ANÁLISIS DE

ALIMENTOS
Ing. Ana Celina Lancho Ruiz
 Segunda Unidad

Métodos de separación y extracción.

Análisis Cromatográfico en alimentos.

Estudio de Vitaminas, Pigmentos y

Colorantes.
 ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO EN
ALIMENTOS
Cromatografía es el método físico de
separación para la caracterización de mezclas
complejas.
Objetivo: separar los distintos componentes
de una mezcla.
En las técnicas cromatográficas existe una
fase móvil y una fase estacionaria.
Los componentes de la sustancia interactúan
entre si hasta obtener la separación de estos
mediante la fase estacionaria.
ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA EN
ALIMENTOS

O La cromatografía es un método físico de

separación para la caracterización de
mezclas complejas.

O Se basa en el principio de retención

selectiva, identificar y determinar las
cantidades de componentes separados.
ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA EN
ALIMENTOS

Diferencias sutiles en el coeficiente de

partición de los compuestos da como
resultado una retención diferencial sobre la
fase estacionaria y por tanto una separación
efectiva en función de los tiempos de
retención de cada componente de la mezcla.
CROMATOGRAFÍA EN ALIMENTOS
FUNCIONES

 Separar los componentes de la mezcla, para

obtenerlos más puros y que puedan ser
usados posteriormente (etapa final de
muchas síntesis).

 Medir la proporción de los componentes de

la mezcla (finalidad analítica). En este caso,
las cantidades de material empleadas son
pequeñas.
CROMATOGRAFÍA EN ALIMENTOS

O El botánico ruso Mijaíl Tsweet1 (Mikhail

Semenovich Tsweet, 1872-1919) empleó
por primera vez en 1906:

O El término "cromatografía" que significan

respectivamente chroma "color" y graphos
"escribir".
CROMATOGRAFÍA EN ALIMENTOS

O A comienzos del año 1903, Mijail Tsweet

usó columnas de adsorción de líquidos para
separar pigmentos vegetales (por ejemplo,
clorofilas).
CROMATOGRAFÍA EN ALIMENTOS

Las disoluciones se hacían pasar a través de

una columna de vidrio rellena de carbonato de
calcio, que finamente dividido de un material
poroso que interacciona de forma diferente
con los componentes de la mezcla, de forma
que éstos se separaban en distintas bandas
coloreadas a lo largo de la columna.
 Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por

la columna cromatográfica a través de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con
pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie)
mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a
alta presión a través de la columna.
 Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)

La muestra a analizar es introducida en

pequeñas cantidades y sus componentes se
retrasan diferencialmente dependiendo de las
interacciones químicas o físicas con la fase
estacionaria a medida que adelantan por la
columna.
Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)
 Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)
El grado de retención de los componentes de
la muestra depende de:
O La naturaleza del compuesto,
O Composición de la fase estacionaria y de la
fase móvil.
El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido
de la columna es el tiempo de retención y es
propiedad identificativa característica de un
compuesto en una determinada fase móvil y
estacionaria.
 Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)
El uso de presión incrementa la velocidad
lineal de los compuestos dentro de la columna
y reduce así su difusión dentro de la columna
mejorando la resolución de la cromatografía.
Los disolventes más utilizados son:
Agua, el metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el ácido trifluoroacético,
que ayudan a la separación de los
compuestos.
 Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)
En la técnica de HPLC puede darse la
variación en la composición de la fase móvil
durante el análisis, conocida como elución en
gradiente.

Un gradiente normal en una cromatografía de

fase reversa puede empezar a un 5% de
acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta
un 50% en 25 minutos.
 Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)

El gradiente utilizado varía en función de la

hidrofobicidad del compuesto.

El gradiente separa los componentes de la

muestra como una función de la afinidad del
compuesto por la fase móvil utilizada respecto
a la afinidad por la fase estacionaria.
 Tipos de HPLC:
Cromatografía de fase normal
HPLC (NP-HPLC) Separa los compuestos en
base a su polaridad.
Utiliza una fase estacionaria polar y una fase
móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto
de interés es bastante polar.
El compuesto polar se asocia y es retenido por
la fase estacionaria.
La fuerza de adsorción aumenta a medida que
aumenta la polaridad del compuesto y la
interacción entre el compuesto polar y la fase
estacionaria polar (en comparación a la fase
móvil) aumenta el tiempo de retención.
 Tipos de HPLC:
Cromatografía de fase inversa (o reversa)

RP-HPLC consiste en una fase estacionaria

apolar y una fase móvil de polaridad
moderada. Una de las fases estacionarias
más comunes de este tipo de cromatografía
es la silica tratada con RMe2SiCl, donde la R
es una cadena alquil tal como C18H37 o
C8H17. El tiempo de retención es mayor para
las moléculas de naturaleza apolar, mientras
que las moléculas de carácter polar eluyen
más rápidamente.
 Tipos de HPLC:
Cromatografía de fase inversa (o reversa)
 Tipos de HPLC:
Cromatografía de fase inversa (o reversa)
El tiempo de retención aumenta con la adición
de disolvente polar a la fase móvil y disminuye
con la introducción de disolventes más
hidrofóbicos.
La cromatografía de fase reversa se basa en el
principio de las interacciones hidrofóbicas que
resultan de las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar, y una fase estacionaria
apolar.
 Cromatografía de exclusión molecular

Cromatografía por filtración en gel:

separa las partículas de la muestra en función
de su tamaño.

Es una cromatografía de baja resolución de

forma que se suele utilizar en los pasos
finales del proceso de purificación.

Es útil para la determinación de la estructura

terciaria y la estructura cuaternaria de las
proteínas purificadas.
 Cromatografía de intercambio iónico

La retención se basa en la atracción

electrostática entre los iones en solución y las
cargas inmovilizadas a la fase estacionaria.

Los iones de la misma carga son excluidos

mientras que los de carga opuesta son
retenidos por la columna.
 Cromatografía de intercambio iónico

Los tipos mas empleados de intercambiadores

iónicos son:
i) Resinas de poliestireno,
ii) Intercambiadores iónicos de celulosa y
dextranos (geles) y
iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro
controlado.

En general los intercambiadores iónicos

favorecen la unión de iones elevada carga y
radio pequeño.
 Cromatografía basada en bioafinidad

Se basa en la capacidad de las sustancias

biológicamente activas de formar complejos
estables, específicos y reversibles.
La formación de estos complejos implica la
participación de Fuerzas moleculares e
interacciones de:
Van der Waals, Electrostáticas,
Dipolo-dipolo, Hidrofóbicas y puentes de
hidrógeno
Entre las partículas de la muestra y la fase
estacionaria.
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
 Cromatografía de gases
Detector de Ionización de Llama
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
Cromatografía de gases
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

O SFC es una técnica híbrida entre la

cromatografía de gases (GC) y la HPLC, que
combina lo mejor de ambas técnicas.
O Esta técnica es importante porque permite
la separación de mezclas en las que no es
adecuada la aplicación de la GC ni de la
HPLC.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

Se aplica a compuestos no volátiles o

térmicamente inestables que no pueden ser
separados mediante GC, o aquellos que
contienen grupos funcionales que
imposibilitan su detección en HPLC.
CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS
CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS
CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

Instrumentación
Debido a las características de la fase móvil
(alta presión y temperatura) se emplean
equipos parecidos a los de HPLC.

El empleo de un horno termostático para

poder controlar con precisión la temperatura
de la fase móvil.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

Instrumentación
El uso de un restrictor, empleado para poder
mantener por una parte la presión en el
interior de la columna y por otra parte permitir
la bajada de la presión a la salida para que el
fluido supercrítico (SF en adelante) pase al
estado gaseoso y pueda ser detectado
adecuadamente el analito.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

Instrumentación
Básicamente, un restrictor es un tubo capilar
de unos 2 a 10 cm de longitud y un diámetro
interno menor al de la columna (típicamente
1/10 del diámetro), donde a la salida el SF
expande y pasa al estado gaseoso y se puede
mantener simultáneamente la presión en el
interior de la columna.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

A diferencia de la cromatografía de gases, en

la SFC no se aumenta la velocidad de elución
modificando la temperatura, sino la presión
del SF.
El aumento de presión, al aumentar la
densidad, permite una mayor interacción
analito-fase móvil y disminuye los tiempos de
elución.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

Se suele emplear en las eluciones una

primera etapa isobárica para luego aumentar
la presión lineal o asintóticamente hasta el
final de la elución.
Fases estacionarias :
Al igual que en la GC:
Columnas capilares o de relleno, prefiriéndose
las primeras.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS

Las dimensiones son parecidas en longitud, de

10 a 20 m, y el diámetro interno es bastante
menor, de 0,05 a 0,10 mm.
La película interna es de siloxano entrelazado y
polimerizado.
Si se emplean columnas de relleno, su
diámetro interno varía entre 0,5 y 4,6 mm, y el
grosor de la partícula de relleno es de 3 a 10
μm.
En este caso, el recubrimiento es parecido al
empleando en HPLC de reparto.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS: Fases móviles

La fase móvil estrella en la SFC es CO2 por ser:

• Apolar, disuelve una gran variedad de
moléculas orgánicas.
• Transparente a la radiación ultravioleta
• Inodoro
• No tóxico
• Fácil de obtener
• Barato
• No inflamable
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS: Fases móviles

El CO2 tiene la ventaja de que se puede

obtener fácilmente como fluido supercrítico.
Su temperatura crítica es de 31°C y la presión
crítica de 72,9 atm
Otras fases móviles también probadas y
empleadas son el etano, pentano, dietiléter,
amoníaco, tetrahidrofurano,
diclorofluorometano y óxido nitroso.
 CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS: Detectores
O Se puede emplear el detector de ionización
de llama (también usado en GC), por sus
características de universalidad (permite
detectar casi cualquier compuesto
orgánico), alta sensibilidad y bajo
mantenimiento.
O El espectrómetro de masas también tiene
utilidad, al tener una salida en fase gas, y
detectores espectrofotométricos como el de
infrarrojos, ultravioleta, el de emisión por
fluorescencia, el termoiónico y el
fotométrico de llama.