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CLONAJE MOLECULAR
1- Enzimas de Restricción
2.- Otras enzimas
B. Paz
2011-I ( Ing. Biotecnológica)
MAPA DE RESTRICCION DEL pBR
322
OTRAS ENZIMAS USADAS EN
CLONAJE MOLECULAR
Recomendaciones para su uso:
Nunca usar una de estas enzimas en una
reacción que contiene < 0.1 mg/ml de proteína.
En estos casos usar BSA
Trabajan eficientemente sólo cuando la
concentración de sustrato es la adecuada. Tratar
siempre de trabajar a concentraciones cercanas a
la Km.
Usar el pH, Temperatura y los requerimientos
iónicos que les corresponde
RELACION DE ENZIMAS(I)
DNA POLIMERASAS:
DNA POLIMERASA I (Holoenzima)
FRAGMENTO KLENOW DE LA DNA POL I
DNA POLIMERASA DE T4
DNA POLIMERASA DE T7
Taq DNA POLIMERASA
TRANSCRIPTASA REVERSA
DNA POLIMERASA TRANSFERASA TERMINAL
RELACION DE ENZIMAS (II)
RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES:
LIGASAS
QUINASAS
FOSFATASAS
RELACION DE ENZIMAS (III)
NUCLEASAS:
Nucleasa Bal 31
Nucleasa S1
Ribonucleasa A
Ribonucleasa T1
Desoxirribonucleasa I
Exonucleasa III
CARACTERISTICAS DE
LAS DNA POLIMERASAS
Son usadas en varias etapas del clonaje molecular
en donde se sintetiza DNA
La mayoría requiere de un molde y sintetizan un
producto complementario
Pueden también copiar RNA pero lo hacen con muy
poca eficiencia
Las más usadas son : DNA pol I, fragmento Klenow,
DNA pol T4, DNA pol T7, Taq polimerasa,
Transcriptasa reversa y DNA pol transferasa terminal
COMPARACION DE LA ACCION DE LAS DNA
POLIMERASAS
Exonucleasa
+ + - -
3’→ 5’
Actividad
RNAasa H
+ - - +
P.M.(Kd) 109 76 94 84 y 170
No Unid. 1 1 1 1y2
1.1 DNA POLIMERASA I
(Holoenzima)
Características:
1. Tiene una sóla cadena polipeptídica
2. P.M de 109,000
3. Actividad polimerizante 5’→ 3’
4. Actividad exonucleásica 5’→3’ y 3’→5’
5. Tiene actividad RNAasa H
DNA POLIMERASA I (Holoenzima)
USOS:
Marcación de DNA mediante “nick
translation”
Fue usada originalmente para copiar la
cadena complementaria del cDNA en el
clonaje del cDNA
Marcar el extremo 3’ del DNA
1.2 FRAGMENTO KLENOW
(Fragmento largo de la DNA de la DNA polimerasa I)
Características:
1. En 1970 Klenow y Henningsen mediante
tratamiento proteolítico limitado de la DNA pol I
obtuvieron un fragmento largo (PM 76000) que
mantenía la actividad polimerizante y
exonucleásica 3’→5’
2. Hoy día se le obtiene al tratarla con subtilisina o
mediante clonaje
3. Permite hacer algunos experimentos superando
los problemas de la acción exonucleásica 5’→3’
de la DNA pol I
FRAGMENTO KLENOW (USOS I)
USOS:
1. Llenar los terminales 3’ creados por la
digestión del DNA con las enzimas de
restricción. Generalmente FK trabaja con el
mismo tampón que el usado para la RE.
2. Marcar el terminal de un fragmento de
DNA usando dNTPs marcados con P-32.
3. Marca terminal en la cola 3’ del DNA
FRAGMENTO KLENOW (Usos II)
Usos:
4.- Sintetizar la hebra complementaria del
cDNA en experimentos de clonaje del
cDNA
5.- Secuenciación del DNA por el método de
Sanger (Método del dideoxi)
6.- En PCR
1.3 DNA POLIMERASA DEL
T4
CARACTERÍSTICAS:
1. A semejanza del FK la DNA polimerasa del
bacteriófago T4 tiene acción polimerizante
5’→3’ y acción exonucleásica 3’→5’, que es
más activa en el DNA de una hebra que el
de doble hebra.
2. La actividad exonucleásica de la DNA pol
del T4 es 200 veces más activa que la del
FK
DNA POLIMERASA DEL T4
USOS ADEMAS DE LOS SEÑALADOS
PARA EL FK:
1. Marcación de fragmentos de DNA para
pruebas de hibridización, pudiendo los
fragmentos ser convertidos en pruebas
específicas mediante el uso de enzimas de
restricción.
2. Extensión de primers oligonucleotídicos
mutagénicos que se han unido a moldes de
DNA de una sola hebra.
1.4 DNA POLIMERASA DEL
BACTERIOFAGO T7
CARACTERÍSTICAS
Es la DNA polimerasa que se induce después de la
infección de E. coli por el bacteriófago T7
Esta polimerasa se presenta como la unión de 2
proteínas, la proteína del gen 5 del T7 y la proteína
del hospedero tiorredoxina
Tiene actividad polimerizante 5’→3’, carece de
actividad exonucleásica 5’→3’; pero tiene una
actividad exonucleásica 3’→5’ mil veces más activa
que la del fragmento Klenow.
1.5 Taq DNA POLIMERASA
CARACTERISTICAS(I):
Es una DNA polimerasa (PM 94000)
CARACTERISTICAS (II):
En la incorporación de nucleótidos la enzima
trabaja mejor entre 75 a 80o C.
La actividad polimerizante se reduce a la
mitad a 60o C. y en 1/10 a 37o C.
Requiere de iones Mg
CARACTERISTICAS (I):
Se conocen dos formas comercialmente
disponibles de transcriptasa reversa (TR):
1. Una preparación obtenida del virus de la
mieloblastosis aviaria (AMV)
2. Una enzima aislada de una cepa de E. coli que
expresa una copia clonada del gen de la TR del
virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-
MLV)
TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERÍSTICAS (II):
Ambas enzimas carecen de actividad
exonucleásica 3’→5’
La aviaria (AMV) tiene 2 polipéptidos que
tienen tanto la actividad polimerizante y una
poderosa actividad RNAasa H.
La murina (Mo-MLV) es una simple cadena
polipeptídica (PM 84000), tiene actividad
polimerizante y su actividad RNAasa H es
más débil
TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERISTICAS (III):
La aviaria trabaja eficientemente a 42 o C., que es
CARACTERISTICAS (IV):
La enzima aviaria trabaja más eficientemente a pH
USOS:
1. Su principal empleo es en la transcripción del
mRNA en cDNA de doble cadena que puede ser
insertada en los vectores procarióticos; aunque
también puede ser usada tanto con DNA de una
hebra o RNA para pruebas usadas en
hibridización.
2. Para secuenciar DNA por el método del dideoxi
cuando las otras polimerasas están fallando.
- :
TRANSCRIPTASA REVERSA
PARA LA FABRICACION DE “PRIMERS”
PARA LA T.R., SE PUEDE USAR:
Oligo dT ( 12 a 18 nucleótidos)
Oligonucleótidos de secuencia al azar
Oligonucleótidos de secuencia definida
5’ SP6 GATCATCATCATCGAT C
PROMOTOR
3’ CTAGTAGTAGTAGCTAG
Mg2* RNA pol de SP6
rATP,rGTP,rUTP y rCTP ↓
5’ppp G A U C A U C A U C A U C G A U C
3. DNA LIGASAS
Las DNA Ligasas son enzimas usadas para
unir dos piezas de DNA
Las más usadas son:
DNA ligasa del bacteriófago T4
DNA ligasa de E. coli
DNA LIGASA
3.1 DNA LIGASA DEL BACTERIOFAGO T4
Polipéptido de 68 000 daltons de P.M. que cataliza la
formación de enlaces fosfodiéster entre el 3’ hidroxilo y el 5’
fosfato terminal en el DNA
USOS:
Unir moléculas de DNA con terminales cohesivos
CARACTERISTICAS
Se usa con mayor frecuencia la fosfatasa
alcalina bacteriana (BAP) y la fosfatasa
alcalina de intestino de ternero (CIP).
Catalizan el retiro del residuo 5’ fosfato del
DNA tanto del RNA, DNA y de rNTPs y
dNTPs
FOSFATASAS ALCALINAS
USOS:
Retiro de los fosfato 5’ del DNA y
CARACTERISTICAS:
BAL 31 es predominantemente una exonucleasa
3’ que retira mononucleótidos de ambos extremos
3’ de las dos hebras del DNA.El DNA de una
hebra que va dejando es degradado por su
acción endonucleásica
La reacción es estrictamente dependiente de
calcio y por lo tanto puede ser detenida en
cualquier momento por la adición de agentes
quelantes del Ca como el EGTA
NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31
USOS:
Remoción de nucleótidos del extremo terminal
2Vmáx . Mn
V = ---------------------------
( Km + (S))
OBSERVACION IMPORTANTE:
Cuando los productos de la digestión de Bal 31 serán
ligados, se debe tener muy en cuenta que la actividad
exonucleásica 3’ de la enzima es 20 veces más
eficiente que la actividad endonucleásica.
Lo anterior determina que el tratamiento con DNA
polimerasa de T4 o el fragmento Klenow deben ser
usados para digerir las colas de una hebra que van
quedando.
Almacenar la enzima a cero grados, no congelada.
ACCION DE LA NUCLEASA BAL 31
5’ ----------------------------- 3’
3’ ----------------------------- 5’
↓
------------------
------------------
↓
-------
------- (10 A 20% )
NUCLEASA S1
CARACTERISTICAS:
La nucleasa S1 degrada DNA y RNA de
hebra simple para dar nucleótidos 5 fosfato
( dN ó rN)
Los DNA y RNA de doble hebra y los
híbridos DNA-RNA son relativamente
resistentes a la enzima; pero esto se supera
cuando se usan concentraciones grandes
de la enzima
PROTECCION DEL ADN CON NUCLEASA S1
RIBONUCLEASA A DE PANCREAS
DE BOVINO
CARACTERISTICAS:
RNAasa A es una endorribonucleasa que ataca
especificamente RNA de una hebra en el extremo 3’ de
sus nucleótidos pirimidínicos, rompiendo la unión del
fosfato al nucleótido adyacente
Sus productos son nucleótidos pirimidínicos 3’ fosfato y
oligonucleótidos con terminal nucleotídico pirimidínico 3’
fosfato
La RNAasa A es DE BOVINO
activa en ausencia de cofactores y
cationes divalentes; pero es inhibida por el inhibidor
placentario de la RNAasa o por los complejos vanadil
ribonucleósidos.
USOS
Retiro de regiones no hibridizadas de RNA en los
híbridos DNA-RNA
RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus
oryzae)
CARACTERISTICAS
RNAasa T1 es una endorribonucleasa que ataca
especificamente ataca los grupos 3’ fosfato de los
nucleótidos de guanina y rompe el enlace 5’ fosfato al
nucleótido adyacente.
Los productos finales son guanosina 3’ fosfato y
oligonucleótidos con terminal en guanosina3’ fosfato.
5’ p----------------------------------OH 3’
3’OH------------------------------P 5’
↓
EXONUCLEASA III
(E. coli )
ACTIVIDAD:
5’ p----------------------------------OH 3’
3’OH------------------------------P 5’
↓
5’P---------------------OH 3’
3’OH--------------------P 5’
+ 5’pN OH