3 TSI: tiene extracto de carne,
UIA 6. IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS
6 Se sembrará por aislamiento con asa 1 Citrato Simmons: es un medio diferencial que
1 Cada grupo de dos
estudiantes recibirá un
cultivo en medio sólido
(Agar Tripticasa de Soya)
sembrado con un bacilo
2 Realizar coloración de
Gram-negativo
Gram a partir de una
colonia aislada del medio
de cultivo y observar la
3 Sembrar
morfologíael al microscopio
microorganismo en la
prueba Glucosa OF (caldo
con glucosa al 1%), llevar
a incubación a 37
4 Realizar la prueba de °C y leer
aoxidasa.
las 48 horas
Con este fin tome la tira
de oxidasa y con cuidado
se pone en contacto con
una colonia aislada del
medio de cultivo. Esta
prueba sirve para
determinar la presencia de
enzimas oxidasas. La
reacción de la oxidasa se
debe a la presencia de un
sistema citocromooxidasa
que activa la oxidación del
citocromo el cual es
reducido por el oxígeno
molecular produciéndose
agua o peróxido de
Realizar laSiprueba
5 hidrogeno. es + elde
catalasafinal
(2 gotas del
aceptor de electrones
enreactivo de peróxido de
la cadena
recta de una colonia aislada y tomada
del Agar Tripticasa de Soya en :
Agar Mac Conkey este medio se
utiliza para el aislamiento de bacilos
gran negativos (toda la familia
Enterobacteria). La peptona aporta
nutrientes para el desarrollo
microbiano, la lactosa es el hidrato
de carbono fermentable, la mezcla de
sales biliares y el cristal violeta son
los agentes selectivos del medio. El
agar es el agente solidificante, por
fermentación de la lactosa,
disminuye el PH alrededor de la
2 ácidos
colonia, esto produce un viraje de
color rojo a amarillo (rojo neutro
indicador de PH). Precipitado negro
si es capas de hidrolizar las sales
biliares
RESULTADOS:
- Fermentadores de lactosa:
colonias rosadas rojizas con halo
de precipitación biliar
- No fermentadores de lactosa:
colonias incoloras (del color del
medio)
pluripeptona (desarrollo
microbiano) la lactosa,
sacarosa y glucosa son
usa el citrato como la única fuente de carbono, hidratos de carbono
fosfato de amonio como fuente de nitrógeno
fermentables. El tiosulfato
(ambos necesarios para el desarrollo
de sodio es necesario
microbiano) NaCl balance osmótico. Azul de
para la producción de H2S
bromotimol indicador de PH
que reacciona con el sulfato de hierro y
Citrato : enzima citrato
amonio produciendo un precipitado de
permeasa a través de color negro. El rojo fenol es el indicador
ciclo acido tricarboxilico de PH y el NaCl da balance
(el desdoblamiento del 4 LIA: la peptona, el extracto de levadura aportan
nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa
citrato produce
es el hidrato de carbono fermentable, la lisina es el
oxalacetato y piruvato)
sustrato para detectar la presencia de las enzimas
(el piruvato en presencia del medio alcalino
decarboxilasa y desaminasa. El citrato de hierro,
genera
amonio y tiosulfato de sodio son los indicadores de
Pruebaorgánicos) Azul: presencia
de la Fenilalanina de citrato
Desaminasa:
permeasa, la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de
Esta pruebaabundante
determinacrecimiento Verde:
la capacidad de un
negativo para crecimiento bromocresol, es el indicador de pH (amarillo pH
organismo para desaminar el aminoácido 5.2 < y violeta pH 6.8 >). Los microorganismos
fenilalanina en ácido fenilpirúvico por la fermentadores de glucosa acidifican el medio y
actividad de la enzima fenilalanina
provocan el viraje del color púrpura al amarillo. El
desaminasa, con la consiguiente acidez
ambiente ácido favorece la actividad enzimática
resultante. Esta actividad enzimática es
decarboxilasa y se metaboliza la lisina a cadaverina
característica de todas las especies del género
elevando el pH del medio de cultivo y tornándolo
Proteus y del grupo Providencia por lo que se
al color púrpura o violeta. La generación de sulfuro
usa para separar ambos géneros de otras de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento
enterobacterias. del medio debido a la formación de sulfuro de
El ácido fenilpirúvico puede
hierro. Las cepas de Proteus, Providencia y algunas
detectarse por la adición
de Morganella,
1. K/K: Decarboxilación dedesaminan
la lisina: la lisina. Esto produce
de un reactivo (4-5 gotas -Prueba Positiva: Pico violeta /
un ácido
Fondo violeta α-cetocarbónico, con la sal de hierro y
de la solución de cloruro 2.bajo
la influencia del oxígeno forma un color rojizo
K/A -Prueba Negativa: Pico
férrico al 10% de manera violeta / Fondo amarillo.
en la superficie
3. R/A: Desaminación de ladel medio.
lisina:
que inunde todo el medio
-Pico rojizo / Fondo amarillo. Esto
inclinado. La presencia de ácido fenilpirúvico sucede con cepas del Género
Proteus, Providencia y Alguna cepas
(prueba positiva) se manifiesta por la
de Morganella sp.
aparición de un color característico verde 4. Producción de Ácido sulfhídrico:
 SIM: triptenía y 7 VP y RP (en ese orden)
5 8 Caldo de nitratos: Sirve para determinar la capacidad de
peptona USO Medio utilizado para la
un organismo de reducir el nitrato en nitritos (enzima
nutrientes. La realización del ensayo de Rojo
nitrato reductasa). Para ello, el
triptenía tiene el de Metito Voges Proskauer. Es
medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de nitrato
aminoácido particularmente útil para la
potásico y para revelar la presencia de nitritos después de
Gries
triptófano, si la clasificación de enterobacterias.
su incubación se añaden los reactivos…
bacteria lo FUNDAMENTO En el medio de Incoloro: Rosado:
metaboliza cultivo, la pluripeptona aporta ausencia de nitratos a
produce indol (se los nutrientes necesarios para el nitratosPolvo de Zn nitritos
revela con el desarrolto bacteriano y ta
reactivo de głucosa es el hidrato de carbono Incoloro: reduce Rosa: no reduce
Kovac’s). Si el fermentable. La glucosa puede nitratos a otros nitratos
tiosulfato de sodio ser metabolizada por los compuestos que no
es hidrolisado microorganismos, a través de son nitritos
produce color distintas vias metabólicas. Según
Las enterobacterias son generalmente nitratos (+).
negroidentificar
Urea: en el medio bacterias a través de la la via utilizada, se originarán
6 Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar
(H2S). Elde
detección agar
la actividad de una enzima que productos finales ácidos (ácido
entre sí determinadas bacterias de los géneros
permite
Las ver lapueden o no poseer. Determina la
bacterias láctico, ácido acético, ácido
Haemophylus y Neisseria.
movilidadde
capacidad enun
la organismo de desdoblar la fórmico), o productos finales
línea de siembra
urea formando una molécula de dióxido de neutros (acetil metil carbinol).
carbono y dos moléculas de amoniaco por Esta diferencia en el
acción de la enzima ureasa. Esta actividad metabolismo bacteriano podría
enzimática es característica de todas las ser reconocida por la adición de
especies de Proteus y se usa para diferenciar un indicador como rojo de
este género de otras enterobacterias que dan negativo o metilo, para revelar la presencia
positivo retardado. Las bacterias que hidrolizan la urea hacen de productos ácidos, y por la
que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la adición de alfa naftol e hidróxido
alcalinización del mismo por producción de amonio, que de potasio para evidenciar la
manifiesta por un viraje del indicador de pH (rojo de fenol). presencia de productos finales
neutros. Voges y Proskauer,
describieron una cotoración
Tojiza que aparecía después de
adicionar hidróxido de potasio a
los cultivos de ciertos
microorganismos en medio con
glucosa. Esta coloración se debe
a la oxidación del acetilmetil
 O

NH2
N N O CH2 O
O

P
O-
OH O
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS POR ELECTROFORESIS
El resultado del DNA amplificado se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, previamente
cargado con muestras y controles, bajo un campo eléctrico de 60v durante 15 min. El gel luego es teñido con
Bromuro de Etidio y se observa y fotografía en un visualizador de electroforetograma.   
Los canales electroforéticos son cargados con un control negativo (muestra libre de DNA), un control positivo
(muestra con antígeno viral confirmado), marcadores de peso molecular y los productos PCR de cada muestra
analizada. El resultado de esta PCR convencional es expresado en forma cualitativa (positivo o negativo).
Está previamente definido que el DNA transcrito del RNA del CCV migra a una distancia equivalente a 287 pb.
Confirmación que se hace por comparación con el marcador de peso molecular desplegado en el  electroferograma.
Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de las bandas que se
encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se coloca bajo luz UV, los
fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN presente en distintos lugares a lo largo del gel.
Una "línea" de ADN bien definida en un gel se llama banda. Cada banda contiene un gran número de fragmentos de
ADN del mismo tamaño que han viajado juntos a la misma posición. Un fragmento único de ADN (o incluso un
pequeño grupo de fragmentos de ADN) no sería visible por sí mismo en un gel