+10 4.60E+10 4.48E+10

Fase latencia (lag): periodo de adaptacin antes de empezar a multiplicarse Fase exponencial: multiplicacin bacteriana acelerada en que cada generacin se produce un nmero proporcional a las existentes Fase estacionaria: se alcanza cuando se consumen los elementos nutritivos y el nmero de bacterias se mantiene estable

Fase de declive o muerte: bacterias comienzan a morir

Medicin la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.

La curva de crecimiento experimental actu de manera distinta a la terica, ya que la fase de adaptacin (lag) consumi 5 tiempos para llegar a la fase exponencial

FASE EXPONENCIAL LINEA DE REGRESION

Se comienza el tratamiento de datos con una regresin lineal para obtener la recta que ms se aproxime al comportamiento de la fase exponencial del crecimiento bacteriano

Tiempo(horas) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.5 8.0 9.5 11.0 12.5

UFC/ml 1.86E+07 2.91E+08 1.84E+09 2.26E+09 2.11E+09 2.60E+09 4.90E+09 3.40E+10 4.60E+10 4.48E+10

FASE EXPONENCIAL

SUMATORIA

X tiempo(horas) 8.0 9.5 11.0 28.5

y UFC/ml 4.90E+09 3.40E+10 4.60E+10 8.49E+10

xy 3.92E+10 3.23E+11 5.06E+11 8.68E+11

x2 6.40E+01 9.03E+01 1.21E+02 2.75E+02

Y2

2.40E+19 1.16E+21 2.12E+21 3.30E+21

Se quiere obtener una ecuacin de la forma:

Con las siguientes frmulas:

Se obtiene una ecuacin de la siguiente forma:

COEFICIENTE DE CORRELACIN (r2)

Caso 1: Se han realizado pruebas para determinar el tiempo de generacin de Escherichia coli, Se entiende que el tiempo de generacin de esta bacteria es normalmente de 1h con una desviacin tpica de 0.16h. En UPIBI se realiz una cintica a esta bacteria donde se obtiene una media de 0.928h. Determinar si para cuestiones biotecnolgicas es permisible considerar este tiempo de generacin. Si se considera un nivel de significancia de 0.01.

DATOS: Media terica M1=1h. Media experimental M2=0.928 hrs Desviacin tpica de = (0.16) DESARROLLO DEL PROBLEMA: Planteamiento de la hiptesis H0= M=1h H1=M 1h Estadstico Con =0.1 y grados de libertad: 3-1=2

Caso 2: Si en esta ocasin se considera que el crecimiento de E. coli tiene una desviacin tpica de 0.16 y un coeficiente de relacin r= 0.9721, determinar si el tiempo de generacin de colonias es de 1 hr o es diferente de 1hr.

Desviacin tpica de = (0.16) r= 0.9721 DESARROLLO DEL PROBLEMA: Planteamiento de la hiptesis H0= M=1h H1=M 1h Estadstico

Con =0.1 y grados de libertad: 31=2

Regresin lineal Ventajas Desventajas

Prediccin del comportamiento de una variable Variables deben en un depender una de la otra determinado punto o momento Mtodo de Datos inexacto o control para imposibles sin condiciones de una adecuada crecimiento de relacin de bacterias variables

T- student Ventajas Desventajas

Puede tomar valores negativos (en general, solo interesa su magnitud) Uso limitado solo para cuando se tiene suficiente Distribucin simtrica y con informacin mayor precisin que la distribucin normal

 Terapia y diagnostico de enfermedades Biotecnologa de DNA recombinante Produccin de insulina humana y otras protenas recombinantes Procesos de calidad

Lugar: Maracaibo, Venezuela Industria: Productora de carne para hamburguesas Problema: Determinar la presencia y fuentes de contaminacin de E. coli Resultados: Negativo para el proceso industrial, positivo al procesamiento de ingredientes Falla: Programas sanitarios e higinicos de los trabajadores

Empresa: Eli Lilly Hecho: Firma acuerdo con farmacutica india Objetivo: Desarrollar vacuna vs. E. coli Procedimiento: Estudio sobre 400 cabezas de ganado en Canad Plazo: Desarrollarla en 2 aos

Los requisitos fundamentales para que se d el crecimiento son: La existencia de un medio de cultivo que aporte los elementos nutritivos en todas sus formas. El establecimiento y establecimiento de las condiciones fisicoqumicas o ambientales necesarias. Se cree que la diferencia en las medias se pudo deber a que al realizar a siembra con las ltimas diluciones estas ya no hayan tenido una cantidad despreciable de microorganismos. Otra razn podra ser por la dificultad de realizar el conteo de las colonias que se encuentran en la profundidad del medio.

Fuentes consultadas
 Campbell, Neil; Reece, Jane (2007): Biologa. 7 edicin. Mdica Panamericana. Buenos Aires. pp 226-227.  Ketchum Argentina XAGA (2004): Las especies modelo en biotecnologa. ArgenBio [En lnea]. Consultado el 13 de mayo 2011. Disponible en: http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_50.asp?cu aderno=50  Rodrguez, Guadalupe (2002): Principales caractersticas y diagnstico de los grupos patgenos de Escherichia coli. Salud Pblica de Mxico. ISSN 0036-3634. [En lnea] Consultado el 13 de mayo 2011. Disponible en: http://www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S003636342002000500011z  De la Rosa, Manuel; Prieto, Jos (2003): Microbiologa para ciencias de la salud. 2 edicin. Elsevier. pp. 15-16