Cromatografía de

Intercambio Iónico,
exclusión y afinidad
Julián Rodríguez Zabala
Santiago Moncada
Elizabeth Sepúlveda
Johan Espinosa
Mariana Pérez
Intercambio iónico
 La cromatografía de intercambio iónico es un método de
separación que permite la separación de moléculas
basada en sus propiedades de carga eléctrica.

 Es una de las técnicas de purificación de proteínas mas

usadas.

 Se compone de dos fases, la fase estacionaria o

intercambiador iónico y la fase móvil.
Fases del intercambio
iónico
 Fase estacionaria: insoluble lleva en la
superficie cargas electrostáticas fijas, que
retienen contraiones móviles que pueden
intercambiarse por iones de la fase móvil.
(Celulosa o agarosa)

 La fase móvil: es una disolución acuosa

con cantidades moderadas de metanol u
otro disolvente orgánico miscible con agua
que contiene especies iónicas en un buffer.
(Proteínas o aminoácidos)
Fundamento
 El principio básico de la cromatografía de intercambio
iónico es que las moléculas cargadas se adhieren a los
intercambiadores de forma reversible de modo que
dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas
cambiando el ambiente iónico.
Intercambiadores iónicos
 Intercambiador catiónico: Con
grupos cargados negativamente,
pudiendo intercambiar Iones
positivos. Ej: sulfónico, SO3-
(intercambiador de cationes
fuertemente acido)

 Intercambiadores anionicos:
Con grupo cargado positivamente,
pudiendo intercambiar iones
negativos.
Procedimiento
 Equilibrio: Toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones
complementarios (que pueden ser cloro o sodio).

 Aplicación y Lavado: Aplicar la muestra la cual queremos filtrar a través de la

columna mediante un lavado específico. Se aplica un buffer con el mismo pH y
fuerza iónica que el buffer inicial para que todas las proteínas cargadas se unan al
intercambiador.

 Elusión: Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas debido a

cambios en la composición del buffer (pH o concentración de Sales).

 Regeneración: Remover las partículas que aún están asociadas al intercambiador.

Se debe generar un cambio más drástico en el pH y la concentración salina. La fase
estacionaria puede volver a ser utilizada
Elución por salting out
Factores que afectan la retención
 pH: Debemos tener en cuenta el pH del buffer a utilizar ya que las
resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy
ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH
próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico,
reduciéndose así, el tiempo de retención.

 Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la

magnitud de la carga. La fuerza de retención es mayor y, por
consiguiente la de elusión es menor, mientras más cargado se
encuentre el compuesto, los iones polivalentes se unen con mayor
fuerza a la fase estacionaria que los monovalentes.
Factores que afectan la retención
 Gradiente: Aumentando la
concentración de la fase móvil, los
iones compiten cada vez más
favorablemente con la muestra por
los sitios activos cargados de la fase
estacionaria.

 Porosidad: El tamaño del poro de la

resina al que se une el compuesto
móvil por intercambio iónico influye
directamente en la capacidad de
unión.
Aplicaciones
 Clínicamente se emplea para medir los niveles de
Hemoglobina glicosilada (HbA1c), porfirias y para
producción de agua desionizada en pequeñas cantidades.
 Extraccion y purificación de proteínas
 Extracción y purificación de ácidos nucleicos
 Purificación del fibrinógeno de la leche
 Análisis de antibióticos
 Determinación de pesticidas.
 Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.
Cromatografía de exclusión
 Es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en
la separación de proteínas y ácidos nucleicos.

 Este tipo de cromatografía se realiza en columnas

cilíndricas rellenas con geles de agarosa o poliacrilamida.

 Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos

por gránulos (partículas) de un material esponjoso
hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro
determinado.
Cromatografía de
exclusión
Las principales características de esta técnica cromatografica
son:

 Fase estacionaria es inerte, por lo que la columna no se

desactiva.
 La muestra no interacciona químicamente con la fase
estacionaria, ni con la fase móvil.
 Los solutos son generalmente sustancias de peso molecular
elevado. Dependiendo de su medida y estructura, éstos se
retienen o se eluyen a través de la columna.
Fundamento

Las moléculas eluyen

en este tipo de
cromatografía por
orden decreciente de
tamaño molecular.
Detectores
 Se utiliza tradicionalmente el detector de
índice de refracción.

 También es corriente utilizar el detector

espectrofotométrico de longitud de onda
variable, principalmente en la zona de 200
nm

 En los cromatogramas de exclusión, las

moléculas de tamaños más grandes dan
lugar a los picos iniciales y los más
pequeños se eluyen al final.
Aplicaciones
 Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos
nucléicos.
 Eliminación de compuestos de bajo peso molecular
marcados.
 Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo
peso molecular.
 Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De
las enzimas.
 Purificación de macromoléculas. H) Determinación del peso
molecular de las proteínas.
Cromatografía de afinidad
 La cromatografía por afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos
que se basa en la unión reversible entre el analito de interés y un
ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte.

 Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las

moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por
afinidad.

 Las matrices o soportes empleados en cromatografía de afinidad

como fase estacionaria deben ser rígidos, resistentes, insolubles,
permeables y reactivos(agarosa, celulosa, dextrano, vidrio,
poliacrilamida).
Ligandos
 Se clasifican según su naturaleza
química o su selectividad para la
retención de analitos, esta última
se clasifica en ligandos específicos
(anticuerpos) y generales (como
las lecitinas)
 Para obtener la muestra hace falta
modificar el pH de la columna para
alterar los sitios activos proteína-
ligando.
Aplicaciones
La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser
altamente selectiva para la retención de proteínas afines a la
columna.

 Purificación de ácidos nucleicos y purificación de proteínas.

 Purificación de anticuerpos en sueros sanguíneos hormonas
y enzimas.
 Purificación de proteínas recombinantes uso mas común.
Gracias