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RESULTADOS
4. RESULTADOS
Caracterización de los miARN de Giardia
Se cultivaron cinco aislados  • Extracción de ARN total
• Prepararon pequeñas
diferentes de Giardia
bibliotecas de ARN.
• Secuenciación.
• Se confirmó la presencia de lecturas miR5 y
miR6
• Supuestos miRNAs que se han informado
previamente en niveles de expresión más altos
en trofozoítos de Giardia.
• Estos dos miRNA se conservan entre
los tres ensamblajes principales que
infectan a los humanos; A, B y E.
miR5tiene 26 nt de largo y es 100% idéntico en
los tres conjuntos.
miR6tiene 28 nt de largo y es 100% idéntico en
los ensambles A y E, y 24 de los 28 son idénticos en
el ensamblaje B
4. RESULTADOS Detección de miARN de Giardia en biopsias duodenales humanas

Se estudiaron 8 biopsias El ARN se analizaron con • Todas las muestras fueron positivas para Giardia
duodenales con Giardia ensayos de microARN miR5 con un valor umbral medio de ciclo (Ct) de
positiva. TaqMan® 23,7.
ADN se analizaron con el • miR6 fue principalmente indetectable y, por lo
ensayo de ADN TaqMan tanto, no se examinó más a fondo en biopsias
qPCR duodenales.
• Prueba de qPCR para el ADN de Giardia usando
• Las muestras fueron de cebadores específicos para Giardiagen de ARN
pacientes remitidos a ribosómico de subunidad pequeña (similar a 16S)
gastroscopia por TaqMan qPCR según lo descrito por Verweij
• Quejas prolongadas del et al.
sistema gastrointestinal o
anemia.
• No diagnosticadas con
giardiasis antes de la
La comparación de Ct de Giardia miR5 VS Giardia DNA en
gastroscopia.
las mismas muestras
• miR5 arrojó valores medios de Ct más bajos 23.7 VS
26.3
• Estos hallazgos sugieren que la amplificación de miARN
puede ser más robusta que la amplificación de ADN
 6 biopsias gástricas adicionales de
Como control negativo, utilizamos En primer lugar, utilizamos 4
pacientes seleccionados al azar que se
biopsias gástricas que no se espera biopsias gástricas disponibles
de los 8 pacientes mencionados sometieron a gastroscopia por
4. RESULTADOS

que alberguen parásitos de diversas razones mostraron valores de

Giardia . anteriormente con histología
duodenal positiva. Ct superiores a 34.

En total, en las 10 biopsias de control, los

valores de miR5 Ct fueron superiores a 34 con
una media de 35,9 (± 1,6) en comparación con
23,7 (± 4,0) en los casos positivos.

Fig. 1. Detección de Giardia miR5 en biopsias del duodeno humano.

El ARN se extrajo de 8 biopsias del duodeno de pacientes con Giardia positivo o como grupo
control, de 4 biopsias gástricas de pacientes con Giardia positivo y de 6 biopsias gástricas
aleatorias.
El ARN se sometió a qRT-PCR (ver Métodos ) con cebadores específicos para miR5.
 Al aplicar el análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC), observamos
4. RESULTADOS

resultados altamente sensibles y específicos.

El área calculada bajo la curva (AUC) para miR5 fue 1, lo que representa una prueba
perfecta.
El límite óptimo se determina como el límite con la razón de probabilidad más alta (la razón de
probabilidad se define como % de sensibilidad / (100% de especificidad).
Con miR5, Ct <33.5 produjo una sensibilidad y especificidad del 100%.
 • Para determinar el número mínimo de parásitos de Giardia que pueden
4. RESULTADOS
detectarse mediante miR5 qRT-PCR, utilizamos un modelo in vitro, extrajimos
ARN de parásitos y correlacionamos el número de células parásitas con la
lectura de Ct.
• Como se puede ver, a la dilución 10 5 contamos ~ 8 parásitos con un valor de Ct
de 33.1, ligeramente por debajo del límite de 33.5 Ct definido anteriormente.
• Por lo tanto, el límite inferior de detección de nuestro ensayo miR5 puede ser
de 8 células parásitas.

Fig. 3. Cálculo in vitro del valor de miR5 qRT-PCR Ct según el número de parásitos.
WB cepa Giardia se cultivaron en cultivo. Se contó el número de parásitos y se diluyó como se muestra en A. De cada dilución, se extrajo
ARN y se sometió a qRT-PCR. B) El gráfico representa un promedio de tres repeticiones, y como el logaritmo de la concentración de
parásitos versus el Ct obtenido
 • Se analizaron para miR5 en el duodeno. En 3 pacientes con sospecha de giardiasis
4. RESULTADOS

adquirida en el viaje sin evidencia de Giardia por examen histológico del tejido
del duodeno ni por microscopía de heces.
• En uno de estos pacientes, la biopsia que se tomó antes del tratamiento arrojó un
valor de miR5 Ct de 31.0, positivo para la infección por Giardia.
• Las biopsias de los otros dos pacientes, que se tomaron después del tratamiento
antigiardia, arrojaron niveles límite de Ct, 33.8 y 34.
• Los síntomas de los tres pacientes respondieron al tratamiento anti Giardia .

Tabla 2. Detección de miR5 en biopsias duodenales de pacientes con síntomas abdominales persistentes relacionados con el viaje
y sin detección de Giardia por examen histológico.