ESPECTROFOTOMETRÍA

Oscar Vidal PhD.

Departamento de Medicina
Universidad del Norte
ESPECTROFOTOMETRÍA
 OBJETIVOS

 Describir los fundamentos de la espectrofotometría

 Conocer y entender los componentes generales de un equipo

espectrofotométrico

 Realizar y describir la curva espectral de una sustancia en estudio

 Aplicar la ley le Beer-Lambert en la determinación de

concentraciones desconocidas

 Entender la aplicabilidad de la espectrofotometría en la clínica

 ESPECTROFOTOMETRÍA?

Un método científico basado en la absorción

de luz por una sustancia

Utilizado para cuantificar, detectar y analizar

sustancias a través de 2 leyes físicas de
absorción de luz
ESPECTROFOTÓMETRO?

Aparato para medir la intensidad de luz en

una parte del espectro de luz en una
sustancia o solución particular
 Descripción etimológica:

Espectrofotometría

Hace referencia Medición

Representación grafica de la
a “luz” o
distribución de una característica o
“óptico”
propiedad
DEFINICIÓN
Espectro luminoso
 Espectrofotometría
y
Longitud de onda

Método experimental basado en la medición de energía

radiante que absorbe (o transmite) un sistema en función de la
longitud de onda

DEFINICIÓN
Longitud de Onda:
Distancia real entre dos puntos
máximos (crestas) o mínimos
(valles) de una onda
Espectrofotometría
y
Longitud de onda
 LEY DE LAMBERT

Esta ley establece que cuando pasa luz

monocromática por un medio homogéneo, la
disminución de la
intensidad del haz de luz incidente es
proporcional al espesor del medio
 LEY DE LAMBERT

La proporción de luz absorbida por una

sustancia es independiente de la intensidad
de luz

Absorbancia de 75% (25% transmitancia) de

luz siempre absorberá 75%

Independientemente de la intensidad de la
luz.
 LEY DE LAMBERT

Lambert’s law is expressed as I/Io=T

Where

I = Intensity of transmitted light

Io = Intensity of the incident light

T = Transmittance
 LEY DE BEER

La intensidad de un haz de luz

monocromática disminuye exponencialmente
al aumentar aritméticamente la
concentración de la sustancia absorbente,
cuando este haz pasa a través de un medio
homogéneo
 LEY DE BEER

La absorbancia de la luz es proporcional a la

concentración y al espesor de la sustancia a
medir
 LEY DE LAMBER-BEER

Transmitancia (T) : Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por

una muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella.

Tanto la energía radiante incidente como la transmitida deben ser medidas a

la misma longitud de onda.

T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P / P0
 LEY DE LAMBER-BEER

Absorbancia(A) : Se define como la cantidad de energía radiante absorbida

por una sustancia pura o en solución.

Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia.T,

transmitancia expresada como fracción decimal %T, transmitancia
expresada como porcentaje.

A = - log T = 2 – log %T
ESPECTROFOTÓMETRO

 Descripción del equipo

ESPECTROFOTÓMETRO
Generador de luz radiante Detector/medidor
Muestra en de luz
estudio
 Espectro electromagnético

ESPECTROFOTÓMETRO
 Curva espectral

Wavelength (nm) Absorbance

520 0.748
515 0.759
510 0.780
505 0.771
500 0.771
495 0.651
490 0.590
Curva espectral
Absorbancia
Curva de calibración
Absorbancia
Curva de calibración
Absorbancia
Curva de calibración
Absorbancia
Curva de calibración
ESPECTROFOTÓMETRO

 Celdas espectrofotometricas
Usos de la espectrofotometría
Análisis de ADN
Usos de la espectrofotometría
Análisis de ADN
 Usos de la espectrofotometría
Análisis de Proteína
As with DNA, proteins absorb light at a specific wavelength,

The amino acids Tyrosine and Tryptophan have a very specific absorption
at 280 nm, allowing direct A280 measurement of protein concentration.

The chemical composition of the protein will affect the absorption: the
number as well as the type of amino acids will cause variation.

How much a protein absorbs at 280 nm is dependent on the amount of the

amino acids Tyrosine and especially Tryptophan: the aromatic ring of
Phenylalanine absorbs well at 260 nm, but not 280 nm.

The A260/A280 ratio can be used as a guide to the purity of the sample.
 Usos de la espectrofotometría
Análisis de Proteína / colorimetría
BCA
This method relies on the reaction of cupric ions (Cu2+) and peptide
bonds. maximum at 562 nm. Most commercially available kits state that
this method is designed to quantify 125 to 2000 μg/ml.
Biuret
Like BCA, the Biuret method takes advantage of the reaction between
cupric ions and peptide
Absorption is measured at 546 nm. Most commercially available kits state
that this method is designed for
the quantification of 1000 to 15 000 μg/ml.
Bradford
This method uses a dye, Coomassie Brilliant Blue, which binds to the
protein.
The protein solution shows an increase in absorbance at 595 nm which is
proportional to the amount of bound dye. Bradford is very resistant to
interference making it a very common method.
useful range of this method is 1 to 1500 μg/ml.
https://www.howequipmentworks.com/pulse_oximeter/
CURVA DE ABSORCIÓN
ESPECTRAL

Representación grafica que indica los distintos

valores de absorción de la muestra
(concentración constante) a diferentes
longitudes de onda.

Esta curva permite determinar la longitud de

onda a la cual la sustancia bajo estudio
presenta la mayor absorbancia

La longitud de donde donde la absorbancia es

máxima será la seleccionada para obtener la
curva de calibración
 CURVA DE
CALIBRACIÓN

Representación grafica que relaciona las

absorbancias de diferentes concentraciones
conocidas. Su modelo matemático se ajusta a
una línea recta

𝐴=𝜀∙𝐿∙𝐶

𝐴𝑠
𝐴=𝑚∙𝐶 𝑚=
𝐶𝑠

𝐴𝑥
𝐶𝑥 = ∙𝐶
𝐴𝑠 𝑠

CMOS image sensors as an efficient

platform for glucose monitoring.
Devadhasan et al.