Inmunofluorescencia

Propiedad de algunas sustancias

Luminiscencia o fotoluminiscencia: Almacenar energía luminosa y

liberarla posteriormente como energía luminosa

Fosforescencia: Períodos de almacenamiento largo con emisión mucho

después de cesada la excitación

Fluorescencia: Períodos de almacenamiento cortos 10-7 – 10-9 seg y

emisión
 Fluorescencia
Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas (fluoróforos)

1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente

externa a un fluoróforo que absorbe, pasando a un estado
Diagrama Jablonski electrónico excitado S1’

2°: Duración del estado excitado: existe por un período de

tiempo finito (típicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios
conformacionales y puede interaccionar con su ambiente
molecular. Consecuencias: La energía de S1’ es parcialmente
disipada produciendo un estado excitado relajado desde el
que se emite la fluorescencia; no todas las moléculas
inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por
fluorescencia, existen otros procesos.

3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel
S0. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado, la energía de este fotón es
menor.
La diferencia de energía es llamada “Stokes shift” (hνEX – hνEM) que es fundamental para la
sensibilidad de las técnicas de fluorescencia, ya que la emisión del fluoróforo permite
distinguirse del background.
 Espectro de Fluorescencia

El mismo fluoróforo puede ser repetidamente

excitado y detectado. Para moléculas poliatómicas
en solución las transiciones electrónicas son
reemplazadas por un espectro de energía llamado
espectro de excitación de fluorescencia y de
emisión. El ancho de banda del espectro es un
parámetro importante para cuando dos fluoróforos
son detectados simultáneamente.

El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se

excita. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud del espectro de excitación a la
longitud de onda de excitación.

Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras
radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo.
Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están próximos (
más cortas y  más largas respectivamente). Esto es importante en la elección de los filtros.

La intensidad de la señal depende de los mismos parámetros que la absorbancia, aunque

también de la fuente de excitación (comúnmente un láser de ion argón, longitud de 488 nm) y
de la eficiencia de recolección del detector.
Las muestras biológicas marcadas con fluorescencia contienen típicamente más de una especie
fluorescente, haciendo que el aislamiento de la señal sea compleja. Otras señales ópticas (como
S2) quizás correspondan al background o a una segunda sonda fluorescente.

La detección de autofluorescencia puede ser minimizada por la selección de filtros adecuados

que reduzcan la transmisión de E2 respecto de E1.

Quenching de fluorescencia
En muestras biológicas el fluoróforo está en solución y puede interaccionar con otras
moléculas. Como consecuencia de esta interacción se puede producir una perdida de emisión
fluorescente. Es un proceso de desexcitatción no radiativa provocado por una molécula ajena al
fluoróforo (compuestos no fluorescentes), que recibe el nombre de quencher. Al proceso se lo
denomina "quenching" de la fluorescencia
 Fluoróforos
Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliarómaticos: moléculas rígidas
(varios niveles a los cuales pueden ser excitados; en el retorno, al no rotar no emite calor y sí luz)

Rodamina 6G
Rodamina B

Isotiocianato
fluoresceína

Fluoresceína

Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos; si se utilizan

dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión, se pueden
medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).
 Microscopía de fluorescencia

La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve

a través de un filtro excitador que sólo permite que pase la
radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta
radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada
por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas
fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por
fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor.
Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a
través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de
barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia
de la radiación de excitación.

Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no llegue al
ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.
Filtros:Excitador: Transparente a  cortas bloqueando  más largas. Barrera: Transparente a
 largas bloqueando  cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.
 Inmunofluorescencia

Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este

conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de
microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva
y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de
inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que
cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia

Clínica (Diagnósticos)
Utilidades
Investigación (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia)

Conjugación: Tendremos Ac marcado con fluoróforo y fluoróforo libre.

¿Cómo separamos?

Mediante tamiz molecular o diálisis

Principios generales de marcación de anticuerpos por sustancias fluorescentes

Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados
Un buen conjugado debe tener: Fluorescencia intensa
Reacción específica con los antígenos
Depende de: Calidad y concentración de los Acs en el suero
Propiedades de la sustancia fluorescente
Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople
También influyen: Intensidad de marcación
Homogeneidad de marcación
Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas
Anticuerpos

Para mayor especificidad utilizar antígenos puros para inmunizar

Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales
Purificar la fracción de Ig a marcar
Verificar título de anticuerpos
Existe un estrecho paralelismo entre título precipitante y fluorescente
Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.
 Fluorocromos

El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtración en geles. Disponibilidad filtros

Intensidad de marcación

Fluorocromo puede ser conjugado en un número variable a cada molécula de proteína,

resultando diferentes grados de marcación.
Mayor intensidad de marcación, mayor intensidad

Marcación excesiva:
Disminución del PI de las proteínas
Alteraciones en las propiedades inmunológicas de los anticuerpos (6 ó 7 moléculas de
fluoresceína/ molécula de Ac es el límite máximo)
Quenching de fluorescencia (disminución del rendimiento de emisión)

Homogeneidad de marcación

Altamente marcadas: Fluorescencia inespecífica

Medianamente marcadas: Resultados más satisfactorios
Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa
 Elección de marcado
para inmunoensayos

Marcado Método de Ventajas Desventajas

detección

Enzimático sustratos Vida media alta. Múltiples pasos.

cromogénicos Alta sensibilidad Enzimas endógenas
detectados por abs

Biotina Avidina/ Vida media alta. Múltiples pasos.

Estreptavidina Alta sensibilidad Biotinas endógenas.
acoplada a Detección universal
marcadores
Fluorescencia Excitación en UV y Vida media alta Autofluorescencia
emisión en el visible Alta resolución quenching
detección en micro
fluorescencia

Sensibilidad
Método enzimático Método fluorescencia
Resolución
 Biotina/Avidina (o estreptavidina)

Avidina PI 10 (muy reactiva); estreptavidina, menos inespecificidad

Avidina/estreptavidina se marcan
Ac se purifica Conjugación a biotina con fluoróforo o enzima

Ac 2° conjugado a biotina estreptavidina Enzima biotinilada

AP
AP

AP

Para tejidos que expresan biotina: Agregar estreptavidina al tejido + Enzima biotinilada
(debería dar negativo)
Bloqueo con avidina + 3 biotinas en tejidos que expresan y luego inicio con Ac 1°
 Enzima Ventaja Desventajas Recomendado

Peroxidasa de Buenos conjugados Actividad endógena Inmunohistoqca e

rabanito Sensible en células de sangre inmunoblots
y médula. Sustratos (sustratos
Varios sustratos
solubles sensibles a insolubles: DAB)
disponibles
luz Inmunoensayos
(solubles: OPD)

Fosfatasa Alcalina Sensible Actividad endógena Inmunoensayos

Se conjuga fácil en algunos tejidos (PNPP)
Inmunoblots (BCIP)

β-Galactosidasa Muy baja actividad Se inactiva fácil Cuando actividad

endógena. Sustratos Menos sustratos endógena es un
solubles e insolubles disponibles problema persistente
Sensible

Bloquear actividad endógena: pre tratamiento con peróxido de hidrógeno;

levamisole (I! de fosfatasas)
 Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia
directa indirecta
Utiliza un solo anticuerpo Utiliza un 2° anticuerpo conjugado

Anticuerpo 2°

Anticuerpo 1°
Anticuerpo 1°

Antígenos Antígenos

Ventajas Se necesitan pocos pasos El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para

distintas reacciones
Menos problemas de background
Son comerciales
Posibilidad de doble marcación
Se evita la disminución de afinidad del Ac 1°

Desventajas Menor sensibilidad (nec. mucho Ac 1º)

Señal poco amplificada Se necesitan muchos pasos de tinción
Es necesario purificar el Ac Con ag múltiples se necesita que los Ac
1º sean de distintas especies
El Ac puede perder afinidad
 Ac Policlonal Ac Monoclonal Pool de Ac
monoclonales

Fuerza de señal Excelente Regular a Buena Excelente

Especificidad Buena, pero a veces Excelente pero con Excelente

el background es posible reacción
alto cruzada

Ventajas Señal fuerte Específico Señal fuerte

Específico

Desventajas No renovable Baja señal Disponibilidad

Background
Se necesita titular
 Algunos ejemplos…

Método Puente: PAP Método Puente de Igs

(perpxidasa anti
peroxidasa)

3° Capa: complejo
PAP de la especie A 3° Capa: Inmunoglobulina
2° Capa: Ac
antimarcador obtenida en A
contra Ig de A
2° Capa: Ac
contra Ig de A

1° Capa: Ac contra
1° Capa: Ac contra x en especie A
x en especie A

Es una reacción Ag/Ac, evita

modificación de Ac por acople
 Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia
de superficie citoplasmática

- Lavado de células - Lavado de células

-Bloqueo con suero normal de la especie del -Resuspender el pellet y hacer frotis
Ac 2°
- Secar y fijar con metanol frío 30’
- Agregado de Ac 1° e incubación
-Hidratar los portas en PBS 30’
- Lavados
-Bloqueo con suero normal de la especie del
- Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e Ac 2°
incubar
- Agregado de Ac 1° e incubaciónen cámara
- Lavados húmeda
- Resuspender el pellet - Lavados en Koplin
- Hacer el frotis en porta - Agregar el Ac 2° conjugado a fluorocromo e
incubar en cámara húmeda
- Secar y fijar con metanol frío 30’
- Lavados
-Montar con PBS

Importante: Permeabilizar
Tb se fija con formamida y se permeabiliza con Tritón X100
 Controles????

- Excluir Ac 1°: Especificidad del Ac 2°

- Control negativo :Utilizar células o tejidos que no expresen el antígeno
- Revelado con suero normal 1°
- Medición de fluorescencia endógena
- Medición de fluorescencia de un tejido o células que expresen el antígeno
- Control positivo: desplazar el Ac 1° por agregado de antígeno libre
- Control isotipo: Ac (IgG) no específica

Bloqueos con proteínas no relacionadas o con suero normal

 Doble marcación

Que no están superpuestos: combinar la marca o

el sistema de detección
Detecta dos antígenos diferentes
Cuidado con reacción cruzada
Que están superpuestos: combinar dos fluorocromos
Marcando los Ac 1° (utilizar Ac Mo) (Fluoresceína + rodamina)
Reactivos de distinta especie, clase o subclase. 2° anti especie
Reacciones secuenciales (hay reasociaciones y no disociaciones)