UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE

HUAMANGA
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGIA
EFP. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
EFECTOS DE HIERRO FUENTE DE HIERRO DISPONIBILIDAD
DE CASEÍNA Y CASEÍNA FOSFATO PÉPTIDOS

INTEGRANTES
• ALCANTARA PAREDES Luis Alberto.
• ESCUDERO GUERRERA Alex.
• FLORES ATAUCUSI Sergio.
• QUISPE FLORES Adalina.
• QUISPE TECLLASUCA Santos Fredy.
 RESUMEN
La disponibilidad de hierro de FeSO4 en muestras que contienen caseinato de
sodio, fosfopéptidos de caseína o concentrado de proteína de suero, y de citrato
férrico (Fe-CA) en muestras que contienen SC o CPP se midió utilizando una
digestión invitro / modelo Caco-2 de cultivo celular. En FeSO4 pinchos muestras,
disponibilidad relativa era CPP> SC, CPP = WPC, y CPP = FeSO4 solo. En las
muestras que contienen Fe-CA, un quelato de hierro soluble, la disponibilidad
relativa del CPP = SC y CPP <sola Fe-CA. Estos resultados sugieren que la CPP
mejora la disponibilidad de hierro de los alimentos con baja disponibilidad, pero
no mejora y puede inhibir la disponibilidad de especies de hierro solubles.
Palabras clave: caseína, fosfopéptidos, la fosfatasa, la disponibilidad de hierro.
 INTRODUCCIÓN

DEFICIENCIA DE HIERRO

Sigue siendo un problema para los niños en Estados Unidos

y otros países industrializados. Actualmente, alrededor del
10% de los niños en los EE.UU. son deficientes de hierro. La
Academia Americana de Pediatría recomienda fórmulas
fortificadas de hierro para lactantes alimentados con biberón.
Sin embargo, la biodisponibilidad de hierro de fórmulas
infantiles es menor que el de la leche humana. Por lo tanto,
la práctica actual para satisfacer las necesidades de hierro
en lactantes alimentados con biberón es fortalecer fórmulas
con cantidades relativamente grandes de hierro, alrededor
de 12 mg de hierro/L. En contraste, las concentraciones de
hierro en "no adición de hierro" en fórmulas infantiles van
desde 1,3 a 4,6 mg de hierro en las concentraciones gama
leche humana de 0,2 a 0,8 mg de hierro/L
la
 adición de hierro a la fórmula infantil puede aumentar el crecimiento de los
dañinos bacterias, clostridios y enterococos, en la flora fecal de los bebés. La
mejora de la biodisponibilidad del hierro de la fórmula infantil podría disminuir
este riesgo ya que reduciría la cantidad de hierro que se necesita en la
fortificación.
Como la mayoría de las fórmulas infantiles son a base de leche y las fracciones

individuales de proteína de la leche difieren en sus efectos sobre la
biodisponibilidad de hierro, la comprensión de la interacción de proteínas lácteas
con hierro puede conducir a formas de mejorar la biodisponibilidad del hierro en
las fórmulas infantiles.
Las caseínas tienden a inhibir la absorción de hierro bajo ciertas condiciones;

Sin embargo, la hidrólisis de la caseína antes de la ingestión parece reducir esta
inhibición. Cuando la caseína se digiere con enzimas proteolíticas, se producen
péptidos que contienen residuos de fosfoserina en clúster. Estos péptidos se
denominan fosfopéptidos de caseína (CPP). Se ha demostrado que el CPP
mejora la disponibilidad de calcio y zinc; sin embargo, su esfuerzo defectos en la
absorción de hierro no han sido bien caracterizado. El CPP puede formar
complejos estables con el hierro férrico incluso a valores de pH tan bajos como
2,5.
 MATERIALES Y METODOS

 MATERIALES
 Reactivos, se obtuvieron las enzimas digestivas y hormonas
 La caseína y la disponibilidad de hierro.
 Fosfatasa intestinal de ternero soluciones alcalinas y cultivo de
células Preparaciones de péptidos y proteínas
 Caseinato sódico (proteína 92%),
 Concentrado de proteína de suero de leche (proteína de 80%),
 Fosfopéptidos de caseína (CPP-20: la proteína 87%, 20% como
fosfoserina agrupado péptidos)
 La caseína purificada fosfopéptidos (CPP-90: 90% como fosfoserina
péptidos agrupados).
 Toda la cristalería fue lavada con ácido y toda el agua se ioniza de
doble.
 EXPERIMENTO 1

LA DISPONIBILIDAD DEL HIERRO DE FESO 4 EN MUESTRAS QUE CONTIENEN CASEINATO DE

SODIO, FOSFOPÉPTIDOS DE CASEÍNA O PROTEÍNA DE SUERO CONCENTRADO.
La preparación de placas de cultivo celular. Células Caco-2 se obtuvieron
de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Md., EE.UU.) Las
células se sembraron a una densidad de 50.000 células /cm 2 en el
colágeno tratados placas de 6 pocillos y cultivadas en Dulbecco Modificado
Medio Eagle (DMEM) con un 10% (v/v) de suero fetal bovino, 25 mmol/L
solución de antibiótico-antimicótico HEPES y 1% (contiene penicilina,
estreptomicina y anfotericina B).
 El cultivo se mantuvo a 37ºC en una incubadora con un 5% CO2, 95%
atmósfera de aire a una humedad constante. El medio se cambió cada 2 a
3 días.
Experimentos de absorción de hierro se llevaron a cabo 13 días después
de la siembra. En el día del experimento, DMEM se retiró de cada pocillo
de cultivo y las monocapas celulares se lavaron dos veces con 37 °C
mínimo medio esencial (MEM).
Suplementado con tubos de 10 mmol/L de (piperazina-N, N'-bis ácido
2ethanesulfonic), 1% de solución de antibiótico-antimicótico,
hidrocortisona (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selenio (5 g/L),
triyodotironina (34 g/L) y factor de crecimiento epidérmico (un péptido
de 6 kD a partir de glándulas submaxilares de ratón funciones para
eliminar el requisito de suero; se añadió 20 g/L) a un pH de 7.
Después del lavado, 1 ml de MEM suplementado para cubrir las
células. Un anillo de inserción esterilizada, equipado con una
membrana de diálisis, se insertó en el pozo, creando así un sistema de
2 cámaras con una parte superior y una cámara inferior en cada
pocillo. El anillo de inserción se formó mediante el ajuste de la parte
inferior de un Transwell, anillo de inserción con una línea de corte
membrana de diálisis 15.000 de peso molecular se mantiene en su
lugar con un anillo de silicona.
Se esterilizó en etanol al 70% después se mantuvo en agua estéril
durante al menos 20 min antes de colocarlo en el pozo.
 SOLUCIONES DE ENZIMAS DIGESTIVAS

Soluciones de enzimas digestivas se prepararon inmediatamente antes de su uso.

Pepsina soluciones se prepararon disolviendo 0,2 g de pepsina en 5 mL de HCl 0,1
mol/L y la adición de 2,5 g de resina Chelex,-100 para eliminar el hierro
contaminación. Suspensiones pancreatina/biliares se prepararon mezclando 0,05 g
de pancreatina y 0,3 g de extracto de bilis con 25 ml de 0,1 mol/L de NaHCO3 en
un tubo cónico de 50 ml con tapón de rosca y la adición de 12,5 g de Chelex,-100.
Los tubos se taparon, colocado en una plataforma oscilante, fijado en 55
oscilaciones por minuto y se deja la mezcla durante 30 minutos. Chelex,-100 se
eliminó utilizando columnas de vidrio (pepsina: 0.7 cm en el diámetro, 15 cm de
longitud; Pancreatina mezcla/bilis: 1,0 cm D y 20 cm L). Un Además adicional 5 ml
de 0,1 mol/L de HCl y 10 ml de 0,1 mol/L NaHCO3 se añadió a la columna de
pepsina y pancreatina columna/bilis, respectivamente. Los volúmenes finales de
solución de pepsina y pancreatina mezcla/bilis fueron aproximadamente 8 ml y 27
ml, respectivamente.
 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

Una cantidad suficiente de fosfopéptidos de caseína (CPP-20 + Fe), caseinato de

sodio (SC + Fe) o concentrado de proteína de suero (WPC + Fe) para suministrar
0.225 g de péptidos o proteínas se dispersó en 10 mL de solución salina (140
mmol/L de NaCl; 5 mmol/L KCl) en tubos de 50 mL con tapón de rosca.
Las mezclas se calentaron a no más de 80 °C para facilitar la dispersión. Después
de enfriar, se añadió a una parte alícuota de una solución de 10 mmol/L de FeSO4
en HCl 1 mol/L. Una muestra fosfopéptido caseína que contiene sólo el hierro
intrínseco También se preparó (CPP-20). Con el fin de lograr un contenido de
hierro similares, era necesario el uso de aproximadamente 0,36 g de fosfopéptidos
de caseína para esta muestra frente a 0.225 g para la otra muestra con adición de
Fe. Isotónicas que contienen hierro solución salina, añade como FeSO4 en 1 mol/L
de HCl, (Fe) e isotónica salina que contiene hierro, añadido como FeSO4 en 1
mol/L de HCl y ácido ascórbico (AA + Fe; 1:20, Fe: ácido ascórbico) se prepararon
como el control y el control positivo del experimento, respectivamente. Las
muestras fueron formulados para contener 60 mmol de hierro/L y una proteína /
péptido a la proporción de hierro de aproximadamente 15 g a 3,4 mg a excepción
de CPP-20 que tenía una proporción de 15 g a 2,1 mg. Estas proporciones se
asemejan a las proteínas a las relaciones de hierro en "ningún hierro añadido"
fórmulas infantiles. En resumen, las preparaciones de muestras de este
experimento fueron Fe, Fe + AA, CMP + Fe, SC + Fe, CPP-20 + Fe, y CPP-20.
 EN LA DIGESTIÓN IN VITRO Y CACO-2 LA ABSORCIÓN DE HIERRO CELULAR

 Las muestras, en tubos de 50 ml a temperatura ambiente, se ajustaron

a pH 2 con HCl 1 mol/L. La mitad ml de solución de pepsina se añadió
a cada uno. Estos tubos de muestra se taparon entonces y se colocan
horizontalmente sobre una plataforma oscilante fijado en 55
oscilaciones por min dentro de una incubadora a 37 C. Después de
incubación durante 60 min, las muestras se ajustaron a pH 6 con 1
mol/L de NaHCO3 y se añadió una alícuota ml de la mezcla de
pancreatina / bilis 2.5. Las muestras se ajustaron a pH 7 y llevados a
volumen total de 15 ml con solución salina. A 1,5 ml alícuota de cada
muestra se colocó de forma aleatoria en la cámara superior de un
pozo. Las placas se cubrieron y se incubaron durante 2 h en una
plataforma oscilante fijado en 55 oscilaciones por min en una
incubadora a 37ºC y una atmósfera de CO2 al 5%. Después de 2 h, se
retiraron los anillos de inserción con las muestras en ellos.
Las cámaras inferiores fueron entonces suplementados con un
adicional de 1 mL de MEM y las placas se devolvieron a la
incubadora durante un adicional de 22 h. Esto permitió que el
tiempo para las células para sintetizar ferritina en respuesta al
hierro tomado del medio en la cámara baja.
Después del periodo de incubación 22 h, el medio en cada pocillo
se retiró y las células se enjuagaron con 2 ml de solución salina.
Dos mL de agua se añadieron a cada pocillo y las placas se
sonicaron en un sonicador de sobremesa que contiene agua con
hielo. Pocillos se rasparon con una punta de pipeta y suspensiones
celulares se transfieren junto con el 2 mL de agua a tubos de 15
mL tapado. Las suspensiones celulares se almacenaron a -20 C
hasta que se analizaron.
LOS ANÁLISIS
Concentraciones de ferritina de suspensiones celulares se
midieron con un ensayo inmunorradiométrico

LA CASEÍNA Y LA DISPONIBILIDAD DE HIERRO

Tabla de contenido 1-Hierro de cámaras superior e inferior,
y dializabilidad hierro para el Experimento 1

Dializabilidad
mg de hierro ± SEM Cámara baja
muestras Cámara alta Cámara baja Cámara alta
Fe 5.22 ± 0.12 0.11 ± 0.02 0.021 ± 0.004

WPC + Fe 5.59 ± 0.11 0.27 ± 0.01 0.048 ± 0.003

SC + Fe 5.15 ± 0.10 0.26 ± 0.04 0.049 ± 0.007

CPP-20 + Fe 4.14 ± 0.18 0.37 ± 0.04 0.089 ± 0.009

CPP-20 3.86 ± 0.08 0.36 ± 0.05 0.095 ± 0.013

Fe + AA 4.63 ± 0.09 0.44 ± 0.04 0.096 ± 0.010

1. Fe = FeSO4; WPC = suero concentrado de proteína; SC =
caseinato de sodio; CPP-20 = fosfopéptidos de caseína
(20% de los péptidos contienen fosfoserina clúster); AA =
ácido ascórbico.
2. La cantidad de hierro contenida en 1,5 ml de muestras en
la cámara alta antes de la incubación.
3. La cantidad de hierro en el medio de cámara inferior (2
ml) de la placa de 6 pocillos 2-cámara después de 2 h de
incubación en placas de compañía (placas sin células).
4. dializabilidad se calculó dividiendo la cantidad de hierro
en la cámara inferior después de la incubación de 2 h por
la cantidad de hierro en la cámara superior antes de la
incubación .

2, 3, 4 Los valores son medias errores estándar. Los valores

dentro de una columna que tiene en común no superíndice
son significativamente diferentes (P <0,05; prueba de
El contenido de hierro de las muestras y los medios de
cámara inferior de las placas de compañía se analizaron
como sigue. Las alícuotas de las muestras y los medios
de comunicación cámara inferior se secaron en un bloque
de calentamiento fijado en 100°C. Después, se añadió
solución 50/50 de HNO3 / HClO4 la temperatura del
bloque de calentamiento se elevó a 200°C. Cuando seca,
las cenizas fueron inspeccionadas para detectar la
presencia del color marrón. La digestión HNO3 / HClO4
se repitió hasta que la ceniza apareció incoloro. Las
cenizas se disolvieron en HCl concentrado y se diluyeron
con 5% HNO3 antes del análisis con un
espectrofotómetro de emisión de plasma de acoplamiento
inductivo.
EXPERIMENTO 2:
LA DISPONIBILIDAD DEL HIERRO A PARTIR DE CITRATO
FÉRRICO EN MUESTRAS QUE CONTIENEN CASEINATO DE
SODIO O PURIFICADA FOSFOPÉPTIDOS DE CASEÍNA CON
O SIN ADICIÓN DE FOSFATASA ALCALINA
Los métodos descritos anteriormente fueron seguidos con las
siguientes modificaciones.
Preparación de placas de cultivo celular con fosfatasa alcalina
intestinal de ternero añadió a la cámara inferior. Para cada placa
de 6 pocillos, se añadió fosfatasa intestinal de ternero activa (+
CIAP) de 3 pozos, mientras que los otros 3 (pocillos de control
designados "- CIAP") recibió CIAP inactivado por calor. La
inactivación de CIAP se llevó a cabo mediante la colocación de la
solución de enzima en un baño de agua hirviendo durante 5 min.
Inmediatamente antes de la colocación de un anillo de inserción
en un pozo, 10 ml (1 unidad) de CIAP en tampón de
desfosforilación, se añadió directamente en el 1 ml de MEM que
cubre la monocapa de células Caco-2.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Las alícuotas de una solución madre FeCl3 en 1% HCl y una solución de
ácido cítrico se mezclaron en tubos de 50 ml con tapón de rosca. A
continuación, 1 ml de una dispersión que contiene 0,01047 g de caseinato de
sodio o fosfopéptidos de caseína purificadas se añadió a estas mezclas de
citrato de hierro. Estas dispersiones se preparó en agua con calentamiento a
no más de 80°C. La combinación de la solución de hierro con estas
dispersiones dado lugar a una proteína / péptidos a la proporción de hierro de
15 g a 12 mg. Esta proporción se aproxima a la proteína a la proporción de
hierro que se encuentra en muchas fórmulas infantiles. Una muestra sin
proteínas o péptidos se preparó añadiendo 1 ml de agua a la mezcla de
citrato de hierro. Todas las muestras fueron llevados hasta 10 ml con solución
salina. Las muestras fueron formulados para contener 10 mmol / L de Fe y
200 mmol / L de citrato.
En la digestión in vitro y Caco-2 la absorción de hierro celular
Hubo 6 tratamientos para el experimento: 1) Fe-CA - CIAP, 2) Fe-CA + CIAP,
3) CPP-90 + Fe-CA - CIAP, 4) CPP-90 + Fe-CA + CIAP, 5) SC + Fe-CA - CIAP,
y 6) SC + Fe-CA + CIAP.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Un diseño de bloques al azar con el bloqueo de cada
repetición se utilizó en ambos experimentos. Cada
experimento se repitió al menos 4 veces, con cada
replicación llevado a cabo en un día separado. Los
duplicados se llevaron a cabo para todas las
repeticiones, y el promedio de los duplicados se usó
como el valor para cada replicación. Las medias se
compararon mediante la prueba de comparación
múltiple de Tukey cuando ANOVA fue significativa.
Las medias se llegó a la conclusión de ser
significativamente diferentes cuando p fue inferior a
0,05.
 Resultados y discusiones
EXPERIMENTO
 1:Las concentraciones de hierro en las muestras de
CPP-20 y CPP-20 + Fe fueron significativamente menores que en otras
muestras debido a los grandes volúmenes de soluciones ácidas y básicas
necesarias para ajustar el pH de estas muestras durante el proceso de
digestión en vitro.

Para ambas muestras, los volúmenes finales fueron aproximadamente 18

ml en lugar de los previstos 15 ml. El dializabilidad hierro de las muestras
(Tabla 1), expresada como una proporción de la concentración de hierro
en la cámara inferior de la placa acompañante a la cámara superior, fue
mayor en CPP-20 + Fe, CPP-20, y Fe + AA que en Fe, CMP + Fe, y SC +
Fe.

En
 este experimento, se encontró que la disponibilidad de hierro en la
presencia de fosfopéptidos de caseína (CPP-20 y CPP-20 + Fe) fueron
más altos que en presencia de caseinato de sodio (SC + Fe) (Figura 1).
 Debido a las diferencias en las concentraciones de hierro
entre las muestras (Tabla 1), la disponibilidad de hierro se
expresó como una proporción de la concentración de ferritina
(ng ferritina mg de proteína celular -1) a mg de hierro en la
cámara superior en el inicio de la incubación (Figura 1).
 La disponibilidad de hierro de CPP-20 muestras + Fe y CPP
fueron significativamente mayores que la disponibilidad de
hierro de SC + Fe pero no WPC + Fe. Hierro disponibilidad de
la control (FeSO4 solo) fue similar a la de SC + Fe pero fue
significativamente menor que CPP-20. El Fe + AA sirvió como
control positivo y no se incluyó en los análisis estadísticos. La
disponibilidad de hierro en la muestra AA + Fe (83,8 17,9 ng
ferritina mg de proteína celular -1 cámara superior mg Fe -1:
Mean SEM) fue de 4 a 10 veces más alta que otras muestras.
 En este experimento, se encontró que la disponibilidad de hierro en la
presencia de fosfopéptidos de caseína (CPP-20 y CPP-20 + Fe) fueron
más altos que en presencia de caseinato de sodio (SC + Fe) (Figura 1).
 También observamos que dializabilidad hierro fue mayor en la presencia
de fosfopéptidos de caseína que en la presencia de caseinato de sodio
(Tabla 1).
 Nuestros resultados sugieren que cuanto mayor es la disponibilidad de
hierro en presencia de fosfopéptidos de caseína puede ser debido a su
solubilidad mejorada hierro y dializabilidad sobre la caseína.
.
 Aunque el dializabilidad de hierro en presencia de proteína de suero
concentrado (WPC + Fe) fue menor que el hierro en presencia de
fosfopéptidos de caseína (Tabla 1), tienen una disponibilidad similar
(Figura 1). Una posible explicación es que el bajo nivel de hierro de
afinidad de proteína de suero de unión a hierro permite que sea
fácilmente absorbido por las células mientrasque la mayor afinidad de
fosfopéptidos de caseína de fijación de hierro podría haber impedido la
absorción de hierro unido
EXPERIMENTO 2:
 No hubo diferencias significativas en el contenido de hierro de las cámaras
inferiores entre todas las muestras. Además, la adición de fosfatasa
alcalina directamente en la media cámara inferior no afectó a la cantidad
de hierro que dializó en las cámaras inferiores de las placas de compañía
(Tabla 2).

 Los factor que afecta a la disponibilidad de hierro en presencia de caseína.

Sin embargo, el alto contenido de hierro de los residuos de fosfoserina
afinidad caseína de unión también puede desempeñar un papel en la
biodisponibilidad del hierro de las mezclas de hierro-caseína.
 esto nos permitió examinar el efecto de las agrupaciones de fosfoserina
caseína independientes de su capacidad quelante. El ácido cítrico fue
elegido como el quelato de hierro en este experimento por su afinidad de
unión de hierro más baja que los racimos de fosfoserina en caseína
 Figura 2. Hierro disponibilidad de citrato férrico en muestras de caseinato y
caseína fosfopéptidos con fosfatasa alcalina intestinal de ternero activa o
inactiva
Figura 2. Hierro disponibilidad de citrato férrico en muestras de caseinato y caseína fosfopéptidos con
fosfatasa alcalina intestinal de ternero activa o inactiva.
 La disponibilidad de hierro se expresó como ferritina
 Barra libre representa la fosfatasa alcalina activa (+ CIAP) y barra sólida
representa la fosfatasa alcalina inactiva (- CIAP).
 Fe-CA = citrato férrico;
 SC + Fe-CA = caseinato de sodio + citrato férrico;
 CPP-90 + Fe-CA = fosfopéptidos de caseína (90% de los péptidos son la
caseína fosfopéptidos) + citrato férrico.
 nivel de significancia 95% (P <0,05; prueba de comparación múltiple de
Tukey). Las barras de error indican el error estándar de las medias muéstrales
individuales. n = 6.
 El citrato viene hacer la formula para lactantes
a base de leche genérico lo cual inhibe la
absorción de hierro. (GLAHN)

 La leche genérica contiene mas mol de citrato

por mol de hierro esto debido a su condición
de quelante. 1,6 a 6,5 mmol/L citrato.

 El hierro férrico se utiliza debido a que puede

formar un quelato estable con el acido cítrico y
también el hierro ferroso se oxida a férrico en
presencia de caseína.
 RESULTADOS.
 Hierro disponible en citrato férrico en ausencia de CPP
(fosfopeptidos de caseína) fue mayor que en las
muestras que contienen citrato férrico en presencia de
cpp.
 Esta observación explicamos debido a la mayor
presencia de grupos de fosforesina presentes en cpp
que en caseinato de sodio ya que se utilizo un 90% de
cpp. Y también la agrupación de fosforesina caseína
dificulta la absorción del alimento.
 Los resultados muestran que la desfosforilizacion catalizada por la
fosfatasa alcalina intestinal añadido NO DIO LUGAR A UNA MAYOR
ABSORCION DE HIERRO EN PRESENCIA DE CPP.
 La explicación de esto se basa debido ala presencia de un inhibidor
de fosfatasa alcalina lo cual disminuye la actividad fosfatasa
alcalina de las células de CACO-2, y baja la absorción de hierro en
presencia de CPP al 10%.
 CONCLUSIÓN.
 La caseína fosfopeptidica en ausencia de
ligandos presenta mayor absorción de hierro
en comparación con el caseinato de sodio.
 Los fosfopeptidos de caseína no mejora la
disponibilidad de hierro cuando los ligandos
solubles de hierro como acido Cítrico
estuvieron presentes.
 La CPP mejora la disponibilidad de hierro con
baja disponibilidad de hierro en los alimentos.
GRACIAS POR SU
ATENCIÓN.