Inmovilizacin de Pectinasa en policrilamida

Andrs Leonardo Hernandez Haga clic para modificar el estilo de subttulo del Flix Velasco Velasco patrn

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ndice
Introduccin Generalidades Inmovilizacin de Enzimas Tcnicas de inmovilizacin Pectina Pectinasa Bibliografia

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Introduccin
En los ltimos aos, los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos: Presentan una gran actividad cataltica Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad) Son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica. A pesar de sus ventajas, su empleo esta limitado en los procesos qumicos industriales, ya que presenta desventajas en sus condiciones de trabajo, su solubilidad, separacin de los sustratos y productos hace que su reutilizacin sea mas compleja. La inmovilizacin de las enzimas se superan estos inconvenientes permitiendo su uso.
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Generalidades Inmovilizacin de Enzimas

Es

un proceso que confina la enzima en una regin del espacio Da lugar a formas insolubles que retienen la actividad cataltica para reutilizacin repetida. Restringe parcial o totalmente los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas por unin a un soporte.

1, Arroyo M, Inmovilizacin de enzimas, Fundamentos, mtodos y aplicaciones, Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applicationsed, Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Complutense de Madrid: Universidad Complutense de Madrid: 17

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VENTAJAS Aumento estabilidad enzima. Reutilizacin repetida. Diseo de reactor enzimtico de fcil manejo y control.
DESVENTAJAS Prdida de actividad de la enzima. Sistemas heterogneos. El sistema es ms costoso que la enzima nativa.

1, Arroyo M, Inmovilizacin de enzimas, Fundamentos, mtodos y aplicaciones, Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applicationsed, Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Complutense de Madrid: Universidad Complutense de Madrid: 17

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Mtodos de inmovilizacin

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Mtodos de inmovilizacin: Inmovilizacin por adsorcin

VENTAJAS Uniones reversibles, de carcter no covalente. Mtodo sencillo y de costo moderado.

DESVENTAJAS Estabilidad limitada (control de las condiciones de la reaccin), Prdidas por desorcin.

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Mtodos de inmovilizacin: Atrapamiento por inclusin el gel, polmero o matriz porosa.

La retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa.

Requiere pocas cantidades de enzima.

La enzima no sufre cambios en su estructura.

Se requiere control de las condiciones de polimerizacin. 5/2/12

Mtodos de inmovilizacin: Microencapsulacin y reactores de membrana.

Se atrapa la enzima en micro cpsulas dentro de membranas que permiten el paso de sustratos y productos pero no de la enzima. Se fija la enzima por adsorcin a la membrana semipermeable.

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Inmovilizacin qumica: unin covalente

Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivos empleados en el proceso de inmovilizacin. Se puede proteger el centro activo con un anlogo del sustrato o un inhibidor competitivo durante el proceso de inmovilizacin.

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Inmovilizacin qumica: Entrecruzamiento

Formacin de enlaces covalentes intermoleculares (entre molculas de enzima) y entre estas y el soporte.

Las redes de molculas entrecruzadas que se forman dificultan el acceso del sustrato al centro activo. Prdidas de actividad tras la inmovilizacin

Cantidades altas de protena inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura

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Comparacin mtodos

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1,2, PECTINA (Sustancias Pcticas)

Polisacridos que se componen principalmente de cidos poligalacturnicos coloides (poliurnidos derivados del cido galacturnico), Son sustancias blancas amorfas que forman en agua una solucin viscosa. Se hallan en los tejidos de las plantas, Las frutas (Constituyen el 30% del peso seco de la pared celular primaria de clulas vegetales), son tiles por su capacidad para formar geles o jaleas con compuestos hidroxilados (azcares), cidos, o con cantidades diminutas de iones polivalentes. Son relativamente inestables, especialmente a 5/2/12

Las pectinas tienen tres dominios principales: Homogalacturonanos (HG), 5/2/12 Ramnogalacturonano I (RGI),

PECTINA (Sustancias Pcticas)

Forman parte de la fibra soluble, este tipo de fibra se caracteriza porque en contacto con el agua, forma un retculo en el que el agua queda atrapada haciendo que la mezcla se gelifique. Ralentiza la absorcin intestinal de los azcares simples, por lo que las pectinas son capaces de mejorar la intolerancia a la glucosa (Beneficioso para diabticos tambin) Disminuyen los niveles de colesterol en sangre, Se comportan muy bien como estabilizantes de las casenas frente a los tratamientos trmicos a pH 5/2/12 cido

1,3) PECTINASA

Pectinasa es un grupo de enzimas que descomponen una parte central (Pectina) de las paredes celulares de las plantas. Son una parte omnipresente en la industria de los jugos de frutas y el vino (Preparados enzimticos Ccteles reducen viscosidad y licuefaccin de la pared celular). Se agregan a la alimentacin del ganado para ayudar a los animales a digerir mejor el alimento, tambin se venden como suplementos nutricionales para los seres humanos para facilitar la digestin.
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PECTINASA

El tratamiento con enzimas pcticas degrada la pectina, que ayuda a producir un jugo claro, Se usa cuando la fruta se convierte en pulpa y se extrae para eliminar su jugo.

Otros usos en la industria alimentaria:

Ablandamiento

de los frutos la corteza para hacer ms fcil pelado, y para fermentar el caf y el t. de fibras vegetales, como el algodn (reduccin de la necesidad de productos qumicos txicos en dichos procesos).
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Aislamiento

PECTINASA
Se dividen en dos Categorias: Enzimas Depolimerizadoras y Saponificadoras (Pectin metil esterasas PE)

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 Hidrolticas

sobre enlaces (1,4) glicosdicos

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PECTINASA

La principal enzima pectinoltica usada en la industria es la PL, Enzimas como PE son evitadas
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Parmetros estudiados de la enzima libre e inmovilizada,

Tiempo ptimo de Hidrlisis pH ptimo Temperatura ptima

Parmetros Cinticos Efecto de [Sustrato] Efecto de [Enzima] Actividad Km V mx 5/2/12

Determinacin Parmetros ptimos

Para: Enzima libre e inmovilizada, Para todos los experimentos la reaccin se detiene

con con ) y con NaOH (2,4N) posterior al tiempo de reaccin,

Esta es la Reaccin de azcares reductores: de monmeros reductores liberados en la hidrlisis de Pectina, La Absorbancia de los productos, luego del calentamiento a ebullicin, se leen a 540nm

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Anlisis de Resultados

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Anlisis de Resultados

(a) R = H para PG PG:Poligalacturonasa 5/2/12 (EC 3,2,1 15),

 La

pectinasa se emplea para hidrolizar la pectina, componente estructural de frutas y verduras. Esto permite la obtencin de un zumo menos viscoso y ms concentrado.
La

pectinasa se emplea inmovilizada sobre diferentes soportes (PVC, politeres, poliacrilamidas, almina, etc.)

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LOS GELES DE POLIACRILAMIDA

Se

forman mediante la polimerizacin de acrilamida en una disolucin que contiene el monmero, catalizadores de la polimerizacin y un tampn al pH deseado; se pueden aadir aditivos como detergentes o urea.

Empleados

actualmente para la electroforesis de protenas y de cidos nucleicos de cadena corta

5/2/12 http://upcommons.upc.edu/pfc/bitstream/2099.1/3233/1/521

Formacin del gel de poliacrilamida

La

polimerizacin se inicia por la formacin de radicales libres en el medio, lo que se logra mediante la adicin al medio de los generalmente llamados catalizadores, aunque ms correcto sera denominarlos iniciadores del proceso.

Persulfato

amnico Riboflavina o riboflavina-5-fosfato N,N,N',N' tetrametiletilendiamina (TEMED)**

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Mecanismo Polimerizacin

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Utilizacin de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida La polimerizacin de la acrilamida sola no origina

un gel, sino una especie de goma que es una disolucin muy viscosa de largas cadenas lineales de poliacrilamida.

Para

que se forme un gel propiamente dicho es necesario que se creen uniones covalentes entre esas cadenas N, N metiln-bis-acrilamida (BIS) 5/2/12

5/2/12 http://www.analesranf.com/index.php/aranf/article/viewFile/2

Sntesis de micro geles geles sin enzima se sintetizan a Los micro

La

partir de una emulsin concentrada (W/O)

emulsin concentrada se realiza mediante goteo con una jeringuilla, de la fase acuosa sobre la fase continua oleosa. La emulsin es homogenizada mediante agitacin magntica. El oxgeno disuelto en la emulsin se elimina mediante el paso de nitrgeno. Para comenzar la polimerizacin se aadi TEMED
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sntesis de micro geles de poliacrilamida con Enzima

Se preparar una fase acuosa constituida por solucin Buffer con pH optimo para la Enzima en la cual se disolvieron los precursores del polmero + 250 g de Enzima.

Para

iniciar la polimerizacin se aadi persulfato de amonio 11mM

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BIBLIOGRAFA

[1] ARROYO, Miguel, Inmovilizacin de enzimas,Fundamentos, mtodos y aplicaciones, Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad Complutense de Madrid 28040 Madrid, [2]RIOS ALZATE, L,R; ARIAS VARGAS, F,J,Inmovilizacin de Pectinasas y/o Celulasas y determinacin de algunos de sus efectos en el jugo de Guayaba, Universidad Nacional de Colombia, 2002 [4] CAVA LPEZ, Ramn, Bioqumica industrial, Relacin de clases prcticas Curso 2005-06, Universidad de Extremadura, [5] Abida Anwar, Shah Ali Ul Qader, Aliya Raiz, Samina Iqbal and Abid Azhar, Calcium Alginate: A Support Material for Immobilization of Proteases from Newly Isolated Strain of Bacillus subtilis KIBGE-HAS, World Applied Sciences Journal 7 (10): 1281-1286, 2009 [6] M,D, Busto , K,E, Garca-Tramontn, N, Ortega, M, Perez-Mateos, Preparation and properties of an immobilized pectinlyase for the treatment of fruit juices, Bioresource Technology 97 (2006) 14771483 5/2/12

BIBLIOGRAFA

[7] Tuoping Li Na Wang Suhong Li Qiancheng Zhao Mei Guo Cheyun Zhang ,Optimization of covalent immobilization of pectinase on sodium alginate support, Springer Science+Business Media B,V, 2007, Biotechnol Lett (2007) 29:1413 1416 [8] C, Rigouin , C, Delbarre Ladrat , C, Sinquin, S, Colliec-Jouault , M, Dion, Assessment of biochemical methods to detect enzymatic depolymerization of polysaccharides, Carbohydrate Polymers 76 (2009) 279284 [9] Sathyanarayana N, Gummadi , T, Panda, Purification and biochemical properties of microbial pectinases review, Process Biochemistry 38 (2003) 987_/996 [3] http://milksci,unizar,es/bioquimica/temas/azucares/pectinas,html http://www,scientificpsychic,com/fitness/carbohidratos2,html http://pagerankstudio,com/Blog/2010/06/que-es-un-pectinasa/ http://www,bedri,es/Libreta_de_apuntes/P/PE/Pectina,htm http://milksci,unizar,es/bioquimica/temas/azucares/pectinas,html 5/2/12

Para el proceso de obtencin de la pectina se someten las cscaras trituradas a un proceso de hidrlisis, donde estas son calentadas en una solucin de agua acidulada a pH 3 con cido ctrico, utilizando una relacin de volumen agua-cscara de 3:1 respectivamente. La mezcla acidulada se calent a 90C durante 80 min, transcurrido el tiempo de calentamiento se separ el extracto pectnico y el bagazo gastado por medio de un escurrimiento y prensado en liencillo, procurando que el bagazo quede bien seco. El tiempo de extraccin es un 5/2/12

Anlisis de la calidad de pectina obtenida

Previo

al anlisis qumico experimental se procede a realizar una prueba de identificacin de pectina que cumple los conceptos tericos del comportamiento regular de esta sustancia, dando lugar a una precipitacin de la pectina en presencia de alcohol y por otro lado una solubilidad y gelificacin en un medio azucarado. Siendo positivos los resultados del anlisis anterior, se procedi a realizarse el anlisis de calidad del extracto de pectina utilizando mtodos de determinacin de Grupos 5/2/12 Metoxilos y de cidos Galacturnicos (AG)