LABORATORIO

INMUNOLOGIA
 PCR
 La proteina C reactiva pertenece a la clase de
reactantes de fase aguda
 Esto quiere decir, en los procesos inflamatorios que
tienen origen en el cuerpo, aumentan de manera
espectacular lo niveles de proteína C reactiva.
 Es te aumento es debido a un incremento de IL-6
en la concentración de plasma, que es producido
mayormente por adipocitos y también por
macrófagos.
 La proteina C reactiva esta ligada a la fosfocolina
en microbios. Se cree que es utilizada ayudar en la
unión complementaria para células extrañas y
dañadas y también mejorar la fagocitosis por los
macrófagos.
 PCR
 La PCR es una Beta globulina de
fase aguda con una masa molecular
de 118.000 daltons.
 Es una proteína no glicosilada de
simetría cíclica.
 Estable en suero >20 años a -70
ºC
 Niveles elevados de PCR en suero o
plasma los encontramos como
respuesta no específica a
infecciones, inflamaciones no
infecciosas, AR ,ECV …
PROTEÍNA C REACTIVA
(PCR)

 Es el marcador más útil como RFA

 Método directo para la estimación de la
respuesta inflamatoria aguda
 Glucoproteína no presente normalmente en
el suero (206 aa)
Valores normales:
 <10 mg/l ausencia de inflamación
 10-50: inflamación ligera
 > 50: inflamación grave
 Encontramos:
-Respuesta intensa (>1 mg/dL) en :
Infección: bacterias > hongos > virus
( meningitis, neumonía,…)
Inflamación aguda ( AR , pancreatitis )
Tumores sólidos, traumatismos, cirugía
-Respuesta moderada (<1 mg/dL) en :
Leucemias
Autoinmunidad: DM, C.ulcerosa/Crohn, …
 La PCR es sintetizada en el hígado y normalmente sólo se detectan
trazas en circulación.
 Cuando se produce algún daño al tejido:
-Aumento detectable a las 6-8 horas
-Pico en 48 horas
-Descenso a partir de las 48 horas
PROTEINA C REACTIVA
(PCR)
Características:
 Buena correlación con variaciones en la
actividad y con la secuencia temporal
 “ESPECIFICIDAD”: valores normales
descartan
 Gran utilidad diagnóstica, de control y
pronóstica
Funciones:
  Inducción de la actividad fagocítica
  Evaluación de estrés, traumatismo,
infección e inflamación
  Se eleva en la inflamación y la necrosis
tisular
PROTEINA C REACTIVA
(PCR)
Utilidad:
 Indicador precoz de inflamación, incluso antes que
la clínica, se eleva a las 3 horas
 Postcirugía, niveles elevados tras 2 días suelen
indicar complicación quirúrgica
 En fase precoz postransplante si no existe infección
indica rechazo
 Su disminución indica buena respuesta al
tratamiento antibiótico
 Interés como marcador de riesgo cardiovascular
(cardiopatía isquémica)
 Indicador de necrosis tisular (apendicitis, colecistitis)
 Elevación asociada a alfa-1 glucoproteína en
neonatos en las primeras horas o días sugiere
infección bacteriana
 SEROLOGIA TBC
Aunque se han hecho muchos esfuerzos para el
desarrollo de pruebas serológicas, no se emplean
mucho debido a su limitada sensibilidad y
especificidad. En los últimos años se han utilizado
antígenos más purificados, que han aumentado la
sensibilidad y especificidad, como el antígeno de 38
kDa, lipoarabinomanano, el antígeno 60 y el complejo
antigénico 85.
SEROLOGIA TBC
También se han desarrollado técnicas para
la detección de antígenos micobacterianos
en muestras clínicas, con una sensibilidad y
una especificidad muy variables; los
mejores resultados se han obtenido en LCR.
 SEROLOGIA LEGIONELA
La prueba serológica más utilizada para la detección
en suero de anticuerpos frente a Legionella es la IFL
Valores mayores o iguales a 1/128 tienen valor
diagnóstico. El problema es que este valor puede
aparecer a las 2 o 3 semanas del comienzo de la
enfermedad, por lo que tiene valor retrospectivo.
También se considera diagnóstico un aumento de
cuatro veces o más el nivel de anticuerpos en dos
muestras en suero obtenidas con 2 o 3 semanas de
separación.
SEROLOGIA CHLAMYDIA
El diagnóstico de infección por Chlamydia se realiza
mediante cultivo celular o técnicas serológicas. La
técnica serológica más común es la
microinmunofluorescencia indirecta, aunque las
técnicas de ELISA son más fáciles de realizar. En esta
prueba se utiliza como antígeno LPS de Chlamydia
donde se encuentran los antígenos comunes a las
distintas especies. En la primoinfección por
Chlamydia suele aparecer la IgM de forma más
precoz que la IgG; en las reinfecciones es
infrecuente la aparición de IgM, aunque la
seroconversión de IgG es más precoz.
 SEROLOGIA CHLAMYDIA
CHLAMYDA ELISA IgG/IgM (ref. G/M1003) es una
prueba immunoenzimática indirecta para determinar
anticuerpos IgG y/o IgM frente a Chlamydia en suero
humano.

El método de ELISA está basado en la reacción de los

anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a la
superficie de poliestireno.
SEROLOGIA CHLAMYDIA
Las inmunoglobulinas no unidas por
reacción con el antígeno son eliminadas en
el proceso de lavado. En un paso posterior
la globulina anti-humana reacciona con el
complejo antígeno-anticuerpo, y la que no
se une es eliminada por los lavados; la
unida reacciona con el sustrato (TMB), para
dar una reacción coloreada azul, que
cambia a amarillo tras la adición de la
solución de parada.
 PRUEBA RAPIDA INMUNOTEST -
NEUMOCOCO
El interés por el examen urinario obedece a que los
antígenos microbianos se concentran en la orina más
que en otros fluidos y a que en ella no existen
anticuerpos que alteren los resultados. La detección
de antígenos urinarios del neumococo (habitualmente
polisacáridos de la cápsula) .
Recientemente un método basado en la
inmunocromatografía de membrana, Binax NOW, ha
sido aprobado por la Food and Drug Administration
para el diagnóstico rápido (15 min) de la neumonía
por S. pneumoniae , que detecta el polisacárido C,
común a todos los serotipos y a patógenos como S.
mitis y S. oralis .
PRUEBA RAPIDA INMUNOTEST -
NEUMOCOCO
La sensibilidad en pacientes sin bacteriemia
es del 50-80%, y del 75-85% cuando existe
bacteriemia, mientras la especificidad es
superior al 95%1-6. La variación en la
sensibilidad se explica fundamentalmente,
en la NAC no bacteriémica, por la distinta
fiabilidad de los métodos con los que se
compara el resultado.
PRUEBA RAPIDA INMUNOTEST -
LEGIONELA
De las técnicas de gran laboriosidad que
demostraban mediante radioinmunoanálisis la
presencia de antígeno en la orina se ha pasado a
otras de enzimoinmunoanálisis y, finalmente a la
inmunocromatografía de membrana. Ambos
sistemas tienen una rentabilidad similar, aunque
con 2 ventajas claras a favor del último: no es
necesario un laboratorio específico y es más rápido
(15 frente a 90 min). Con el enzimoinmunoanálisis se
han detectado resultados positivos para
serogrupos de L. pneumophila. No obstante, eso no
parece ser una ventaja añadida, dado que en la
gran mayoría de los casos (el 90% al menos)
participa el serogrupo 1. Por ello, de ahora en
adelante nos referiremos al método
inmunocromatográfico.
La prueba es positiva si están coloradas las
líneas control y muestra. Si a los 15 min el color
es de escasa intensidad, se debe comprobar
después de otros 45 min; de no cambiar, hay
que considerar negativo el resultado. En
inmunodeprimidos, y cuanto mayor sea la
duración de la fiebre, es posible que el
resultado siga siendo positivo durante más de 60
días. El tratamiento antiinfeccioso no interfiere
con los hallazgos del análisis.
ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Prueba Inmunoadsorbente
Ligado a Enzimas
 ELISA
HISTORIA
 1959 Yalowy Berson, precursor de los ensayos
inmunoenzimáticos que fueron descritos
originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y Van
Wemeny y Schuurs.
 El uso de material radiactivo ha limitado el uso del
radioinmunoensayo, y a la ves a popularizadp el
empleo del inmunoensayo enzimático (EIA), del que
hay dos técnicas principales:
 El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
 El ensayo inmunológico multiplicado por enzimas.

ELISA
La prueba de ELISA se basa en la reacción
antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de
reactividad conocida.
 El color se genera por la interacción de un sustrato
cromogénico y una enzima que ha sido acoplada
al anticuerpo detector.
 Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el
antígeno en la fase sólida, como una capa de
captura.
 Después de la reacción del antígeno con el suero
del paciente, la capa de detección puede ser un
reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM
o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos
clase específicos
 ELISA
 Losmétodos de ELISA dependiendo de la
actividad enzimática se dividen en dos
tipos:
 Competitivos
 No competitivos
 ELISA
 ELISA COMPETITIVO:
En este método, el anticuerpo de la
muestra va a competir con el conjugado
por un número limitado de sitios de unión
del antígeno. Habrá ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el
sustrato no encontrará a la enzima porque
el conjugado ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la muestra.
 ELISA
 ELISANO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el
antígeno o anticuerpo que está en la
fase sólida. Si una muestra es positiva se
formará el complejo antígeno-anticuerpo
y al agregar el conjugado reaccionará
con el respectivo sustrato desarrollando
color
 ELISA

 Dentro de los no competitivos tenemos:

 Los directos que detectan antígenos
 Los indirectos que detectan anticuerpos.
 ELISA
 Pasos generales de un ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos
o anticuerpos
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o
antígeno tapizado en el posillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o
antígeno no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no
unida
8. Adición del sustrato
9. Unión del sustrato a la enzima
10. Desarrollo del color
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (2)
ELISA Competitiva (3)
ELISA Competitiva (4)
ELISA Competitiva (5)
ELISA Competitiva (6)
ELISA Competitiva (7)
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (9)
ELISA Competitiva (10)
Marcadores enzimáticos más
comúnmente utilizados
Enzima-sustrato-tampón
 HRPO (peroxidasa de rábano) OPD 10 mg/25 mL de tampón citrato sódico
0,15 M pH 5; añadir microL de 30 % peróxido de hidrógeno 30 %.
 TMB 2,5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico
0,1 M pH 6; añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
 ABTS 60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0,1 M pH 6; añadir 35 microL de
peróxido de hidrógeno 30 %; parar con fluoruro sódico 1,25 %; leer a 405 nm.
 DAB 10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y añadir 20 microL de
peróxido de hidrógeno 1 %.
 CNP 6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50 mM pH 7,4;
filtrar y añadir 40 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
 AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampón
acetato 0,1 M pH 4,5; filtrar y añadir 50 microL de peróxido de hidrógeno
30 %.
 ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6,0 con 1 mM
NaOH y añadir 10 % por volumen de 0,05 % peróxido de hidrógeno; parar
con 25 microL de NaOH 1 M.
Marcadores enzimáticos más
comúnmente utilizados
Enzima-sustrato-tampón
 AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0,1 M pH 9,8 + 1 mM
cloruro de magnesio.
 NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de
vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/10 ml de tampón Tris 0,05 M pH 9,2 - 2 mM cloruro de
magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
 NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de
vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampón Tris 0,05M pH 9,2 - 2 mM cloruro de
magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
 BCIP 1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol).
 beta-G ONPG 2,5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 + 1 mM cloruro de
magnesio + 0,1 M beta-mercaptoetanol.
 ureasa BP 8 mg/1,48 ml de 0,01 M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; añadir
100 mg de urea y EDTA a 0,2 mM; ajustar el pH a 4,8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a
4 °C.
 PG IS Añadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en
secuencia: (A) 1 % (peso/vol) gelatina en 0,1 M tampón fosfayo pH 7,0; (B) 1 % (peso/vol)
almidón en agua destilada caliente; (C) 3,04 mg/mL de benzil-penicilina en 0,1 M tampón
fosfato pH 7,0 (5000 U/mL); (D) 0,01 N ioduro en 0,1 M KI solución stock (en una botella
oscura).
Aplicación de ELISA
 Enfermedades producidas por parásitos
 Babesias y tripanosomas
 Toxocara canis
 Toxoplasmosis
 Triquinosis
 Enfermedades producidas por Micoplasmas
 Enfermedades producidas por bacterias
 Mycobacterium tuberculosis
 Brucelas
 Enterotoxinas Vibrio cholerae
 Estreptococos
 Salmonelas
Aplicación de ELISA
 Enfermedades producidas por virus
 Enfermedad de Aujeszky
 Enfermedad de Newcstle
 Fiebre aftosa
 Leucemia felina
 Peste porcina africana
 Peste porcina clásica
 Rinotraqueitis infecciosa
 Rotavirus
 Artritis vírica
Aplicación de ELISA
 Otras aplicaciones
 Hormonas
 Gonadotropina coriónica
 Progesterona
 Testosterona
 Hormonas tiroideas
 Cuantificación de inmunoglobulinas
 IgG
 IgE
 IgA
 Inmunopatología
 Anticuerpos anti-DNA
 Factor reumatoide
 Inmunocomplejos circulantes
Western
blotting,
inmunoblotting
o SDS-PAGE
Tecnica para detectar
proteinas especificas
separadas por electroforesis
utilizando anticuerpos
marcados.
Secuencia del Western blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas

Transferir las proteinas desde el gel a membrana de

nitrocelulosa

Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia

Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la

membrana de nitrocelulosa

Incubacion con el anticuerpo especifico primario

Lavados del anticuerpo no unido

Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos

conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP)

Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con

placas radiograficas
Secuencia del Western blot – Paso 1
Paso 1
Electroforesis de las muestras de proteínas:

-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias

como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen
puentes -S-S-
-El SDS aporta cargas negativas
-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en
Fuente
poder
de el

gel de acuerdo a su peso molecular

Muestra de proteínas
para cargar en el gel

Proteínas ya corriendo
en el gel
Secuencia del Western blot – Paso 2
Paso 2 - Transferencia a la membrana de nitrocelulosa:
-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas

Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar

Se detiene la corrida electroforetica el gel con las proteinas separadas por masa El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transfere

Se quitan las burbujas para asegurar

la correcta transferencia Armado del cassette de transferencia Cassette listo para iniciar transferencia
Paso 3
Incubación con anticuerpos específicos y revelado:

Proteína sobre la membrana Paso 4

Revelado y análisis:

Bloqueo de los sitios no ocupados en

la membrana con proteína inerte (ej.
Albúmina)

Incubar con anticuerpo

primario

Incubar con anticuerpo

secundario marcado con HRP

Incubar con sustrato especifico

Revelado
quimioluminiscente

Proteína de interes se ve como una

banda oscura
Fundamento de la tecnica de revelado
quimioluminiscente

-El anticuerpo secundario esta

marcado con HRP (peroxidasa)
que en presencia de agua
oxigenada degrada el luminol
con emisión de luz

-La emisión de luz (fotones)

se revela en oscuridad
sobre una placa radiográfica
sensible a la luz

-Las bandas se obtienen en el film

en la misma posición donde
se encontraba la proteína

-Alta sensibilidad
Existen otras tecnicas de revelado de WB
sustrato enzima H2O2 producto quimioLum Obs
coloreado
luminol HRP si no si muy sensible

3,3´diaminobencidina HRP si marrón no toxico

DAB+niquel HRP si negro no toxico, mas

sensible que
DAB
3,3´,5, 5´ HRP si azul no producto
tetrametilbencidina semisoluble
4 cloro naftol HRP si azul-negro no poco
sensible
Bromocloroindolil FAL no azul no reaccion
fostato +NBT lenta y
progresiva
Naftol-AS-MX fosfato FAL no rojo no poco
+ Fast red sensible
AP/misty purple FAL no purpura no muy estable

HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina

Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV

env gp160
gp120 -Se corren proteínas de HIV
gp 41
-Se transfieren a nitrocelulosa

gag p55 -Se incuba la membrana con suero

del paciente
p18
p24 -Se revela con anticuerpos secundar

pol p65
p51
p31
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
Criterio de la OMS:
env gp160
-Negativo: Ninguna banda presente
gp120 -Positivo: Dos bandas ENV presentes
gp 41 -Indeterminado: Cualquier banda que no alcance c
de positividad

gag p55
p18
p24

pol p65
p51
p31
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
Seroconversion de un paciente

gp160/120

p66
p55/51
gp41

p32

p24

p17
APLICACIONES
 Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el
Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un
resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población
donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se
buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se
transfieren a una membrana las proteínas de células que, se sabe, están
infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con
esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo
primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el
papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no
unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario
anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de bandas indica la
presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene
anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.
 Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme
bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
 Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western
blot.
FIN