General

Cromatog
• La cromatografía método físico
de separación para la
caracterización de mezclas
complejas.
• Es un conjunto de técnicas
basadas en el principio de
retención selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y
determinar las cantidades de
dichos componentes.
Las técnicas de cromatografía son muy
variadas, pero en todas ellas hay una fase
móvil que consiste en un fluido (gas,
líquido)que arrastra a la muestra a través de
una fase estacionaria que se trata de un
sólido o un líquido fijado en un sólido.
Los componentes de la mezcla interaccionan
en distinta forma con la fase estacionaria. De
este modo, los componentes atraviesan la
fase estacionaria a distintas velocidades y se
van separando. Después de que los
componentes hayan pasado por la fase
estacionaria, separándose, pasan por un
detector que genera una señal que puede
depender de la concentración y del tipo de
compuesto.
La cromatografía puede cumplir dos funciones
básicas que no se excluyen mutuamente:
Separar los componentes de la mezcla, para
obtenerlos más puros y que puedan ser usados
posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
Medir la proporción de los componentes de la
mezcla (finalidad analítica). En este caso, las
cantidades de material empleadas son pequeñas.
Cromatografía líquida
High pressure liquid
chromatography (HPLC).
HPLC es una cromatografía en
fase líquida en columna a la cual
se aplica una sobrepresión que
permite acelerar el proceso de
separación.
El HPLC es una técnica utilizada
para separar los componentes de
una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones
químicas entre las sustancias
analizadas y la columna
cromatográfica.
• En esencia, la fase móvil líquida (constituida por
un disolvente adecuado que vehicula a la
muestra) se bombea a través de un sistema de
separación compuesto por un prefiltro y una
columna, esta última conteniendo la fase
estacionaria, a una elevada presión. Por su
distinta interacción entre las dos fases, la muestra
es retenida con variable intensidad, eluyendo
separada de la columna.
 Modos de Trabajo en HPL
Fase Normal.
Fase Reversa.
Fase Reversa con Par Iónico.
Intercambio Iónico.
Exclusión Molecular (GPC / GFC)
Separación Quiral
 Fase Reversa
Se caracteriza por:
Columna: Propiedades No Polares.
Ejemplo: Columnas C10, C18, etc.

Solvente: Propiedades Polares.

Ejemplo: Agua, Metanol, Acetonitrilo o sus
combinaciones
Fase Reversa
Que pasa en el modo Debido a que la Fase estacionaria
“Fase Reversa”? es netamente No Polar, esta
retendrá más fuertemente a aquellos
compuestos del tipo No Polar (estos
tendrán mayor tiempo de retención
ya que serán más fuertemente
atraidos), que a los Polares. Esto se
debe a la interacción Hidrofóbica.
Fase Reversa
...Y que es Hidrofobicidad?
El término “Hidrofóbico” se define como
toda aquella sustancia que no se mezcla
con el agua.
En HPLC, el término Hidrofóbico se aplica
a todas aquellas moléculas o sustancias de
naturaleza No Polar, o de muy baja
Polaridad.
Hidrofobicidad por lo tanto, se traduce
como la propiedad de rechazar aquellos
moléculas o sustancias de alta o mediana
polaridad y ser afin a todas aquellas
sustancias o moléculas No Polares o de muy
baja Polaridad.
Como ocurre esta interacción?
En el modo de trabajo “Fase
Reversa”, las moléculas o sustancias
No Polares
“No Polares” (o de muy baja
Polaridad, llamadas Sustanicas
Hidrofóbicas), sufren interacciones
moleculares con la fase estacionaria,
Medianamente
siendo retenidas más tiempo en ella, Polares
mientras que los compuestos polares
no son retenidos y salen rapidamente
de ella.
Polares
La Interacción Hidrofóbica
Si la muestra presenta:
• Cadenas Carbonadas H3C
CH2

• Grupos Aromaticos
La Interacción Hidrofóbica es fuerte.
Si la muestra presenta:
• Grupos Carboxilo ( - COOH )
• Grupos Amino ( - NH2 )
• Grupos Oxidrilo ( - OH )
La Interacción Hidrofóbica sera muy debil.
Modos de Trabajo en HPLC
Fase Reversa
Hidrofobicidad
El Tiempo de Retención y la Interacción Hidrofóbica
OH

CH3 HO CH3
H3C CH3

H 3C CH3

Interacción
Interacción Hidrofóbica
Hidrofóbica “Debil”
CH3
“Fuerte”

t0 t1 t2 t (min)
Fase Reversa
El efecto de la Polaridad del Solvente
20 % (Agua) 30 % (Agua) 40 % Agua
1
2
1
3 1
2
4 3 2

4 3

0 2 4 6 (min) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 (min)
0 2 4 6 8 (min)

1
p - Hidroximetilbenzoato
2
p - Hidroxietilbenzoato
3
p - Hidroxipropilbenzoato Solvente Base: Metanol
4
p - hidroxibutilbenzoato
Fase Reversa
El efecto de la Fase Estacionaria

C4 CH3 HO CH3 CH3 HO CH3

C8
H3C CH3 H3C CH3

H 3C CH3 H 3C CH3

Interacción Interacción Hidrofóbica

Hidrofóbica “Debil” “Media”
CH3 CH3

CH3 HO CH3
C18
H3C CH3

H 3C CH3

Interacción Hidrofóbica
CH3
“Fuerte”
Fase Reversa
El Efecto de la Fase Estacionaria
1 2 34
 Condiciones Analíticas
1 Columna : Shim-Pack CLC – ODS
Fase Movil : Metanol:Agua (7:3)
Razón de Flujo : 1.o mLmin
Temperatura : 40 oC
2
1 Volumen : 10 uL
3 4 Detector : UV, 254 nm
2
34  Analítos
1. Metilbenzoato
2. Etilbenzoato
3. n – Propilbenzoato
ODS C8 (Octilsilano) TMS 4. n - Butilbenzoato
(Octadecilsilano) (Terfenilsilano)
Determinación de la
Vitamina A en
alimentos infantiles
instantáneos por
Cromatografía
Líquida de Alto
 Vitamina A
• La vitamina A o retinol es una
vitamina liposoluble. En química es
descrito como un alcohol polienico
isoprenoide.
• Se conoce también como retinol, ya
que genera pigmentos necesarios
para el funcionamiento de la retina o
también como un ácido (ácido
retinoico).
También se puede requerir para
la reproducción y la lactancia. El
β-caroteno, que tiene
propiedades antioxidantes, es un
precursor de la vitamina A.
La vitamina A es sensible a la luz
con temperaturas elevadas
• El déficit de vitamina A ocasiona
problemas de la vista, y más
concretamente en la visión
nocturna. Un déficit prolongado
genera una serie de cambios
radicales a nivel ocular. El proceso
ocurre de forma progresiva y si la
carencia es por un largo periodo,
puede desembocar en ceguera total
• Otros cambios incluyen el
incremento de la susceptibilidad a
las infecciones, sequedad en las
mucosas y en la piel.
• El exceso proboca alteraciones óseas
y hemorragias en diversos tejidos
DETERMINACIÓN DE LA
VITAMINA A
• Los métodos Espectrofotométricos y
fotométricos empleados en la determinación de
la vitamina A están expuestos a interferencias de
algunas sustancias como la presencia de
carotenos, derivados y productos de la
descomposición de la vitamina A.
• Estos de alguna forma podrían absorber luz en la
región ultravioleta o dar colores similares con los
reactivos utilizados en la determinación
fotométrica.
• Por eso estos métodos no
son lo suficientemente
específicos para determinar
esta vitamina, agregando
que la confiabilidad de sus
resultados dependerán del
éxito en los pasos de
purificación y los
procedimientos del trabajo.
• Por estas razones se optó
por utilizar HPLC, ya que es
más preciso en sus datos.
MATERIALES
 Equipo
• Equipo de
cromatografía
líquida de alto
rendimiento
(HPLC)
• Inyector automático
Sistema que
inyecta la muestra a
la columna
• Bomba con sistema
de desgasificación.
Controla el flujo del
disolvente.
• Columna
cromatográfica de
acero inoxidable.
• Detector de
arreglos de
iodos
(Longitud
de onda
variable)
CONDICIONES DE OPERACIÓN
• Sistema isocrático
• Flujo 1.2 mL/min
• Volumen de inyección
20ml.
• Detección UV 242 nm
• Temperatura de horno
ambiente.
• Tiempo de corrida 7
minutos
• Fáse móvil metanol al
100% grado HPLC
REACTIVOS
• Metanol grado HPLC
• Estándar all-trans retinol: vitamina A
• Hexano
• Etanol absoluto
• Solución de hidróxido de potasio al 50%
• BHT o Ácido Ascórbico (antioxidantes)
• Agua tridestilada o grado HPLC.
• Solución Stock estándar de vitamina a: Se
disolvió 100 mg del estándar en 100ml de etanol
absoluto, con aproximadamente 0.002g de BHT
y se guardó la solución en congelación (-20ºC)