MEDIOS PARA FERMENTACIONES

INDUSTRIALES
CONCEPTOS GENERALES

 Investigación detallada para determinar el

medio más adecuado en un proceso de
fermentación
 Todos los microorganismos (m.o.) requieren
de agua, fuentes de: energía, carbón,
nitrógeno; elementos minerales y
posiblemente vitaminas, así como oxígeno si
son aerobios
 Elementos principales requeridos
por las células microbianas
FUNCIÓN
ELEMENTO FUENTE
METABÓLICA
C Compuestos orgánicos, Componente principal del
CO2 material celular

O O2, H2O, compuestos Componente principal del

orgánicos, CO2 material celular

H H2, H2O, compuestos Componente principal del

orgánicos material celular

N NH4+, NO3, N2, Componente principal del

compuestos orgánicos material celular

S SO4-2, S2O3, HS-, S, Componente de la cis, met,

compuestos orgánicos pirofosfato de tiamina,
coenzima A, ác. -lipólico
 (Cont.)
ELEMENTO FUENTE FUNCIÓN METABÓLICA

P HPO4-2 Componente de los ácidos nucléicos, ATP

y otros nucleótidos y fosfolípidos
K K+ Principal catión orgánico dentro de la
célula, cofactor de algunas enzimas

Mg Mg+2 Cofactor de muchas enzimas

(particularmente cinasas) presente en
paredes y membranas celulares
Ca Ca+2 Cofactor de enzimas; presente en
exoenzimas importantes ( amilasas,
proteasas), componente de las
endoesporas (cadipicolinato)
Fe Fe+2 , Fe+3 Componente de los citocromos, proteínas
fierro-azufre (ferredoxinas) cofactor de
enzimas (hidratasa)
Criterios para crear un medio

1. Máxima productividad
2. Máxima concentración de producto o biomasa
3. Máxima velocidad de formación del producto
4. Productividad mínima de productos indeseables
5. Económico, calidad consistente, fácilmente
disponible
6. Problemas mínimos en otros aspectos: aereación
y agitación, extracción, purificación y
tratamiento de desechos
Ejemplos de medios que cumplen
con dichos criterios

 Fuentes de carbono:
 Mieles de caña, mieles de remolacha, cereales,
almidones, glucosa, sacarosa y lactosa

 Fuentes de nitrógeno:
 Sales de amonio, ureas, nitratos, licor de
maíz, harina de soya, desechos de rastros y
residuos de fermentación
FORMULACION DEL MEDIO

Fuente de Fuente de Otros

Carbón y + nitrógeno + requeri-
Energía mientos

Biomasa + Productos + CO2 + H2O + Calor

celular
 FORMULACIÓN DEL MEDIO

Cooney (1981):
 Demostró que algunos nutrientes frecuente-
mente están adicionados en exceso, ejem: P y K,
y otros muy cerca de los valores límite (ejem:
Zn y Cu)
 Incrementos en P, incrementan la capacidad
buffer del medio
 Es necesario poner una atención considerable al
diseño del medio
 FORMULACIÓN DEL MEDIO

 Algunos m.o. no pueden sintetizar nutrientes

específicos, ejem: aminoácidos, vitaminas y
nucleótidos
 Se identifica un factor específico de
crecimiento que deberá incorporarse al
medio en cantidades adecuadas como un
componente puro o como el componente de
una mezcla compleja
FORMULACION DEL MEDIO

 El carbono tiene un papel importante en la

biosíntesis y generación de energía
 Los requerimientos de carbono bajo
condiciones aeróbicas se pueden estimar a
partir del coeficiente de productividad
celular (Y, SoKo) definido como:
Cantidad de material celular seco producido
Cantidad de carbono del sustrato utilizado
Valores de Y para bacterias
(Abbot y Clamen, 1973)

SUSTRATO Y

Metano 0.62
N. Alcanos 1.03
Metanol 0.40
Etanol 0.68
Acetato 0.34
Maleato 0.36
Glucosa (mieles) 0.51
 Formulación del medio

Cooney (1979):
 Calculó Y teóricas para la biosíntesis de
penicilina G sobre la base de balances de
materia y energía, analizando la estequiometría
de la reacción:

a2C6H12O6 + b2NH3 + c2O2 + d2H2SO4 + e2PAA

n2PenG + p2CO2 + q2H2O (1)

 Formulación del medio

 La solución a la ecuación (1) es:

10/6 C6H12O6 + 2NH3 + ½ O2 + H2SO4 + C8H8O2

C16H18O4 N2S + 2CO2 + 9H2O

Y teórica = 1 g de penicilina G por g de glucosa

 Formulación del medio

USO DE LA GLUCOSA FERMENTACIÓN FERMENTACIÓN

CONSUMIDA INTERMITENTE SEMICONTINUA

Producción celular 28% 26%

Mantenimiento 61% 70%

Producción de penicilina 11% 6%

• Valor máximo de Y experimental = 0.053 g/g

 AGUA

 En los procesos fermentativos se requieren grandes

cantidades de agua limpia y de composición
consistente, ya que:
 Es componente mayor de todos los medios de fermentación
 Es necesaria en muchos servicios auxiliares
 Factores a considerar:
 pH
 Sólidos disueltos
 Contaminación del efluente
 Contenido mineral
 FUENTES DE ENERGÍA Y
CARBONO

 La energía para el crecimiento proviene de:

 Oxidación de los componentes del medio
 Luz
 La mayoría de los m.o. industriales son
quimiorganotrofos
 La fuente más común de energía es la fuente
de carbono: carbohidratos, lípidos y
proteínas
 Algunos m.o. utilizan metano o metanol como
fuente de carbono y energía
 Crecimiento fototrófico

TIPO Donador Fuente Organismo

de e- de
carbono
Fotoliotrofía H 2O CO2 Plantas, algas verde
azules
H2S,S,H2 H 2O Chromatiaceae,
Chlorobiaceae

Fotoorganotrofía Orgánico Orgánico Rhodospirillaceae

 Crecimiento quimiotrófico

Tipo Donador Aceptor Fte. de Organismo

de e- de e- carbono

Quimioorganotrofía Org. O2 Org. Pseudomonas, Bacilli,

levaduras
Org. NO3- Org. Bacillus licheniformis
Org. Org. Bacterias reductoras
SO4-2
de sulfato
Org. Org. Clostridia, bacilos del
Org. ácido láctico, E. Coli,
levaduras
 Crecimiento quimiotrófico (cont.)

Tipo Donador Aceptor Fte. de Organismo

de e- de e- carbono
Quimiolitotrofía H2 O2 CO2 Bacterias oxidantes
de hidrógeno
H2 S O2 CO2 Tiobacilos
Th. Denitrificans
H2 S NO3- CO2
Th. Ferrooxidans
Fe+2 O2 CO2
Nitrosomas
NH4+ O2 CO2
Nitrobacter
NH2- O2 CO2 Metanógenos
H2 CO2 CO2 Acetobacterium
H2 CO2 CO2
Ejemplos de fuentes de carbón
normalmente utilizadas

 Carbohidratos:
 almidón de maíz, de cereales o de papas
 maíz y cereales parcialmente molidos
 preparaciones de glucosa a partir de almidones
hidrolizados
 malta (granos de cebada germinados
parcialmente y tratados térmicamente)
 sacarosa de caña o remolacha como melazas
(forma impura)
Composición de malta de cebada
(carbohidratos) (Haris, 1962)

CARBOHIDRATO % b.s.
Almidón 58 – 60
Sacarosa 3 – 5
Azúcares reductores 3 – 4
Otros azúcares 2
Hemicelulosa 6 – 8
Celulosa 5
Análisis de melazas de caña y
remolacha (Rhodes y Fletcher, 1966)

CARBOHIDRATO REMOLACHA CAÑA

(% w/v) (% w/v)
Sacarosa 48.5 33.4
Rafinosa 1.0 0
Azúcar invertida 1.0 21.2
Ejemplos de fuentes de carbón
normalmente utilizadas

 Aceites vegetales comerciales

 Oliva, maíz, semilla de algodón, linaza, soya, etc.
 Son fuentes de carbono fundamentalmente como
ácido oleico, linoleico y linolénico
 Actúa como antiespumante en asociación con un
agente surfactante
Ejemplos de fuentes de carbón
normalmente utilizadas

 Licor de maíz
 Subproducto en la extracción del almidón de
maíz
 Se utiliza principalmente como fuente de
nitrógeno, pero además contiene ácido láctico,
azúcares reductores y polisacáridos complejos
 Proteínas
 Albúmina bovina y harina de carne
 Se utilizan en la formulación de medios para la
producción de vacunas
Factores que influyen sobre la
selección de la fuente de carbono

 El producto principal que se desea obtener

 La eliminación de impurezas de la fuente de
carbohidratos
 Legislaciones
 El método de preparación del medio,
particularmente la esterilización
Influencia de la fuente de carbono
sobre la formación del producto

 La velocidad a la cual la fuente de carbono es

metabolizada puede influenciar la formación de biomasa
o la producción de metabolitos primarios o secundarios
 Crecimiento rápido por la presencia de altas
concentraciones de azúcares rápidamente
metabolizables genera baja productividad de
metabolitos secundarios (Griseofulvina, Penicilina,
Bacitracina, Estreptomicina y Actinomicina)
 El problema se resuelve usando azúcares metabolizables
más lentamente (lactosa) o con sistemas continuos y
semicontinuos
 FUENTES DE NITRÓGENO

 La mayoría de los m.o. industriales pueden

utilizar fuentes orgánicas e inorgánicas de
nitrógeno
 Nitrógeno inorgánico:
 amoniaco (gas) o nitratos: condiciones alcalinas
 sales de amonio: condiciones ácidas
 Nitrógeno orgánico:
 Aminoácidos
 Proteína
 urea
Ejemplos de fuentes de nitrógeno

 Licor de maíz
 Harina de soya
 Harina de cacahuate
 Harina de semillas de algodón
 Hidrolizado de caseína
 Desechos de rastro
 Harina de pescado
 Extracto de levadura
Factores que influyen sobre la
selección de fuentes de nitrógeno

 El amoniaco o ión amonio se prefiere como

fuente de nitrógeno, pues la enzima nitrato
reductasa es inhibida en presencia del
mismo.
 Además, el ión amonio controla la acción de
ciertos sistemas enzimáticos en hongos para
la incorporación de aminoácidos al m.o.
(aminoácido permeasas)
Factores que influyen sobre la
selección de fuentes de nitrógeno

 En Aspergillus nidulans el amoniaco regula la

producción de proteasas alcalinas y
neutrales
 La fuente de nitrógeno influye el patrón de
fermentación. La producción de antibióticos
puede ser inhibida por una utilización rápida
del nitrógeno. Ejemplo: en la producción de
polienantibióticos, la harina de soya es
buena fuente de N.
Factores que influyen sobre la
selección de fuentes de nitrógeno

 Rhodes (1963)
Demostró que la concentración óptima de la
fuente de nitrógeno disponible para la
producción de griseofulvina varían en
función de la forma del inóculo y del tipo de
fermentador
 Mejores fuentes de nitrógeno seleccio-
nadas mediante planes de desarrollo

PRODUCTO PRINCIPAL FUENTE DE N

Penicilina Licor de maíz
Bacitracina Cacahuate granulado
Rivoflavina Digerido pancreático de gelatina
Novobiocina Solubles de destilería
Rifamicina Pharmamedia, Harina de soya, (NH4)2SO4
Giberalinas Sales de amonio y ftes. nats. de N vegetal
Butirosina Sangre seca o hemoglobina con (NH4)2SO4
Polienos Harina de soya
 MINERALES Y VITAMINAS

a. Minerales
 En muchos medios Mg, P, K, S, Ca y Cl son
componentes esenciales en concentraciones
tales que es necesario adicionarlos
 Otros elementos como Co, Cu, Fe, Mn, Mo y
Zn son esenciales pero están presentes
como impurezas en otros ingredientes
 Elementos traza requeridos por las
células microbianas
Elemento Función metabólica

Zn Componente de la alcohol deshidrogenasa, fosfa-

tasa alcalina, aldolasa, RNA y DNA polimerasa
Mn Componente de la superóxido dismutasa bacteria-
na, PEP, carboxicinasa, citrato sintetasa
Na Requerido por bacterias halofílicas
Cl Requerido por bacterias halofílicas
Mo Componente de la nitrato reductasa, nitrogenasa,
formato deshidrogenasa
 Elementos traza requeridos por las
células microbianas (cont.)
Elemento Función metabólica

Se Componente de la glicina reductasa, formato

deshidrogenasa
Co Componente de la vitamina B12 y enzimas con
vitamina B12 (glutamato mutasa, metilmalonil CoA
mutasa)
Cu Componente de la citocromo oxidasa y oxigenasas
Cr Componente de algunas formato deshidrogenasas
Ni Componente de la ureasa y del crecimiento
autótrofo de bacterias que oxidan hidrógeno
Intervalos de concentraciones típicas
de componentes minerales (g/dm3)
COMPONENTE INTERVALO
KH2PO4 1.0 – 4.0
MgSO4-7H2O 0.25 – 3.0
KCl 0.5 – 12.0
CACO3 5.0 – 17.0
FeSO4-4H2O 0.01 – 0.1
ZnSO4-8H2O 0.1 – 1.0
MnSO4-H2O 0.01 – 0.1
CuSO4-5H2O 0.003 – 0.01
NaMoO -2H O 0.01 – 0.1
Minerales

 La concentración de los minerales puede ser

muy crítica en ciertos procesos (metabolitos
secundarios)
 La concentración de fosfato inorgánico
influye sobre la producción de bacitracinas,
ácido cítrico, monomicina, novobiocina,
oxitetraciclina, polienos, ristomiocina,
rifamicina Y, estreptomicina y vancomicina
Minerales

Garner y col. (1950) sugirieron que una

función importante del calcio en el medio de
fermentación era precipitar el exceso de
fosfatos inorgánicos y sugirieron que el
calcio mejora indirectamente la
productividad de estreptomicina
Minerales

 Weinberg (1970):
 Mn, Fe y Zn son los minerales más críticos en el
metabolismo secundario
 La productividad del producto varía linealmente
con el logaritmo de la concentración del metal
“clave” (No. atómico. 23-30, 42)
 La relación lineal no se aplica a concentraciones
insuficientes o tóxicas para el crecimiento
Elementos trazas requeridos en la
obtención de metabolitos

PRODUCTO ELEMENTOS TRAZA

Bacitracina Mn

Riboflavina Fe, Co

Proteasa Mn

Actinomicina Fe, Zn

Cloramfenicol Fe, Zn
Elementos trazas requeridos en la
obtención de metabolitos (cont.)

PRODUCTO ELEMENTOS TRAZA

Neomicina Fe, Zn

Acido cítrico Fe, M, Zn

Penicilina Fe, Zn, Cu

Griseofluvina Zn

Patulina Fe, Zn
Vitaminas
 Muchas de las fuentes de carbono y nitrógeno
contienen todas o algunas de las vitaminas
necesarias
 Para evitar una deficiencia de vitaminas es
conveniente utilizar una mezcla cuidadosa de
materiales
 Cuando sólo se requiere de una vitamina, resulta
más económico adicionarla en su forma pura
 Ejemplos: uso de pantotenato de calcio en la
formulación del medio destinado a la producción de
vinagre y biotina para ácido glutámico
 Vitaminas y compuestos relacionado
requeridos para el crecimiento

Compuesto Función metabólica

Ác. p-aminobenzóico Precursor del tetrahidrofolato, utilizado en la
transferencia de unidades de un carbono
Biotina Coenzima que participa en reacciones de
carboxilación
Ac. fólico Tetrahidrofolato necesario en la transferen-
cia de unidades de un carbono
Ac. nicotínico Precursor de NAD y NADP
Ac. pantoténico Precursor de coenzima A (portador de grupos
de acilo)
 Vitaminas y compuestos relacionado
requeridos para el crecimiento (cont.)

Compuesto Función metabólica

Vitamina B2 Fosfato de piridoxal usado en reacciones
de transminación y descarboxilación
Vitamina B6 Componente de los grupos prostéticos
FMN y FED de las flavoproteínas
Vitamina B1 Componente del pirofosfato de tiamina en
descarboxilasas, transaminasas y
transcetolasas
 Vitaminas y compuestos relacionado
requeridos para el crecimiento (cont.)

Compuesto Función metabólica

Vitamina B12 Coenzima que intervine en reacciones de

rearreglo (glutamato mutasa)
Vitamina K Precursor de la menaqinona un portador de
electrones (por ejemplo, fumarato
reductasa)
Coenzima M Interviene en la metanogénesis
Recirculación del nutriente

 Los fermentadores continuos de gran

escala, utilizados en la producción de
SCP, se diseñan para operarse con
recirculación de la alimentación líquida

 Es necesario ajustar en forma adecuada

los niveles de nutrientes
Buffers

 El control de pH es extremadamente importante

si se quiere alcanzar una productividad óptima
 Se debe adicionar al medio de cultivo un
compuesto que sirva como buffer
 pH 7 Carbonato de calcio
 Los fosfatos juegan un papel importante como
buffers
 Uso balanceado de fuentes de carbono y
nitrógeno control de pH
 Control externo del pH: adición de amoniaco o
hidróxido de sodio y ácido sulfúrico
Adición de precursores y
reguladores metabólicos al medio

Manipulan el progreso
de la reacción
Precursores
Inhibidores
Inductores Regulan la generación
de producto en lugar
del crecimiento de m.o.
Precursores

 Algunos compuestos químicos cuando se

adicionan a ciertas fermentaciones se
incorporan directamente dentro del
producto deseado
 Ejemplo: incremento de la
productividad de penicilina (de 20 a
100 unidades/cm3) al adicionar licor de
maíz
Precursores

Fenilmetilamina
contenida en el + Penicilina Bencil penicilina
licor de maíz (Penicilina G)
 Precursores

Precursor Producto Microorganismo

Ac. Fenilacético Penicilina G Penicillium

chrysogenum
Ac. Fenoxiacético Penicilina V Penicillium
chrysogenum
Cloruro Clorotetraciclina Srepomices
aureofaciens
 Precursores (cont.)

Precursor Producto Microorganismo

D-treonina L-isoleuina Serratia

Marscescens
Glicina L-serina Corynebacterium
glycinophilum
Ac.  amino L-isoleucina Bacillus subtilis
butírico
Inhibidores

 Al adicionar ciertos inhibidores a las

fermentaciones se puede producir más de un
producto específico o un producto metabólico
intermedio
 Ejemplo: producción de glicerol
OH
CH3CH=O + Na+SO3- CH3CH
SO3-Na+
 Inhibidores
Efecto
Producto Inhibidor Microorganismo
principal
Glicerol Bisulfito de Reprime la S. cerevisiae
sodio producción de
acetaldehido
Tetraiclina Bromuro Reprime la Streptomyces
formación de aureofaciens
Clorotetraciclina
Ac. glutámico Penicilina Permeabilidad de Micrococcus
la pared celular glutamicus
Rifamicina B Di-etil Inhibe otras Nocardia
barbiturato rifamicinas mediterranei
Inductores

 La mayoría de la enzimas de interés industria

son inducidas
 Las enzimas inducidas son sintetizadas sólo
en respuesta a la presencia en el medio de un
inductor
 El inductor normalmente es el sustrato para
la enzima o un compuesto estructuralmente
relacionado
 Precursores

Enzima Inductor Microorganismo

-amilasa Almidón Aspergillus spp
Maltosa Bacillus subtilis

Celulasa Celulosa Trichoderma virde

Pectinasas Pectina Aspergillus spp