Claudio Rodríguez Martínez1,

Metodología para la Raisa Zhurbenko2, Tamara Lobaina

Rodríguez3, Marilyn Díaz Pérez4, Ivonne
medición de la Alfonso Valdés5, Diana Rosa Viera Oramas6
1 claudio@biocen.cu
incertidumbre en Centro Nacional de Biopreparados
2 raisa@biocen.cu
microbiología aplicada Centro Nacional de Biopreparados
a las producciones 3 lobaina@biocen.cu

Centro Nacional de Biopreparados

asépticas 4 marilyn.diaz@biocen.cu

Centro Nacional de Biopreparados

5 ivonne.alfonso@biocen.cu

Centro Nacional de Biopreparados

6 diana@biocen.cu

Centro Nacional de Biopreparados

Introducción: En los últimos años se ha avanzado en la concepción de modelos
para determinar la incertidumbre en las mediciones microbiológicas
relacionadas con las producciones biofarmacéuticas. La acreditación de los
laboratorios de ensayo incluye como componente esencial la medición de la
incertidumbre, no sólo para su certificación, sino para la validación o
verificación de métodos. El objetivo de la investigación consistió en brindar
esquemas metodológicos para determinar incertidumbre en mediciones que
por sí mismas son altamente variables por sus reducidos valores.
Materiales y Métodos: Se analizaron regulaciones y artículos científicos
actuales sobre el tema. Se ejecutaron ensayos en condiciones de repetibilidad y
reproducibilidad con simulación de los procesos y ensayos que son
característicos del procesamiento aséptico y sus producciones. Los ensayos se
ejecutaron con microorganismos de interés tales como E. coli, coliformes,
Salmonella, Enterococcus y Aeromonas. Una vez finalizados el conjunto de
experimentos se elaboraron esquemas de ensayo bajo diferentes condiciones.

Resultados y Discusión: Se aportan esquemas para la incertidumbre de

reducidos valores de recuentos en placas, como los de placas expuestas,
recuentos de microorganismos específicos en condiciones de robustez en el
tiempo, mediciones en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad
intermedia; incertidumbre de laboratoristas y del laboratorio en su conjunto.
 ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS
OBJETOS DE EVALUACIÓN DE
LA INCERTIDUMBRE
• Materias primas
• Aguas
• Monitoreo del personal
• Monitoreo ambiental
• Monitoreo de superficies
CONDICIONES DE MEDICIÓN DE
INCERTIDUMBRE
• Repetibilidad de laboratorista
• Reproducibilidad del laboratorista
• Repetibilidad del laboratorio
• Reproducibilidad intermedia del
laboratorio
• Robustez en las condiciones de exposición
de las placas
• Robustez en el tiempo de incubación de
placas expuestas
• Robustez en el tiempo de incubación de
otros ensayos

Recomendamos: determinar el intervalo de tolerancia para el cálculo de la

incertidumbre en condiciones de bajos valores de los recuentos (n ˂ 30 UFC), ya
que la determinación de los límites que en sentido probabilístico cubren los
valores individuales de la población microbiana mediante un intervalo de
confianza sobre una proporción fija de las mediciones se considera exacta la
cobertura de 95% de las observaciones medidas.
VARIABILIDAD DE LOS DATOS EN CONDICIONES DE BAJO VALORES
DE RECUENTO
Teniendo en cuenta que los recuentos microbianos siguen la distribución de
Poisson, se propone transformar todos los datos a Log base 10 para lograr la
distribución normal.

La utilización de intervalos de tolerancia se propone teniendo en cuenta el

tamaño de la muestra, la confiabilidad y la variabilidad de los datos, lo que
implica una ventaja frente a los límites establecidos a partir de la desviación
estándar, en cuyo proceso únicamente se considera la variabilidad de los datos.

El número de muestras utilizado (al menos 20 unidades de muestra para cada

ambiente, superficie, esterilidad del material y medios de cultivo) obedece a que
en los intervalos de tolerancia se establecen límites para observaciones
individuales futuras, para los cuales no se va a requerir un número específico de
mediciones, ya que para cada n existe un factor de tolerancia dentro de la
distribución normal, a un nivel de confiabilidad definido (por lo general de 95%,
pero se pudiera incluso tomar el 99%) que, al multiplicarse por la desviación
estándar, da como resultado el límite de tolerancia de su respectiva población.
PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA DETERMINACIÓN DELL
INTERVALO DE TOLERANCIA PARA MEDICIONES
CON BAJOS RECUENTOS
Transformación de los datos individuales a Log

Determinación de la media (promedio)

 Considerar emplear el 95 % de los límites IC
(CL95%) de la media a partir de:
CL = Ẋ ± t95% S/√n

Valor de la media Desviación estándar

Estadígrafo t de Student para 95 %

y diferentes tamaños de muestras
 CÁLCULOS DE LA INCERTIDUMBRE PARA RECUENTOS
SUPERIORES A 30 UFC
Determinar la desviación estándar de la reproducibilidad (Sr)

Determinar la desviación estándar de la repetibilidad (SR)

Determinar la Incertidumbre (desviación estándar) combinada

(de la reproducibilidad y de la repetibilidad) como:

2
𝑈𝑐 = √𝑆𝑟 +𝑆𝑅2
Determinar la Incertidumbre expandida como:

Factor de
𝑼𝒆 = 𝑼𝒄 𝐱 k cobertura, se toma
para n > 30 un valor
de 2
 EJEMPLO DE EXPRESIÓN DE LA INCERTIDUMBRE PARA
RECUENTOS MAYORES DE 30 UFC/PLACA
VALOR INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE
COMBINAADA EXPANDIDA
1,5 X 103 ufc/mL ± 9 % ufc/mL ± 18 % ufc/mL

1,5 ± 0,1 x 103 ufc/mL

1,4 x 103 a 1,6 x 103 ufc/mL
1,5 x 103 ± 18 % ufc/mL
 SE PROPONE ELIMINAR LOS RESULTADOS ABERRANTES
BASADA EN LA ELIMINACIÓN DE DATOS ATÍPICOS A PARTIR DEL CÁLCULO DE LA
MEDIANA
Aplicar sólo a los datos de biocarga y microorganismos específicos en materias
primas, IFAs, graneles, productos terminados y nunca a datos del monitoreo
ambiental
La aplicación de intervalos de tolerancia implica la aplicación de procedimientos
estadísticos para la eliminación de datos atípicos, cuya inclusión podría derivar en
la desviación de los valores de tendencia central y dispersión, como las medias y
desviaciones estándar.
Una regla para la detección de valores atípicos está dada por señalar como datos
atípicos aquellos que cumplan la siguiente condición:

Donde med (xi) es la mediana de las observaciones y MEDA (xj) es la mediana de

las desviaciones absolutas con respecto a la mediana
Conclusiones: Se logran esquemas actualizados de medición de la incertidumbre de las
mediciones en la industria que cumplen con los requisitos más actuales de acreditación.