Evaluation of the protective capacity of new mild Citrus tristeza virus (CTV) isolates selected for a

preimmunization program

Autores: Carlos Alexandre Zanutto;

María Julia Corazza; William Mário de
Carvalho Nunes; Gerd Walter Müller.
justificacion
• En los últimos 90 años, la tristeza de los cítricos ha sido considerada una
de las enfermedades cítricas más importantes del mundo (Zanutto,
Corazza, Nunes, & Müller, 2013). El virus de la tristeza es uno de los virus
más letales que pueden afectar a los cítricos, naranjos, pomelos y gran
variedad de híbridos de mandarinas, es un viroide de distribución mundial
que causa una de más enfermedades con mayor importancia económica
en la agricultura de alrededor del mundo, contando con más de 7 millones
de hectáreas cultivadas y cerca de 105 millones de toneladas de fruta
producida (Moreno, Pedro; Ambros, Silvia; Albiach-Martí, María R.; Guerri,
Jose; Pena, 2008).
• Este virus provoca un declive muy rápido de las plantas de naranja agria,
cítrico o mandarinas llevando a la muerte de la planta entera en un
promedio de 3 semanas lo que ha obligado a reconstruir muchas
industrias de cítricos utilizando portainjertos tolerantes a la tristeza o la
recombinación de una de sus proteínas para ensayos de preinmunizacion.
Objetivos

• General:
• Conocer una técnica eficaz que permita preinmunizar a
explantes de cítricos mediante cepas leves del virus de
la tristeza.
• Específicos:
• Justificar el uso del virus de la tristeza de los cítricos en
pruebas de preinmunizacion a plantas.
• Detallar la capacidad protectora de nuevos
aislamientos leves del virus de la tristeza de los cítricos.
• Sintetizar el proceso básico del uso de polimorfismos
para la detección molecular del virus de la tristeza.
 antecedentes
• Varios investigadores han demostrado que los
aislados leves de CTV que se seleccionan en la
misma región donde se usan son superiores a
los aislados obtenidos de otras áreas. Por lo
tanto, se recolectaron yemas de 20 árboles de
cítricos sobresalientes en las áreas
productoras de cítricos en el norte y noroeste
del estado de Paraná (Brasil) y se estableció
que se utilizarán en un programa de
preinmunización
 vocabulario
• Indexado biológico: es una técnica de diagnóstico que en
condiciones óptimas garantiza un resultado preciso.
• Indezar: Inscribir o anotar datos e informaciones
ordenadamente para elaborar un índice con ellos.
• Psorosis: es una enfermedad que causa la muerte de las
plantas productoras de cítricos. Se caracteriza por la
formación de escamas en ramas, ramillas y tronco.
• Exocortis: Enfermedad que puede afectar a los cítricos si no
se lleva a cabo un manejo adecuado del cultivo.
• Caquexia: Decoloración de las partes verdes de las plantas
debido a la falta de luz.
• Dendrograma es un tipo de representación gráfica o
diagrama de datos en forma de árbo.
metodología
 Descripción de las técnicas
• Técnica de RFLP: se utiliza como marcadores de localización
en el ADN genómico, para seguir la secuencia de ADN que
puedan determinar los sitios particulares, de una serie de
cuatro a ocho ácidos nucleicos, que son un sitio donde una
enzima de restricción de virus, para observar las diferencias
entre las cepas (Pavan W., n.d.).
• Crecimiento de colonias viruliferas de pulgones: para ser
infectadas se necesita una colonia específica que contenga
el virus de la tristeza para poder hacer un control óptimo
de que el vector está trasmitiendo la enfermedad.
• Analisis de PCR: es una técnica de laboratorio que permite
amplificar pequeños fragmentos de ADN para identificar
gérmenes microscópicos que causan enfermedades..
• SSCP: es un método de detección ampliamente utilizado que le permite identificar
diferentes variantes genómicas en un gran número de muestras y en una amplia
gama de organismos, desde microorganismos hasta humanos. El análisis SSCP
detecta variaciones de secuencia (mutaciones de un solo punto y otros cambios a
pequeña escala) a través de las diferencias de movilidad electroforética. El ADN
que contiene una secuencia de mutación (incluso un cambio de un solo par de
bases) tiene una diferencia de movilidad medible en comparación con el ADN de
tipo salvaje cuando se somete a condiciones no desnaturalizantes (o parcialmente
desnaturalizantes) (“Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Analysis -
EC,” n.d.).
• SISVAR: es un programa de análisis estadístico y planificación de experimentos
(Ferreira, 2011).
• Prueba Scott-Knott: es un algoritmo de agrupación jerárquica utilizado en la
aplicación de ANOVA, cuando el investigador está comparando los medios de
tratamiento, con una característica muy importante (Jelihovschi, Faria, & Allaman,
2014).
• Mètodo UPGMA: los arboles filogenéticos pueen estar basados en matrices de
distancias, obteniendo estas distancias entre pared de unidades operacionales
taxonómicas. Usando estas distancias se pueden aplicar clásicos procedimientos
de “agrupamientos” tratados por los métodos multivariatnes que nos entrega la
estadística.
 Resultados

• No se detectó Xylella fastidiosa en ninguna de las 20 muestras que se evaluaron mediante PCR. No
se observaron síntomas de psorosis, formación de venas, exocortis y xiloporosis en las respectivas
plantas indicadoras inoculadas con brotes de las 20 fuentes de CTV evaluadas
• Los perfiles obtenidos por análisis SSCP reveló la aparición de dos a ocho bandas en los geles. Estas
bandas sugirieron la presencia de uno a cuatro haplotipos en cada aislado de CTV. La composición o
el equilibrio de los aislamientos de CTV dentro del huésped pueden verse alterados por factores
tales como el cultivar, el medio ambiente y múltiples infecciones por pulgón.
• Los perfiles electroforéticos obtenidos de los cinco aislamientos fueron complejos. Se encontraron
de dos a cuatro mezclas de haplotipos. En medio de los cinco aislamientos listados, solo el aislante
Cruzeiro do Sul 1 (CS-1) no mostró alteraciones en el patrón SSCP. Sin embargo, otros aislamientos
se alteraron después de ser desafiados por el aislamiento severo por injerto o inoculación de
vectores.
• El control Pêra IAC ha sido reconocido como un complejo viral estable que tiene una alta capacidad
protectora, pero este complejo solo fue parcialmente estable en el presente experimento y sufrió
alteraciones en el patrón de la banda SSCP en dos plantas que fueron atacadas por el pulgón
marrón cítrico
• A través de la evaluación de los perfiles electroforéticos generados por el análisis SSCP, se puede
suponer que los aislamientos CS-1, ARA-1, ARA-2, ARA-3, ARA-4 y ARA-5 tienen buenas capacidades
de protección porque no sufren alteraciones en sus perfiles electroforéticos después de ser
desafiados con el severo aislamiento de Rolândia.
 Conclusiones

• La inoculación de la unión de tejidos muy probablemente permitirá la transmisión de todo el

complejo viral protector potencialmente leve a las plantas preinmunizadas. Sin embargo, puede
que este requiera un mayor periodo de tiempo entre la distribución y el equipo para el
establecimiento de os componentes del complejo viral en plantas inoculadas.
• Este hallazgo está de acuerdo con los resultados encontrados por Blansky et al. (2003), en el que se
transmitieron por un vector cepas graves que conformaban parte de un complejo viral leve. Los
resultados inversos fueron observados por Velázquez-Monreal et al. (2009).
• Al utilizar transmisiones únicas del áfido marrón de los cítricos como herramienta para la
separación, se encontró la presencia de haploides graves ocultos en aislamientos leves derivados de
Australia, Florida y Francia. Los perfiles genéticos de tres aislados de CTV de Florida se estudiaron
en tres especies huésped de cítricos. Los perfiles de estos aislamientos no se alteraron por la
transmisión del injerto.
• Se demostró que las diferencias encontradas en los patrones de SSCP podrían usarse para
monitorear la evolución de una población de virus en plantas que fueron preinoculadas con un
aislado suave y desafiado por una grave.
• Se concluyó que la preinmunización ofrece una protección satisfactoria de larga duración cuando
las plantas están expuestas a áfidos naturales o experimentales. Sin embargo, podría existir una
falla en la protección cuando las plantas sean por injerto.
 Bibliografía

• Bar-Joseph, M., Lee, R.F., (1990). Citrus tristeza virus. Description of Plant Viruses No. 353.
Commonwealth Mycological Institute/Association of Applied Biologists. Kew, Surrey, England. 7 p
• Ferreira, D. F. (2011). Sisvar: a computer statistical analysis system. Ciência e Agrotecnologia (Vol.
35). Editora UFLA. https://doi.org/10.1590/S1413-70542011000600001
• Jelihovschi, E., Faria, J. C., & Allaman, I. B. (2014). ScottKnott: A Package for Performing the Scott-
Knott Clustering Algorithm in R. TEMA (São Carlos), 15(1), 003.
https://doi.org/10.5540/tema.2014.015.01.0003
• Kimball, J. W. (2014). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Retrieved from
http://www.biology-pages.info/P/PCR.html
• Moreno, Pedro; Ambros, Silvia; Albiach-Martí, María R.; Guerri, Jose; Pena, L. (2008). Citrus tristeza
virus: a pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology, 9(2),
251–268. https://doi.org/10.1111/j.1364-3703.2007.00455.x
• Pavan W. (n.d.). Fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP). Retrieved from
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Fragmentos-de-restriccion-de-longitud-polimorfica
• Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Analysis - EC. (n.d.). ThermoFisher. Retrieved
from https://www.thermofisher.com/ec/en/home/life-science/sequencing/fragment-
analysis/single-strand-conformation-polymorphism-sscp.html
• Zanutto, C. A., Corazza, M. J., Nunes, W. M. de C., & Müller, G. W. (2013). Evaluation of the
protective capacity of new mild Citrus tristeza virus (CTV) isolates selected for a preimmunization
program. Scientia Agricola, 70(2), 116–124. https://doi.org/10.1590/S0103-90162013000200009