UNIVERSIDAD NACIONAL DE

ESCUELA PROFESIONAL DE

CAÑETE
AGRONOMÍA
Potencial de dos cepas de Bacillus antagonistas para el

control biológico del moho gris

Rojas Manrique, Carlos Antonio. Ramos Huamán, Robin Guillermo. Álcala Bautista, Dayana.
 Introducción

La mayoría de los cultivares de uva utilizados en

la producción de vino son susceptibles al ataque
de patógenos y requieren múltiples tratamientos
estacionales con fungicidas

Los usos de estos químicos tienen sus limitaciones, lo que ha fomentado la

consideración de estrategias de control biológico contra enfermedades y la

inducción de resistencia de los cultivos utilizando microorganismos no

patógenos asociados con enfermedades de las plantas

Objetivos
1.-Evaluar el potencial de dos cepas antagonistas de
Bacillus para el control biológico del moho gris.

2.-Evaluar la resistencia sistémica inducida (ISR)

como mecanismo de control biológico de B.
cinerea por las dos cepas bacterianas.
Materiales y métodos
Cultivos de hongos y bacterias

B. cinerea Pers. se aisló de hojas infectadas de vides en Túnez y se

identificó por sus características morfológicas. El hongo se cultivó de
forma rutinaria en medio de agar papa dextrosa (PDA) a 20°C. Se
rasparon suavemente los conidios con un cepillo a partir de cultivos de
8 días, se suspendieron en agua destilada y se diluyeron a 105esporas
ml –
Los aislados bacterianos B29 y B27 habían sido previamente aislados
en suelos salinos del sur de Túnez. Estas bacterias fueron cultivadas de
forma rutinaria en agar nutritivo a 30°C.
Tratamiento de la vid con aislados de Bacillus y desafío con Botrytis
cinerea

Se aplicó un "tratamiento inductor" con las cepas de Bacillus en plantas

de vid cultivadas en un invernadero a una sola hoja situada en una
posición central del sarmiento. Las inoculaciones de desafío con B.
cinerea se aplicaron 2 días después a las hojas tratadas. También se
inocularon doce hojas no tratadas como controles. Las muestras de
hojas tomadas incluyeron las hojas tratadas y también las hojas
inmediatamente adyacentes en la dirección del tronco y en la dirección
de la punta del sarmiento.
Actividades de peroxidasa y lipoxigenasa

La actividad de la peroxidasa se analizó con un

espectrofotómetro a 470 nm según el método descrito por El
Hadrami . La actividad de la lipoxigenasa se midió según el
método de Axelrod.
 
Secuenciación del gen 16S rDNA de los aislados de Bacillus

Se realizó un análisis de la secuencia del gen 16S rDNA de las cepas de Bacillus. El ADNr 16S se
amplificó mediante el método PCR con la ADN polimerasa Taq y los cebadores 27fy 1492r . Las
condiciones de los ciclos térmicos fueron las siguientes: desnaturalización del ADN diana a 98°C
durante 3 minutos, seguida de 30 ciclos a 94°C durante 1 minuto, recocido del cebador a 53°C
durante 1 minuto y extensión del cebador a 72°C durante 5 minutos. Al final de los ciclos, la
mezcla de reacción se dejó a 72°C durante 5 minutos y luego se enfrió a 4°C. La amplificación de
la PCR se detectó mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizó mediante fluorescencia
ultravioleta (UV) tras la tinción con bromuro de etidio. El producto de la PCR obtenido también se
envió a GenomExpresspara la determinación de la secuencia. El análisis de las secuencias se
realizó utilizando el software blast en el servidor del NCBI. Todas las secuencias analizadas se
depositaron en la base de datos GenBank.
Resultados
Las vides son muy sensibles a los ataques de hongos, como el moho
gris causado por B. cinerea. Los métodos actuales de control de
enfermedades se basan principalmente en compuestos químicos, pero
los efectos negativos sobre el medio ambiente y los seres humanos que
se asocian con estos fungicidas han llevado a un creciente interés en
otros métodos de control, como biocontrol lógico mediante el uso de
microorganismos beneficiosos.

Actividades microbiológicas

El estudio informado investigó dos nuevas cepas de Bacillus spp., B27

y B29, que habían sido seleccionados previamente y resultaron
altamente efectivos in vitro contra B. cinerea.
Efecto de biocontrol de dos cepas

Pretratamiento de plantas de vid con cepas de Bacillus B27 y/o B29 significativamente reducción
de la infección por B. cinerea inoculado 2 días después.

Tabla 5.1. Actividad antimicrobiana de Bacillus spp. cepas B27 y B29.

  Diámetro de inhibición (mm)
Microrganismo B27 B29

Bacterias Gram -positivas    

Micrococcus luteus CIP A270 24,25 ± 0,85 25 ± 0,00

Bacterias Gram-negativo    
Escherichia coli CIP 102400 20,5 ± 0,50 21,75 ± 0,75
Pseudomonas aeruginosa CIP 100720 20,5 ± 0,50 21,25 ± 0,47

Levadura    
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9226 22,5 ± 0,28 24 ± 0,40

Hongos filamentosos    
Mucor ramannianus NRLL 1829 17,25 ± 0,28 19,25 ± 0,47
Botrytis cinérea 21,75 ± 0,62 24 ± 0,40
Inducción de resistencia sistémica por dos cepas antagónicas

En el estudio se demostraron algunos de los medios por los cuales los dos antagonistas
bacterianos fueron capaces de inducir mecanismos de defensa de la vid y así permitir una
mayor resistencia a la infección por B. cinerea.
Identificación molecular y análisis filogenético de bacterias.

Según la homología de
secuencia y el análisis
filogenético, la cepa B27 resultó
ser una cepa de Bacillus
(número de acceso 1104513.1),
que está estrechamente
relacionada a Bacillus sp. Z19
(EU236746.1). Se encontró que
la cepa B29 era una cepa de
Bacillus (número de acceso
1104513.2), que estaba
estrechamente relacionado con
la cepa B. amyloliquefaciens
EXWB3-03 (EU334107.1)
Conclusión
1.- El trabajo que se ha informado aquí muestra el potencial de dos nuevas cepas
de Bacillus spp. aislado del sur de Túnez para aliviar la infección de las vides
mediante B. cinerea a través de actividades de control biológico directo y
mediante la inducción de un fenómeno ISR. Además, ha demostrado la taxonomía
de estos dos miembros de las Bacillaceae, un requisito previo para comprender
mejor el potencial de estas nuevas cepas para reducir enfermedades patógenas.
Gracias