SEMINARIO 1 BIOLOGA CELULAR

ORGANIZACIN ESTRUCTURAL Y MOLECULAR DE LA CLULA MICROSCOPIA Y METODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA

Los seres vivos presentan una gran diversidad... ...incluso dentro del Reino Animal.... Escherichia coli Fuji velvia ...y dentro de los Vertebrados Gallus gallus Ginkgo biloba Xenopus laevis

Agaricus campestris

Homo sapiens

Argiope lobata

Trypanosoma cruzi

Teora celular
(Schleiden y Schwann, 1839)

La clula es la estructura ms simple que posee las propiedades que caracterizan a los seres vivos Son capaces de extraer, transformar y utilizar la materia y la energa almacenada en las molculas que se encuentran en su entorno Todos los seres vivos estn formados por una o ms (metabolismo) clulas Pueden reproducirse y autoensamblarse, generando copias de s mismos

Niveles SUB-ATMICO de organizacin de la materia C de una serie de niveles de organizacin En cada nivel aparecen nuevas O MOLECULAR integrados propiedades (propiedades M emergentes), que constituyen un P MACROMOLECULAR salto cualitativo respecto del nivel L MACROMOLECULAR anterior E COMPLEJO J CELULAR I En ese sentido, entendemos a la D TISULAR vida biolgica como un conjunto de A propiedades emergentes a partir D RGANOS del nivel de organizacin celular.
SISTEMAS DE RGANOS

ATMICO Las propiedades de los seres vivos resultan

...

SUB-ATMICO ATMICO

Las estructuras de los niveles ms bajos ...por eso se utilizan las siguientes tienen dimensiones muy pequeas.... unidades mtricas...

C O MOLECULAR M P MACROMOLECULAR L MACROMOLECULAR E COMPLEJO J CELULAR I D TISULAR A D RGANOS

SISTEMAS DE RGANOS

10-10 m

1 nm

10-9 m

1 m 1 mm

10-6 m 10-3 m

...

Nivel de Organizacin Celular

El estudio de las clulas

membrana plasmtica

nucleolo

ncleo

REG

mitocondria
Aparato de Golgi

REL

Ultraestructura: Microscopa electrnica

Procarionte
Ncleo Citoesqueleto Ausente Ausente

Eucarionte
Presente Presente

Sistema de Endomembranas
Dimetro ADN

Ausente
< 1m Circular-Desnudo

Presente
10-100 m Con histonas

Cromosomas
Endocits- Exocitocis

Varias copias de un cromosoma

Ausente Presente

Distinto nmero de cromosomas/especie

Presente Slo en plantas (Celulosa) y Hongos (Quitina) 80S (40S y 60S)

Pared Celular
Ribosomas 70S (30S+50S)

 Dado que las dimensiones de la mayora de las clulas y de todos los organoides estn por debajo del lmite de resolucin del ojo humano, es necesario emplear instrumentos para su visualizacin. El microscopio ptico nos permite ver las clulas y tejidos (LR= 0,25 um) El microscopio electrnico nos permite estudiar la ultraestructura de las clulas (ej. visualizar membranas, organoides, inclusiones y detalles de todos ellos).(LR=2 a 5 Angstroms)

Unidades de medida que se utilizaran en el curso: 1 mm = 1000 m 1 m = 1000 nm 1nm = 10 ( m : micrmetro) ( nm : nanmetro) ( : Angstrom )

El microscopio ptico se basa en la utilizacin de la luz visible

Luz blanca
Distintas longitudes de onda Ondas electromagnticas Se desva en su trayecto al pasar por medios de distinto ndice de refraccin Al pasar por compuestos coloreados son absorbidos determinados rayos

Partes del microscopio

Estativo Pie Brazo Platina Tubo

Parte ptica :

Espejo Aparato de Condensador Iluminacin Diafragma Objetivo Ocular

Marcha de rayos Lado de la lente donde se ubica el objeto

Distancia Focal

Lado de la lente donde se forma la imagen

Centro de la lente

objeto

Punto focal Imagen

Eje ptico

Punto focal objeto Lente biconvexa

Lente objetivo

Objeto a una distancia mayor que la distancia focal

Formacin de la imagen en el objetivo:

Algunos principios de ptica

La imagen : se forma por interseccin de rayos: por eso es real Tambin es invertida

1) Todo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva al atravesarla 2)Todo rayo que corre paralelo al eje ptico
Cuando atraviesa la lente pasa por el punto focal imagen

3) Todo rayo que pasa por el punto focal objeto Cuando atraviesa la lente corre paralelo al eje ptico

* Puede considerarse esta lente como el objetivo del microscopio (en realidad son varias lentes) .

*La flecha verde(objeto) es equivalente a una estructura del preparado.

*La lente objetivo tiene distancias focales menores que las distancias Focales del ocular

Entonces .....

La imagen de la lente objetivo cae dentro de la distancia objeto focal del . ocular

Lente objetivo Lente ocular Formacin de la imagen del ocular:

La imagen se forma por proyeccin de rayos: por eso es virtual

1) Todo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva al atravesarla 2)Todo rayo que corre paralelo al eje ptico
Cuando atraviesa la lente pasa por el punto focal imagen.

3)Para obtener la imagen deben proyectarse los rayos

Lente objetivo Lente ocular

La imagen es mayor, virtual e invertida

 El aumento o magnificacin se obtiene multiplicando la magnificacin del objetivo por la del ocular. Ejemplos: Ocular y objetivo seco dbil.: 10X multiplico por 10X= 100X. Ocular y objetivo seco fuerte: 10X multiplico por 40X= 400X. Ocular y objetivo de inmersin: 10X multiplico por 100X= 1000X.

Clculo del aumento

Lmite de resolucin (LR) Es la distancia mnima que debe haber entre dos puntos de un objeto para que se visualicen como separados El LR del ojo humano es de 0,1mm

Si estos dos puntos estn separados por una distancia menor de 0,1 mm se vern como un solo punto
D

Indice de refraccin (IR) de un medio:

Relacin entre la velocidad de la luz en un determinado medio EJ : vidrio) y la velocidad de la luz en el vaco.
Cuando un rayo luminoso pasa de un medio de menor IR a uno de mayor IR se aproxima a la lnea normal

VIDRIO

AIRE

AIRE
VIDRIO

Cuando un rayo luminoso pasa de un medio de mayor IR a uno de menor IR se aleja de la lnea normal

Lmite de Resolucin (LR) del microscopio ptico Depende de * la longitud de onda utilizada () * el ndice de refraccin del medio (n) que se encuentra entre la lente objetivo y el preparado (n)

LR =

0.61 x n x sen

0,61

=
AN

Objetivo

AN : Apertura numrica n.: .ndice de refraccin del aire = 1 (que est entre el preparado y la lente objetivo)

longitud de onda (Luz blanca:550 nm) = semingulo de apertura.

Preparado

LR = 0,25m (microscopio Optico )

La frmula de LR tiene un significado fsico: Seala: 1) El LR es directamente proporcional a La (a mayor implica mayor LR y a menor Menor LR).

2) El LR es inversamente proporcional a
La AN que depende del n (ndice de refraccin Del medio) (a mayor n implica menor LR y a Menor n implica mayor LR)

Poder de resolucin(PR) : es el poder tiene un microscopio de Resolver dos puntos cercanos del objeto como diferentes
Como concepto: Poder de resolucin es la inversamente proporcional al Limite de resolucin

Es decir, a mayor LR implica menor PR y a menor LR implica Mayor PR. Pero : no se puede calcular el PR invirtiendo la frmula matemtica!

Cmo se puede mejorar el Poder Resolutivo del MO? Se logra un mayor PR si se obtiene un menor LR. Para ello: LR =
0.61

n x sen
X

1)

: Utilizando filtro azul

se aproxima a los 400 nm

Objetivo Este rayo no contribuye a formar la imagen

2)

Aire

n=1

Objetivo

Aceite de inmersin

Utilizando aceite de inmersin n =1.52

El rayo entra dentro de la lente objetivo y contribuye en la formacin de la imagen

Hepatocitos observados con el MO. Tcnica de H&E.

Epitelio intestinal observado con el MO. Tcnica de coloracin H&E.

Tipo de Microscopios pticos segn el nmero de oculares

Monoculares Binoculares Trinoculares (generalmente el tercer ocular es para adaptar una cmara fotogrfica, de video o una salida de seal que puede ir a un Analizador de Imgenes.

Tipos de microscopios pticos segn iluminacin:

Campo claro Campo oscuro Luz polarizada Contraste de fase Contraste diferencial de interferencia (Optica Nomarsky) Fluorescencia Confocal Invertido. De proyeccin.

 Se ilumina el objeto de forma oblicua usando un condensador especial. Slo la luz que impacta oblicuamente al objeto entra al objetivo. Empleo de objetivos de baja AN (<1.1) Permite visualizar objetos que pueden ser de dimensin menor que la resolucin que corresponde a la AN si la intensidad de luz es elevada. El objeto se ve brillante sobre fondo oscuro. Se ven contornos o bordes, no se ve estructura interna. Sirven para ver objetos que con campo claro no se ven por falta de contraste. Ventaja: Pueden distinguirse, aunque no resolverse, estructuras que no se distinguen con el MO comn. Pueden visualizarse clulas vivas

Microscopio de campo oscuro

Microscopio de contraste de fase

Convierte las cambios de fase en variaciones de intensidad. Diafragma anular y placa de fase en el objetivo (anillo transparente). Imagen intermedia formada por interferencia de todos los rayos 1/2 long onda de dif: anula 1 long onda de dif: suma

Ventaja: estudio de clulas vivas.

Microscopio de interferencia - Se hacen visibles las diferencias de velocidad que sufren los rayos luminosos al atravesar un objeto transparente: como diferencias de intensidad o de coloracin. - Aspecto de relieve. - Luz blanca polarizada (polarizador). - Divisin del rayo en dos haces paralelos (prisma de cuarzo) - Colector de rayos - Analizador - Interferencia entre ambos haces: diferencias de fase se convierten en diferencias de intensidad y cambios de color - Ventajas: las del microscopio de contraste de fase y se puede cuantificar el espesor del corte y cambios en el ndice de refraccin

Microscopio de polarizacin
Consta de: Un polarizador: est debajo del condensador. Un analizador: Encima de las lentes objetivos. Cuando estos estn cruzados no hay transmisin de luz polarizada.
Rotar el objeto para encontrar el brillo mximo o mnimo. fibras colgenas, fibras musculares estriadas, mielina, cristales

Propiedades de la fluorescencia
Las molculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda ms larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a travs de un filtro que slo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad caracterstica de la molcula fluorescente utilizada

Microscopio confocal
Permite que slo observemos el plano que est situado en el punto de foco del sistema ptico eliminando, de forma ptica a travs de un diafragma o "pinhole", la luz proveniente de los planos que estn fuera de foco. Este principio fu descrito por Minsky en los aos 50, pero es a partir de los 80 cuando se empieza a extender su uso.

Microfotografamitocondias electrnica Ultraestructura: REG de un hepatocito nucleolo ncleo Microscopa electrnica

El estudio de las clulas

membrana plasmtica

nucleolo

ncleo

REG

mitocondria
Aparato de Golgi

REL

La mayora de los estudios sobre la fisiologa celular requieren para su anlisis el aislamiento del componente Fraccionamiento subcelular celular a ser analizado

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS 1- Ruptura de las clulas
Homogenizadores. Se rompen las clulas
con la ayuda de un mbolo rotatorio que se Conjunto de mtodos gruesasncleos tienen como objetivo ajusta perfectamente a las y tcnicas que de paredes un tubo de cristal especial. obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado mitocondrias

microsomas Sonicacin. Consiste en la aplicacin de

ultrasonidos a una suspensin celular. La ribosomas intensa agitacin producida destruye las membranas celulares.

componente celular.

citosol

homogenato celular Uso de detergentes que solubilizan las membranas celulares.

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS 2- Separacin de componentes
Centrifugacin

La separacin de partculas u organelas que no presentan una tendencia a sedimentar espontneamente, requiere aumentar la fuerza gravitatoria a travs de la centrifugacin .
refrigeracin vaco

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS 2- Separacin de componentes

rotor centrfuga

Fraccionamiento subcelular
ETAPAS 2- Separacin de componentes Centrifugacin diferencial
La velocidad de sedimentacin de cada partcula Mediante centrifugaciones es proporcional a su crecientes en correlativas y tamao, sobrenadante es proporcional a velocidad, se logran la densidad de la partcula aumenta al incrementarse la fuerza separar los principales gravitatoria celulares componentes
sedimento o pellet

Fraccionamiento subcelular
por centrifugacin diferencial

1.000 g 10

20.000 g 20 pellet: clulas enteras, ncleos.

homogenato

pellet: mitocondrias, lisosomas, peroxisomas

80.000 g 1h sobrenadante: citosol pellet: ribosomas, grandes macromolculas

100.000 g 3h
pellet: microsomas

Gradiente de sacarosa

Fraccionamiento subcelular
por centrifugacin diferencial
Cmo se confirma el xito de la tcnica?

Determinando actividades enzimticas especficas de una organela

Verificando la morfologa mediante microscopa electrnica